Das Ziel dieser Technik ist eine hoch angereicherte Kultur der primären Motoneurone (MNs) aus murinen Rückenmark vorzubereiten. Um die Folgen von Mutationen MN Krankheiten verursachen zu bewerten, beschreiben wir hier die Isolation dieser isolierten MNs und ihre Transfektion von Magnetofection.
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Methodenartikel
Charcot-Marie-Zahn Krankheit In Vitro Modellierung durch Transfecting Maus primären Motoneurone
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neurodegeneration der spinalen Motoneurone (MNs) ist verwickelt in einem großen Spektrum von neurologischen Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, Charcot-Marie-Zahn Krankheit und spinale Muskelatrophie, die Muskelatrophie zugeordnet sind. Primärkulturen von spinalen MNs haben verbreitet zu demonstrieren die Beteiligung bestimmter Gene in solchen Krankheiten und charakterisieren die zellulären folgen deren Mutationen. Dieses Protokoll Modelle eine primäre MN Kultur abgeleitet von der bahnbrechenden Arbeit von Henderson und Kollegen vor mehr als zwanzig Jahren. Zuerst zeigen wir eine Methode der sezieren die vorderen Hörner des Rückenmarks aus einem Maus-Embryo und MNs aus benachbarten Zellen mit einem Dichtegradienten zu isolieren. Dann präsentieren wir Ihnen eine neue Art des effizient transfecting MNs mit Ausdruck Plasmide mit Magnetofection. Schließlich zeigen wir, wie Sie zu beheben und Immunostain primäre zeigt MNs. mit Neurofilament-Mutationen, die Charcot-Marie-Tooth-Krankheit Typ 2 verursachen, dieses Protokoll einen qualitativen Ansatz, mit dem Ausdruck interessierender Proteine und studieren ihre Beteiligung an MN-Wachstum, Wartung und überleben.
Einleitung
Neuromuskuläre Erkrankungen umfassen eine Vielzahl von klinisch und genetisch unterschiedlichen Pathologien, die durch die Veränderung von Muskel und/oder des Nervensystems gekennzeichnet sind. Aufgrund der Fortschritte in Sequenziertechnologien, Hunderte von Genen, die für diese seltenen Erkrankungen wurden während des letzten Jahrzehnts (Liste an Neuromuscular Disease Center, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Die Vielfalt der identifizierten Mutationen bedeutet, dass verschiedene Mutationen in einem einzelnen Gen verschiedene Phänotypen und Krankheiten1,2,3 verurs....
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Protokoll
Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Ethikkommission der Institution akzeptiert.
1. Vorbereitung der Lösung
- Bereiten Sie 10 mL von 4 % BSA in L-15 Medium dialysiert.
- Rinderserumalbumin Pulver bei 4 % (w/V) in 10 mL des L-15 Mediums auflösen.
- Ergänzen Sie die Projektmappe, um eine 20 mL-Dialyse-Kassette mit einer 20 kDa Cutoff. Dialyse gegen 500 mL L-15 Medium für 3 Tage unter Unruhe bei 4 ° C. Verändern Sie das L-15 Medium jeden Tag.
- Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm Membran und Aliquot in 15 mL-Tuben. Speichern Sie die Rohre bei-20 ° C.
Hinweis: Dieses Protokoll verwendet die folgende....
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Ergebnisse
Nach 24 Stunden in der Kultur sollte Motoneurone (MNs) zeigen bereits erhebliches axonale Wachstum (mindestens 6 mal länger als die Soma-Größe). In den folgenden Tagen sollte Axone weiter wachsen und Verzweigung (Abbildung 2) angezeigt. Es werden unterschiedliche Morphologien durch Subtyp Besonderheiten. Zum Beispiel mittlere Spalte MNs, die axiale Muskeln innervieren haben kürzere und mehr verzweigten Axone als seitliche motor Spalte MNs, die Extremität Musk.......
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Diskussion
Die kritischen Punkte in diesem Protokoll gehört, dass die Maus-Embryonen bei einem genauen Zeitfenster während der Entwicklung (E12.5), die Höhe der MNs erhalten am Ende zu optimieren seziert werden. Darüber hinaus sollte für optimalen Ertrag der Dissektion am Morgen oder in den frühen Nachmittag durchgeführt werden. Vor E12.5 (z. B. bei E11.5) ist Dissektion schwierig, insbesondere im Hinblick auf die Beseitigung von der Hirnhaut. Nach E12.5 sinkt die Anzahl der erhaltenen MNs deutlich. Um den Embryostadium de.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir möchten danken, der "Association pour le Développement De La Neurogénétique" für Dr. Jacquier Fellowship und AFM-Telethon für seine Unterstützung durch MyoNeurAlp Strategieplan. Wir möchten auch danke Dr. Chris Henderson, Dr. William Camu, Dr. Brigitte Pettmann, Dr. Cedric Raoul und Dr. Georg Haase, die bei der Entwicklung und Verbesserung der Technik teilgenommen und ihr Wissen zu verbreiten.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Silikon-Sezierschale | Living systems Instrumentierung | DD-90-S-BLK-3PK | Sylgard |
| rundes Deckglas | NeuVitro, Knittelglas | GG-12-Pre | 12 mm |
| Slide a Lyzer Kassetten | ThermoFisher Scientific | 66030 | 20.000 MWCO ; 30 mL |
| Filtereinheit | Millipore | SCGVU02RE | |
| GP Sterile Spritzenvorsatzfilter | Millipore | SLGP033RS | |
| 4-Well-Platte | ThermoFisher Scientific | 167063 | Nunclon Delta behandelte |
| Plattenzange | FST von Dumont | 11252-20 | #5 Pinzettenschere |
| FST von Dumont | 14060-10 | Feinscherenskalpell | |
| FST von Dumont | 10035-20 | mit gebogener Klinge | |
| FST von Dumont | 10316-14 | Mikromesser-Skalpell | |
| Petrischale | Greiner | 663102 | & Schrägstrich; x h = 100 x 15 mm |
| 15 mL Polypropylen-Röhrchen | Falcon | 352096 | |
| Filterpapier | Watman | 1001125 | Kreis, Glaskammer-Objektträger mit 125 mm Durchmesser |
| Lab-Tek | 154526 | 4 Kammern | |
| Plasmid pCAGEN | Addgen | #11160 | |
| Name | Company | <>Katalognummer< | strong>Kommentare |
| <>Lösungen und Medien | |||
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| L-15 Medium | ThermoFisher Scientific | 11415056 | |
| L-15 Medium, kein rotes Phenol | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Conalbumin | Sigma-Aldrich | C7786 | |
| Natriumselenit | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Poly-DL-Ornithin | Sigma-Aldrich | P8638 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Trypsin 2,5%, 10x | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| PBS ohne Ca Mg | ThermoFisher Scientific | 14190144 | ohne Mg2+ Ca2+ |
| Natriumbicarbonat | ThermoFisher Scientific | 25080094 | |
| Neuron Zellkulturmedium | ThermoFisher | Scientific A3582901 | Neurobasal Plus Medium |
| HBSS | Sigma-Aldrich | H6648-500ML | |
| HEPES Puffer 1 M | ThermoFisher Scientific | 15630056 | |
| Medium mit Dichtegrad | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep |
| Ergänzungsmedium | ThermoFisher | Scientific A3582801 | B-27 Plus |
| Pferdeserum hitzeinaktiviert | ThermoFisher Scientific | 26050-088 | |
| L-Glutamin 200 mM | ThermoFisher Scientific | 25030024 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | 10.000 U/ml |
| Name | Company | Katalognummer< | strong>Kommentare |
| >Immuno Fluoreszenz | |||
| PBS, 10x | ThermoFisher Scientific | X0515 | ohne Mg2+ Ca2+ |
| Paraformaldehyd (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| normales Ziegenserum | Sigma-Aldrich | G6767 | |
| Glycin Sigma-Aldrich | G7126 | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Cholin-Acetyltransferase (CHAT) | Chemicon | Ab144P | |
| Neurofilament H nicht phosphoryliert (SMI32) | Biolegenden | SMI-32P | IF bei 1/1000 |
| Islet-1 | DSHB | 40.2D6 | |
| Islet-2 | DSHB | 39.4D5 | |
| Hb9 | DSHB | 81.5C10 | |
| Vectashield Eindeckmedium | Vector Lab | H-1000 | |
| Beta3 Tubulin (Tuj1 Klon) | Biolegends | 801201 | IF bei 1/1000 |
| Lc3b | Cell Signaling Technology | #2775 | IF bei 1/200 |
Referenzen
- Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
- Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010). ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
