Methodenartikel

Die Nutzung von Maus Splenocyten, Pathogen-assoziierte molekulare Muster Einfluss auf die Genexpression Uhr abzuschätzen

DOI:

10.3791/58022

⸱

24. Juli 2018

1Department of Biology, University of Hartford

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, mit der Maus splenocyten, um Pathogen-assoziierte molekulare Muster zu entdecken, die molekulare Uhr Genexpression verändern.

Zusammenfassung

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Vom Verhalten, Genexpression regulieren ZIRKADIANE Rhythmen fast alle Aspekte der Physiologie. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Maus splenocyten mit der Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) Lipopolysaccharid (LPS), ODN1826 und Hitze getötet Listeria Monocytogenes hinterfragen und prüfen ihre Wirkung auf die molekularen zirkadianen Uhr. Bisher haben Studien untersuchen den Einfluss von LPS auf der molekularen Uhr mit einer Vielzahl von in Vivo und ex Vivo Ansätze aus einem Sortiment von Modellen (z. B. Maus, Ratte und Mensch) fokussiert. Dieses Protokoll beschreibt die Isolation und die Herausforderung des splenocyten sowie die Methodik zur Uhr Gen Ausdruck nach Herausforderung über quantitative PCR zu beurteilen. Dieser Ansatz lässt sich nicht nur der Einfluss der mikrobielle Komponenten auf der molekularen Uhr aber auch andere Moleküle zu bewerten, die Ausdruck der Uhr ändern kann. Dieser Ansatz könnte genutzt werden, um die molekularen Mechanismen wie PAMP-Toll-Like-Rezeptor-Interaktion beeinflusst Uhr Ausdruck auseinander zu necken.

Einleitung

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Der master-Clock bei Säugetieren, der 24 h Schwingungen für fast alle Aspekte der Physiologie und Verhalten orchestriert, liegt in den suprachiasmatischen Kern (SCN) des Hypothalamus1,2. Neben der Regulierung der biologischen Prozesse auf organismal Ebene, synchronisiert der master-Clock auch periphere zelluläre Uhren im gesamten Körper3,4,5. Während der molekularen Uhr Maschinen aus mindestens drei ineinandergreifenden transkriptionelle translationale Feedback-Schleifen besteht, besteht der Kern der Periode (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, und Uhr Gene6,7. Neben der Pflege des genaue Timing der molekularen Uhr Kern, einige ergänzende Uhr Genprodukte (z. B. Rev-Erbα und Dbp) regulieren auch Ausdruck des nicht-uhrengene, d. h. Uhr kontrollierten Gene (KVG)6 , 7.

Funktionelle Molekulare Uhren wurden in verschiedenen immun Gewebe (z. B. Milz und Lymphknoten)8 und Zellen (z. B. B Zellen, Dendritische Zellen, Makrophagen)8,9beschrieben. Diese Zellen erkennen und reagieren auf Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs), konservierte mikrobielle Komponenten über angeborene immune Anerkennung Rezeptoren wie Toll-Like-Rezeptoren (TLR)10. Bisher wurden 13 funktionale TLRs beschrieben, erkennen die mikrobielle Bestandteile wie bakterielle Zellwand-Komponenten, flagellar Protein und mikrobielle Nukleinsäuren10. PAMP, Lipopolysaccharid (LPS), eine Zellwand-Komponente von Gram-negativen Bakterien erkannt von TLR4, nachweislich zirkadianen Rhythmen auf organismal und molekularer Ebene zu verändern. Z. B. in Vivo Herausforderung der LPS induzierte photic-ähnliche Phase Verzögerungen Aktivität in Mäusen11 gemessen und führte zu reduzierten Uhr gen-Expression in der SCN und Leber in Situ Hybridisierung und quantitative PCR bestimmt, bzw. in Ratten12. Nach einer in-Vivo -Herausforderung mit LPS ergab die Analyse der menschlichen peripheren Blut Leukozyten13 und subkutanem Fettgewebe14 veränderte Expression von mehreren uhrengene gemessen über qPCR. Zu guter Letzt geändert ex Vivo LPS Herausforderungen des menschlichen Makrophagen und Maus peritonealen Makrophagen, führte auch zu Uhr Ausdruck qPCR14gemessen.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um den Einfluss der PAMPs LPS, ODN1826 (synthetische Oligonukleotide mit unmethylated CpG Motive), zu bewerten und Hitze getötet Listeria Monocytogenes (HKLM), anerkannt von TLR4, TLR9 und TLR2, bzw. auf Molekulare Uhr Genexpression in Maus splenocyten. Das Protokoll enthält Maus Splenektomie, Splenocyte Isolierung und Herausforderung, RNA Extraktion, cDNA Synthese und qPCR Ausdruck mehrere uhrengene bewerten. Dieses Protokoll ermöglicht für den rechtzeitigen Erwerb einer großen Anzahl von Immunzellen mit sehr kleinen Tier oder zellulären Manipulation, die dann ex Vivo mit verschiedenen PAMPs in Frage gestellt. Die molekulare Uhr hat gezeigt, dass verschiedene Aspekte der Immunantwort8,15,16modulieren, Störung der molekularen Uhr beeinträchtigt daher höchstwahrscheinlich die richtige zeitabhängige Variation von der Immunantwort. Darüber hinaus da Störungen des zirkadianen Rhythmen zu schweren Pathologien17,18,19,20führen können, kann es von Interesse für Forscher, splenocyten mit einer breiten Palette von Herausforderung sein Moleküle und deren Einfluss auf die Uhr zu beurteilen.

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Protokoll

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Während der Studie Tierpflege und Behandlung National Institutes of Health Policy eingehalten, wurden in Übereinstimmung mit Richtlinien und wurden von der University of Hartford institutionelle Animal Tierpflege und Use Committee genehmigt.

(1) die Mitnahme von Tieren

Hinweis: Zwanzig Wochen alten männlichen B6129SF2/J Mäusen werden in der Studie verwendet.

  1. Mitzureißen Mäuse auf ein 12 h Licht (standard Overhead weißes Licht) / 12 h Dunkel-Zyklus für 2 Wochen vor dem Experiment.
    Hinweis: Hier Zeitgeber Zeit (ZT) 0 entspricht, leuchtet und ZT12 Licht aus, unter Beibehaltung aller anderen Umweltfaktoren (z.B. Nahrungsmittel, Wasser und Raumtemperatur) konstant 21.

2. Vorbereitung der Instrumente, Kultur, und Herausforderung Medium

  1. Autoklaven-Zange und sezierenden Scheren. Wickeln Sie Paare von satiniertem Objektträger in Aluminiumfolie und Autoklaven.
  2. Bereiten Sie Kulturmedium durch Zugabe von fetalen bovine Serum (FBS), RPMI 1640, eine Endkonzentration von 10 %. Vorbereitung 10 mL Medium Herausforderung in 50 mL Röhrchen durch Hinzufügen der folgenden PAMPs zu dem Kulturmedium (RPMI mit 10 % FBS); LPS (5 µg/mL), ODN1826 (5 µg/mL), Hitze-getötet Listeria Monocytogenes (108 HKLM/mL), oder ein anderes PAMP in der empfohlenen Konzentration.
  3. Kultur und Herausforderung Medium auf 37 ° C im Wasserbad erwärmen und etwa 70 mL sterile Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,2) bei Zimmertemperatur aufbewahren.
  4. Hinzugeben Sie 10 mL Kulturmedium mit 10 mL-Pipette und Pipette Hilfen für eine 50 mL-Tube und Platz auf dem Eis.
  5. Fügen Sie etwa 30 mL 70 % igem Ethanol zu einem 100 mL Becherglas und Ort endet sezieren Scheren und Pinzetten in das Becherglas, mikrobielle Kontamination zu verhindern.
  6. Bereiten Sie Lyse Puffer RNA Isolierung durch Zugabe von 10 µL β-Mercaptoethanol (unter einem Abzug vor) zu jeder 1 mL Puffer RLT in ein 50 mL-Tube. Machen Sie nur die Menge, die benötigten (600 µL pro Probe) werden ca. 1 x 106 Zellen bestehend.
    Hinweis: Der Puffer RLT ist ein Bestandteil der RNA-Extraktion-Kit, das die Bindung der RNA der Kieselsäure Membran unterstützt.

3. Splenocyte Isolation und Herausforderung

  1. Einschläfern Sie Mäuse zu einem bestimmten Zeitgeber Zeitpunkt über Narkose halten sie in ihrem ursprünglichen Käfig und den Käfig mit einer Durchflussrate von 3 L/min. weiter liefert CO2 für 1 min nach Atmung stoppt CO2 hinzufügen.
  2. Tod durch zervikale Dislokation zu bestätigen, indem Sie Daumen und Zeigefinger auf beiden Seiten des Halses an der Basis des Schädels. Oder drücken Sie einer Rute an der Basis des Schädels und schnell ziehen (mit der anderen Hand) die Basis für das Heck oder der hinteren Gliedmaßen, Trennung der Halswirbel vom Schädel22zu verursachen.
  3. Sprühen Sie den Maus-Stamm mit 70 % Ethanol und mit einem Papiertuch abwischen. Platzieren Sie den Mauszeiger auf seinen Rücken und schräg auf der rechten Seite. Schneiden Sie das Fell, Schere mit sezieren, entlang der Maus links über auf halbem Weg zwischen der Vorder- und Hinterbeine.
  4. Mit Pinzette, schnappen Sie sich das Bauchfell und einen Einschnitt nicht zu beschädigen die Milz aufmerksam machen. Milz mit einer Pinzette entfernen und in eine sterile 50 mL Röhrchen mit etwa 10 mL der Nährmedien auf Eis legen. Wiederholen Sie für die restlichen Tiere.
    Hinweis: Die Milz ist die Farbe der Kidney-Bohnen, und er ist länger und flacher als der Niere.
  5. Übertragen Sie eine Milz mit 2 mL Kulturmedium auf eine kleine sterile Petrischale.
    1. Die Milz durch Schleifen zwischen den mattierten Teil zwei sterile mattierte Folien zu homogenisieren. Halten Sie wenn möglich die Ausgabe und die Zellen im Medium bei der Homogenisierung.
    2. Einmal gründlich homogenisiert, pipettieren der 2 mL Kulturmedium mit der splenocyten durch ein 40 µm Nylon Zelle Sieb in ein 50 mL-Tube.
    3. Wiederholen Sie die obigen Schritte für die verbleibenden Milz mit neuen Paare mattierte Folien, 50 mL Röhrchen mit Nährmedium und Zelle Siebe.
  6. Hinzugeben Sie 8 mL kalte Kulturmedium zu jedem der 50 mL Röhrchen mit splenocyten für ein Gesamtvolumen von 10 mL/Tube. Bestimmen Sie die Anzahl der Zellen pro Milliliter mit einem Hemocytometer.
  7. Fügen Sie hinzu, ca. 1 x 106 Zellen/Well Kultur 6-Well-Platten. Anzahl der Bohrungen, die entsprechen der Anzahl der verschiedenen PAMPs für das Experiment verwendet wird und ein Steuerelement fügen Sie auch Zellen hinzu. Fügen Sie 3 mL Kulturmedium oder 3 mL Herausforderung Medium in die jeweiligen Vertiefungen.
  8. Inkubieren Sie die Platten bei 37 ° C in 5 % CO2 für 3 h.
  9. Kratzen Sie die Zellen aus der Tiefe der nun mit einer 1.000 µL pipettieren Tipp mit einer Mikropipette P1000 verbunden. Die Zellen mit der gleichen 1.000 µL pipettieren Spitze, eine 15 mL Tube-haltigem Medium zu übertragen.
  10. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 167 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Den überstand zu entfernen und Waschen der Zelle Pellet mit 5 mL PBS.
  11. Pellet-Zellen ein zweites Mal bei 167 X g für 5 min, überstand zu entfernen und die Zelle Pellet 600 µL Lyse Puffer hinzufügen, um die Zellen lysiert. Fahren Sie dann mit RNA isoliert.

(4) RNA Isolation und cDNA Synthese

  1. RNA von splenocyten mit dem RNA-Extraktion-Kit nach Herstellerangaben zu isolieren und die "optionale" auf Spalte DNA Verdauung führen.
  2. Bestimmen Sie vor cDNA Synthese RNA-Konzentration mit einer Microvolume Spektralphotometer, stellen Sie sicher, dass die Konzentration im optimalen Bereich der RNA (bis zu 2 µg) die cDNA-Synthese-Kit.
  3. Synthese cDNA für jede der Proben mit der reversen Transkription-Kit nach Herstellerangaben. Verwenden Sie 10 µL RNA für jede der Proben in eine gesamte Reaktionsvolumen von 20 µL. Fügen Sie am Ende der reversen Transkription (Thermocycler laufen) 20 μL H2O, jede Reaktion.
  4. Der standard geschwungenen mit P10 und P20 Mikropipette mRNA von ein paar Kontrollproben (z. B. 5 µL aus 2 Proben für eine Gesamtmenge von 10 µL) in ein 0,5 mL Röhrchen zur Vorbereitung der cDNA Pool zu bauen.
    1. Fügen Sie 10 µL 2 x Reverse-Transkriptase-master-Mix.
    2. Fügen Sie bei der Fertigstellung der reversen Transkription 10 µL H2O das Reaktionsgefäß hinzu, dienen als Ausgangspunkt Konzentration ("1") wird in der Verdünnungsreihe für die Standardkurve.
    3. Führen Sie ein 10-divisibel Verdünnungsreihe (1 bis 10-4) durch Zugabe von Wasser mittels einer Mikropipette P100 oder P200 in vier 0,5 mL Röhrchen benannt 10-410-1, 10-2und 10-345 µL.
      1. Fügen Sie 5 µL der Ausgangspunkt Konzentration "1" in das erste Rohr (10-1) mit einem P20 Micropipettor, Mix von oben und unten pipettieren mehrmals, dann Transfer 5 µL aus der 10-1 Tube in die Röhre bezeichnet, 10-2 und Mix.
      2. 5 µL mit einer Mikropipette P20 aus der Tube 10-2 in die Röhre bezeichnet 10-3 zu übertragen und zu mischen. 5 µL mit einem P20 Micropipettor aus der Tube 10-3 in das Rohr benannt 10-4 zu übertragen und zu mischen.

5. Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)

  1. Bestimmen Sie relative Quantifizierung der mRNA-Niveaus durch qPCR. Innerhalb der experimentellen einzurichten, wählen Sie "Quantifizierung – Relative Standardkurve" und "TaqMan" Chemie. Änderung das Reaktionsvolumen zu 10 µL. Geben Sie die relevante Informationen in das Platte-Layout (z.B.Zielgen Standardkurve, Reporter, usw.).
  2. Die Reaktion so aufzubereiten, dass es 0,5 µL den Primer/Sonden-Assay, 5 µL der Gen-Expression-master-Mix, H2O 2 µL und 2.5 enthält µL cDNA (10 – 100 ng).
    1. Bereiten Sie einen master-Mix durch Multiplikation aller vorhergehenden Reagenzien (mit Ausnahme der cDNA) durch die Anzahl der Reaktionen, achten Sie darauf, gehören diejenigen von der Standardkurve Negativkontrollen, Durchführung jeder Reaktion in Duplikat und 2 zusätzliche Reaktionen, die berücksichtigt werden pipettieren Variation.
    2. Pipettieren 7,5 µL bereit master-Mix in vorgegebenen Vertiefungen in einer Reaktion der 96-Well-Platte mit einer Mikropipette oder einer Mehrkanal-Pipette. Pipettieren 2,5 µL cDNA in den entsprechenden Brunnen für die unbekannten und Standards und 2,5 µL von H2O in die negativ-Kontrolle-Brunnen.
    3. Beinhalten Sie Primer/Sonden-Assays für die verschiedenen molekularen uhrengene und auch einen Test für eine endogene Steuerung (z. B. β-Aktin).
  3. Um relative Ausdruckswerte zu ermitteln, berechnen Sie die mittlere relative Menge für jede Wiederholung, dann für jede Probe, teilen Sie die mittlere relative Menge für das jeweilige Zielgen durch die mittlere relative Menge für β-Aktin.

6. statistische Analyse

  1. Statistische Analyse-Software verwenden, geben Sie Daten in das Programm unter der Spalte Statistik-Option. Wählen Sie eine einfache ANOVA mit der Dunnett post-hoc-Test zur Bewertung der Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Uhr Genexpression nach PAMP Herausforderung gegenüber der Kontrolle.

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Ergebnisse

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Mäuse wurden geopfert, bei ZT13, splenocyten wurden isoliert und ex Vivo mit den PAMPs LPS, ODN1826 oder HKLM in Frage gestellt. Nach 3 h RNA wurde isoliert und qPCR wurde verwendet, um relative Ausdruck Niveaus der molekularen uhrengene zu beurteilen, die Uhr, Per2, Dbp, und Rev-Erbα im Vergleich zu unangefochten Kontrollzellen. Nach PAMP Herausforderung waren Uhr Ausdruck Niveaus nicht wesentlich anders als Ausdruck in der Kontrollze...

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Diskussion

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Innerhalb dieses Protokolls kann ein Microvolume Spektralphotometer zur Quantifizierung und Beurteilung der Reinheit der verwendeten bei der Bestimmung der Genexpression RNA verwendet werden. Nukleinsäuren absorbieren UV-Licht bei 260 nm, Proteine in der Regel absorbieren Licht bei 280 nm, während andere potentielle Schadstoffe verwendet, während ein RNA-Extraktionsverfahren (z. B. Phenol) nachweisbar bei 230 sind nm. Daher, durch die Beurteilung der Extinktion (A) Verhältnis bei 260/280 nm (RNA zum Protein) und...

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Offenlegungen

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Der Autor hat nichts preisgeben.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Fakultät Forschung aus der College of Arts and Sciences Dean Büro an der University of Hartford gewährt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Frosted SlidesFisher12-550-343
ZellsiebeFisher22363547
Lipopolysaccharid InvivoGenltrl-eklps
ODN1826InvivoGenTlrl-1826-1
HKLMInvivoGenTlrl-hklm
RPMI 1640Gibco11875-093
PBSGibco20012-043
RNeasy Mini KitQiagen74104 oder 74106
RNase-Free DNase SetQiagen79254
6-Well-ZellkulturplatteDenvilleT1006
50-ml-RöhrchenCorning352070
15-ml-RöhrchenCorning352097
ThermoFisher4368814
TaqMan Genexpressions-Assays b-AktinThermoFisherMm00607939_s1
TaqMan Genexpressionsassays Per2ThermoFisherMm00478113_m1
TaqMan Genexpressionsassays Rev-erbaThermoFisherMm00520708_m1
TaqMan Genexpressionsassays Bmal1ThermoFisherMm00500226_m1
TaqMan Genexpressionsassays DbpThermoFisherMm00497539_m1
qPCR-Gerät StepOnePlusThermoFisher
TaqMan Genexpression Master MixThermoFisher4369016
MicroAmp Schnelle 96-Well-Reaktionsplatte (0,1 mL)ThermoFisher4346907
Statistische AnalysesoftwarePrism 7.0a
cDNA-Reverse-Transkriptionskit mit hoher Kapazität

Referenzen

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Isolierung von SplenozytenPAMP Challengequantitative PCRMilz von M usenRNA Extraktionreverse TranskriptionZellz hlung mit H mozytometerLPS ODN1826circadianer Rhythmus

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