Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems in vivo zu untersuchen. Wir beschreiben Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven unter Normalbedingungen Aufzucht oder nach Verletzungen.
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Methodenartikel
Funktionsauswertung olfaktorische Wege im Leben Xenopus Kaulquappen
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Xenopus Kaulquappen bieten eine einzigartige Plattform, um die Funktion des Nervensystems zu untersuchen. Sie bieten mehrere experimentelle Vorteile, wie z. B. Zugriff auf zahlreiche bildgebende Ansätze, elektrophysiologische Techniken und Verhaltens-Assays. Das Xenopus Kaulquappe olfaktorische System eignet sich besonders gut zu untersuchen, die Funktion der Synapsen gegründet während der normalen Entwicklung oder nach einer Verletzung reformiert. Hier beschreiben wir Methoden zur Bewertung der Verarbeitung der Geruchsinformation im Wohnzimmer Xenopus Larven. Wir skizzieren eine Kombination aus in-vivo Messungen der präsynaptischen Kalzium Antworten in Glomeruli den Riechkolben mit olfaktorischen geführte Verhalten Assays. Methoden können mit der Durchtrennung der Geruchsnerven, studieren die Neuverkabelung der synaptischen Konnektivität kombiniert werden. Experimente werden vorgestellt mit Wildtyp und gentechnisch veränderte Tiere mit dem Ausdruck GFP-Reporter in den Zellen des zentralen Nervensystems. Anwendung der Ansätze beschrieben, gentechnisch veränderten Kaulquappen ist nützlich für die Entschlüsselung der molekularen Grundlagen, die vertebrate Verhalten definieren.
Einleitung
Xenopus Kaulquappen bilden ein ausgezeichnetes Tiermodell um die normale Funktion des Nervensystems zu studieren. Transparenz, ein vollständig sequenzierte Genom1,2und Zugänglichkeit zu chirurgischen, elektrophysiologische und bildgebende Techniken sind einzigartige Eigenschaften des Xenopus -Larven, die es ermöglichen, Untersuchung neuronale Funktionen in-vivo3 . Einige der mehrere experimentelle Möglichkeiten dieses Tiermodell werden durch gründliche Studien am Kaulquappe sensorischen und motorischen Systeme4,5
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Protokoll
Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der Tierforschung an Universität von Barcelona genehmigt.
Hinweis: X. tropicalis und laevis Kaulquappen werden nach Standardmethoden13,14aufgezogen. Kaulquappe Wasser wird vorbereitet, indem man kommerzielle Salze (siehe Tabelle der Materialien) zu Wasser durch Umkehrosmose gewonnen. Leitfähigkeit wird ∼700 µS und ∼1, 400 µS für X. tropicalis und laevis Kaulquappen, bzw. angepasst. Larven können entweder durch natürliche Paarung oder Befruchtung14
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Ergebnisse
In diesem Beitrag präsentieren wir eine Kombination aus zwei komplementäre Ansätze in Vivo Studie über die Funktionalität des Xenopus Kaulquappe olfaktorischen Systems ausführen: ich) ein Verfahren zur Bildgebung präsynaptischen Ca2 + ändert in den Glomeruli des Lebens Kaulquappen mit einem fluoreszierenden Kalzium Indikator und Ii) geführte ein Geruch Verhaltens Assay, die verwendet werden, um die Reaktion auf bestimmte wasserbasierte Geruchsstoffe zu untersu.......
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Diskussion
Dieses Papier beschreibt Techniken, die sinnvoll, die Funktionalität der olfaktorische Wege im Leben zu untersuchen sind Xenopus Kaulquappen. Das aktuelle Protokoll eignet sich besonders für die Laboratorien, die funktionieren, oder haben Zugang zu Xenopus; Allerdings ist es auch interessant für jene Forscher studieren die zellulären und molekularen Grundlagen der neuronale Regeneration und Reparatur. Ergebnisse im Xenopus kombinierbar mit Daten aus anderen vertebrate Modelle, konservierte Mech.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus El Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) mitfinanziert von European Regional Development Fonds (EFRE), durch wettbewerbsfähige Forschungspreise aus der M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, Stephen W. Kuffler Stipendium Fonds, Laura und Arthur Colwin ausgestattet Sommer Research Fellowship Fund , das Fischbach Fellowship und der große Generation Fund der Marine Biological Laboratory und der nationalen Xenopus Ressource RRID:SCR_013731 (Woods Hole, Massachusetts) wo ein Teil dieser Arbeit wurde durchgeführt. Wir danken auch CERCA Programm / Generalitat de Catalunya für institutionelle Unters....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Salze für Aquarien (Instant Ocean Salt) | Tecniplast | XPSIO25R | |
| Tricain (Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonat) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Pinzette #5 (Spitze 0,025 x 0,005 mm) | World Precision Instruments | 501985 | |
| Vannas Schere (Spitze 0,015 x 0,015) | World Precision Instruments | 501778 | |
| Whatman qualitatives Filterpapier | Fisher Scientific | WH3030917 | |
| X. laevis tubb2-GFP | National Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731 | NXR_0.0035 | |
| X.tropicalis NBT-GFP | European Xenopus Resource Center (EXRC) RRID:SCR_007164 | ||
| CellTracker CM-DiI | ThermoFisher Scientific | C-7001 | |
| Calciumgrünes Dextran, Kaliumsalz, 10.000 MW, anionisch | ThermoFisher Scientific | C-3713 | |
| Borosilikatkapillaren für Mikroinjektion | Sutter Instrument | B100-75-10 | AD = 1,0 mm, ID = 0,75 mm. |
| Abzieher | Sutter Instrument | P-97 | |
| Mikroinjektor | Parker | Instruments Picospritzer III | |
| Sylgard-184 | Sigma-Aldrich | 761028-5EA | |
| Microfil Mikropipetten | World Precision Instruments | MF28G-5 | |
| Aufrechtes Mikroskop | Zeiss | AxioImager-A1 | |
| Master-8 Stimulator | A.M.P.I. | ||
| CCD-Kamera | Hamamatsu | Image EM | |
| Magnetventile | Warner Instruments | VC-6 Sechs-Kanal-System | |
| Dow Corning Hochvakuumfett | VWR Scientific | 636082B | |
| Tubocurarinhydrochlorid | Sigma-Aldrich | T2379 | |
| CCD-Kamera | Zeiss | MRC-5 Kamera | gesteuert von Zen Software |
| Kameraobjektiv | Thorlabs | MVL8ML3 | Es gibt mehrere Möglichkeiten, die an das verwendete Kameramodell angepasst werden sollten |
| Epoxidharz | RS Components | ||
| Verteiler | Warner | Instruments MP-6 Perfusionsverteiler Mikromanipulator | |
| für die lokale Bereitstellung von Lösungen | Narishige | MN-153 | |
| Mini-Magnetklemmen | Warner Instruments | MAG-7, MAG-6 | |
| Polyethylen-Schlauch | Warner Instruments | 64-0755 | Außendurchmesser = 1,57 mm, Innendurchmesser = 1,14 mm. |
Referenzen
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Zhang, L. I., Tao, H. ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
