Kennzeichnenden Microbiome Dynamik – Durchflusszytometrie basierten Workflows von Reinkulturen zu natürlichen Gemeinschaften

Summary

Durchflusszytometrischen Analyse hat für die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik bewährt. Wir präsentieren jeweils drei umfassende Arbeitsabläufe, von der Probenahme zur Datenanalyse, Reinkulturen und komplexen Gemeinschaften in klare Medium ebenso wie anspruchsvolle Matrizen.

Abstract

Die Untersuchung von Reinkulturen und Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik ist von entscheidender Bedeutung zu verstehen und zu kontrollieren, natürliche Ökosysteme und technische Anwendungen, Gefahren durch Mikroorganismen. Nächste Generation sequenziermethoden werden weithin genutzt, um mikrobiome zu lösen, aber sie sind in der Regel Ressourcen- und zeitintensiv und vor allem qualitative Informationen zu liefern. Microbiome durchflusszytometrischen Analyse leidet nicht die Nachteile und können relative Untergemeinschaft Häufigkeiten und absoluten Zelle Zahlen auf Linie. Obwohl es keine direkte phylogenetische Information liefert, kann es die auswertetiefe und Auflösung der Sequenzierung Ansätze verbessern. Im Gegensatz zu medizinischen Anwendungen in Forschung und Routine-Einstellungen ist Durchflusszytometrie für Microbiome Analyse noch nicht weit verbreitet. Fehlende Angaben zu Probe-Vorbereitung und Daten-Analyse-Pipelines kann eine Eintrittsbarriere für die Forscher Herausforderungen Microbiome Analyse, die oft Lehrbuch Flow-zytometrie-Anwendungen erstellen. Hier präsentieren wir drei umfangreiche Workflows für Reinkulturen, komplexen Gemeinschaften in Mittel- und komplexen Gemeinschaften in herausfordernden Matrizen bzw. klar. Wir beschreiben einzelne Verfahren, Probenahme und Fixierung und Färbung Protokolle für das jeweilige Sample-Sets optimiert. Wir erarbeiten der durchflusszytometrischen Analyse mit einem komplexen Forschung zentriert und eine Anwendung fokussierte Bank Top-Gerät, beschreiben die Zelle Sortieren Verfahren und Daten-Analyse-Pakete empfehlen. Wir zudem wichtige experimentelle Kontrollen vorschlagen und gelten die dargestellten Abläufe für die jeweiligen Sample-Sets.

Introduction

Mikroorganismen spielen eine entscheidende Rolle in vielen Aspekten der menschlichen Leben. Sie sind die biotischen Haupttreiber des Planeten Kohlenstoff, Stickstoff, Phosphor und Schwefel Zyklen¹und fungieren als erniedrigende^2,3 , sowie die Synthese⁴ Biokatalysatoren in verschiedenen Branchen, wie z. B. Abwasserbehandlung ⁵ oder Biotechnologie⁶. Sie bilden auch die menschlichen Mikrobiom, die menschliche Gesundheit und Stoffwechsel^7,8direkt beeinflusst. Daher sind die Informationen auf Struktur, Funktion und dynamisches Verhalten von Mikroorganismen, in Beantwortung ihrer unmittelbaren Umgebung notwendig, wenn unser Ziel ist es zu verstehen und diese Systeme zu manipulieren. Nächste Generation sequencing (NGS) ist die bewährte Technologie zur Lösung von Microbiome Struktur und Funktion⁹. Die Analyse und Bewertung der NGS-Daten können nicht nachgeben quantitativen Informationen und ist immer noch teuer, zeitaufwendig und keineswegs bereit, vor-Ort-Ergebnisse in Leistung Gängen. Einige Bakterien zeigen Generationszeiten unter 1 h und ständig wechselnden Gemeinschaftsstrukturen in bestimmten Umgebungen¹⁰Ursache. Im Anschluss an solche Dynamik würde durch Sequenzierung Ansätze das Finanz- und Belegschaft der meisten wissenschaftlichen Labors überschreiten.

Im Gegensatz dazu kann Durchflusszytometrie Gemeinschaft ähnlich NGS Daten, Fingerabdrücken unter Beibehaltung einer höheren Zeit, Arbeit und Kosten-Effizienz. Hier präsentieren wir Ihnen fließen durchflusszytometrischen Techniken mikrobiellen Gemeinschaft Dynamik auf der Linie auf der Ebene der einzelnen Zelle zu verfolgen. Im Gegensatz zu NGS Durchflusszytometrie liefert keine phylogenetische Zugehörigkeit oder Informationen auf funktionelle Gene, sondern liefert quantitative Zellzahlen. Mit Durchflusszytometrie, können mikrobielle Gemeinschaften in Untergemeinschaften mit unterschiedliche Lichtstreuung und Fluoreszenzeigenschaften (forward Scatter (FSC) und Side Scatter (SSC) liefern Hinweise der Zellengröße und Granularität, beziehungsweise) gelöst werden. Der vorgestellte Ansatz nutzt überwiegend Zelle Größe - und DNA belaufen sich Informationen, die auf bestimmte Zelltypen und physiologischen (Wachstum) Staaten verbunden sind. Der DNA-Gehalt wird quantifiziert mit UV-erregbare 4', 6-Diamidino-2'-Phenylindole (DAPI) Farbstoff, der bindet an A-T reichen Regionen der DNA und kann sogar chromosomalen unterschiedlichem lösen. Durch die Kombination von DAPI Fluoreszenz und FSC können mehr als 50 Untergemeinschaften unterschieden und für die Umstellung Zeit¹¹Häufigkeiten überwacht werden. Die Untergemeinschaft Fülle Variationen können mit Veränderungen in der Mikro-Umwelt Umgebung, wie z. B. pH-Wert und Produkt-Titer¹², mit globalen Parameter, wie z. B. das Wetter^13,14, oder im Falle von Darm oder Speichel korreliert werden mikrobiome mit bestimmten medizinischen Behandlungen¹⁵. Diese Korrelationen zeigen wichtige Untergemeinschaften verantwortlich für bestimmte Funktionen in den metabolischen Netzwerkes der ganzen Gemeinde. Die wichtigsten Untergemeinschaften können dann werden speziell gefördert oder unterdrückt durch die Veränderung der Mikro-Umfeld oder sortiert für anschließende Sequenzierung¹⁵ oder Proteomic Untersuchung¹⁶.

Allerdings ist mikrobiellen Gemeinschaft Durchflusszytometrie nicht noch weit aufgrund der eher niedrigen Anzahl Fluss durchflusszytometrischen Geräte ordnungsgemäß auflösen von mikrobiellen Populationen oder Gemeinschaften gegründet. Darüber hinaus kann der Mangel an Erfahrung, Gemeinschaft Analyse Rohrleitungen und effektive Datenauswertung eine Eintrittsbarriere für Forscher Microbiome Analyse Herausforderungen darstellen. Wir haben umfangreiche Workflows zur Lösung dieser Probleme festgestellt. Um ihre allgemeine Anwendbarkeit zu veranschaulichen, präsentieren wir ihnen auf drei beispielhafte Sample-Sets (ergänzende Datei 1-S1), nämlich ich) eine Reinkultur (PC) für biotechnologische Anwendungen in definierten klar Medium (Pseudomonas Putida KT 2440 auf angebaut (Glukose), Ii) eine komplexe Lab-Gemeinschaft in klare Medium (Belebtschlamm Gemeinschaft (ASC) im synthetischen Abwasser) und Iii) eine komplexe Community von Naturlandschaften in einer dichten Matrix (Biogas-Community (BC) in Maissilage).

Mehrere Faktoren beeinflussen die Protokoll-Wahl für jeden der diese Sample-Sets. Tieffrieren verzichtet auf den Einsatz von giftigen Chemikalien, sondern beschränkt sich meist auf Lab-Umgebungen durch die Verwendung von flüssigem Stickstoff für Schock Zuckerguss. Die Formaldehyd-Stabilisierung und anschließende Ethanol Fixierung ermöglicht Bulk Sampling ohne die Notwendigkeit einer aliquoten Vorbereitung und erweist sich über lange Zeiträume stabil sein. Jedoch möglicherweise Protein-reiche Proben wie menschlichem Speichel¹⁵ problematisch, da Protein Flocken, denaturiert durch Formaldehyd, ungünstigen Signal-Rausch-Verhältnis führen können. Die probentrocknung dauert die meiste Zeit (ca. 1 h insgesamt) der Verfahren in diesem Vergleich, aber auf der Baustelle ohne giftige Chemikalien durchgeführt werden kann. Es liefert stabile Pellets in Rohren, die ohne Kühlung oder zusätzliche Gefahr Vorsichtsmaßnahmen problemlos versendet werden können. Darüber hinaus wurden viele alternative Fixierung Methoden vorgeschlagenen¹¹. Wir empfehlen dringend, um die Auflösung und Fixierung Stabilität verschiedener Protokolle zu testen, bei der Einführung eines neuen Muster-Set.

Wir zwei verschiedene fließen Cytometers verwendet, um die Sätze zu analysieren: (i) eine sehr aufwendige und teure, Forschung zentriert Zelle Sorter und (Ii) eine Anwendung konzentriert Top Bank Analyzer, die für vor-Ort-Anwendung⁵besser geeignet erscheint. Der BC wurde mit der Bank Top Analyzer gemessen, während der PC und der ASC mit dem Cell Sorter gemessen wurden. Die Analyse der drei beispielhafte Probe setzt benötigte unterschiedliche Verfahren zur optimierten Reproduzierbarkeit, Probe Stabilität und Workflow-Komfort. Das folgende Protokoll wird in den Abschnitten für die drei verschiedenen Systeme angeben.

Protocol

1. Probenahme und Fixierung

1. Kultur pur: Tiefe Einfrieren^15,17
   1. Nehmen Sie 2 mL Zellsuspension, Zentrifuge für 5 min bei Raumtemperatur (RT) und 5.000 X g und verwerfen Sie den überstand.
      Hinweis: Die Stichprobe Zellsuspension beschreibt zusätzliche Datei 1-S1.
   2. Aufschwemmen der Zellen in 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 6 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM NaH₂PO₄, 145 mM NaCl mit Bi-destilliertes H₂O, pH 7,2) zusätzlich mit 15 % (V/V) Glycerin als Cryoprotective Mittel.
   3. 10 min auf Eis und Schock Einfrieren in flüssigem Stickstoff für die spätere Lagerung bei-80 ° c inkubieren
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben sind für mindestens einen Monat stabil.
2. Schlamm-Gemeinschaft aktiviert: Formaldehyd Stabilisierung + Ethanol Fixierung^5,10,18
   1. Nehmen Sie 4 mL Zellsuspension, Zentrifuge für 20 min bei 15 ° C und 3.200 X g und verwerfen Sie den überstand.
      Hinweis: Die Stichprobe Zellsuspension beschreibt zusätzliche Datei 1-S1.
   2. Fügen Sie 4 mL 2 % Formaldehyd in PBS und 30 min bei RT inkubieren
      1. Bereiten Sie 8 % Formaldehyd-Stammlösung von Paraformaldehyd, die Erhaltung additive Methanol hinzugefügt, um Formaldehyd in flüssiger Form geliefert zu vermeiden. Fügen Sie 4 g Paraformaldehyd, 50 mL PBS bei 70 ° C. Fügen Sie ca. 125 µL 10 M NaOH-Lösung. Rühren Sie, bis die Paraformaldehyd hat völlig aufgelöst und lassen Sie es dann kühlen Sie ab, RT. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,0 mit ca. 100 µL 37 % HCl. Freeze in 15 mL Aliquote die Formaldehyd-Lösung für die Lagerung. Verwenden Sie nicht länger als 10 Tage aufgetauten Aliquots.
         Achtung: Formaldehyd behandelt und mit Sorgfalt aufgrund seiner toxischen und mutagenen Eigenschaften entsorgt werden muss. Tragen Sie immer Handschuhe beim Umgang mit es. Verwenden Sie eine Dunstabzugshaube bei der Auflösung der Paraformaldehyd, um Belastung durch giftige Dämpfe zu verhindern.
   3. Die Probe für 10 min bei 15 ° C und 3.200 X g Zentrifugieren und den überstand verwerfen.
   4. Aufschwemmen der Probenmaterials in 4 mL 70 % igem Ethanol und Store bei-20 ° C.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Proben sind für mindestens 2 Monate stabil. Je nach den Eigenschaften der Probe kann die Zentrifugationsschritt in 1.2.1 auch für 10 min bei 4 ° C, Zeit zu sparen durchgeführt werden.
3. Biogas-Community: trocknen
   1. Verwenden Sie eine abgeschnittene 1.000 µL PIPETTENSPITZE zum Beispiel 200 µL der viskosen Gärreste in eine 2 mL-Tube.
   2. 1.700 µL PBS-Puffer und mischen Sie gründlich.
   3. Legen Sie die Rohre in ein Ultraschallbad bei 35 kHz und 80 W effektive Ausgangsleistung für 1 min zur Auflösung großzellige Aggregate und Zellen kleben pflanzliche Zelle Rückstände zu lösen.
   4. Durchmischen der Probenmaterials, filtern die Probe durch ein 50 µL Siebfilter und das Filtrat in vier Aliquote von etwa 400 µL unterteilen.
      Hinweis: Vorbereitung Aliquote an dieser Stelle bietet zwei wesentliche Vorteile. Erste, kleinere Mengen sind einfacher und schneller zu mechanisch entwässern (Zentrifuge) und thermisch (Trocknung), aber Probenahme von kleinen Mengen von in der Regel Dicke Biogas Schlamm kann sehr schwierig sein. Zweite, zusätzliche Proben können für nachfolgende Zelle Sortieren, backup Messungen oder Kontrollen verwendet werden.
   5. Aliquote zweimal für 10 min bei 10 ° C und 4.000 X g Zentrifugieren und entsorgen des Überstands vollständig beide Male um mechanisch die Probe so gründlich wie möglich entwässern.
   6. Trocknen Sie die Proben in einer beheizten Vakuum-Zentrifuge für 40 min bei 35 ° C, etwa-97 kPa und 2.500 X g stabile Pellets zu erstellen. Speichern Sie die Pellets bei 4 ° C im Dunkeln.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die Pellets sind für mindestens 6 Monate stabil.

2. Färbung

Hinweis: DAPI-Färbung erweist sich als hochauflösende Punkt plottet liefern und deshalb besonders vorteilhaft bei der Analyse der Gemeinschaften. Die DAPI-Konzentration in der Färbelösung muss optimiert werden, um eine Zelle Tor Fluoreszenzintensität deutlich über der Geräuschpegel aber unterhalb der Perlen zu gewährleisten. Die optimale hängt von der Instrument-Empfindlichkeit und Perle-Wahl, kann variieren zwischen Sample-Sets durch G/C-Gehalt der enthaltenen Mikroorganismen und sollte in der Regel für neu eingeführte Sample-Sets getestet werden. Testen von Konzentrationen zwischen 0,24 µM DAPI und 1 µM DAPI wird empfohlen für die vorgestellten Setup. Andere Farbstoffe können für spezielle Anwendungen verwendet werden. Die Verwendung von einem SYBR Green ich Färbeprotokoll ist geboten, wenn absolute Zelle zählen Genauigkeit über die Abnahme von Fingerabdrücken Analyse (ergänzende Datei 1-S1)^6,15priorisiert wird. Es enthält weniger Beispielschritte Handling und Zentrifugation und gilt mit festen und vital Zellen. Die Verwendung von vitalen Zellen weiter reduziert Beispielschritte Handhabung durch das Auslassen der Fixierung und somit erfordert nur eine Zentrifugation für Zelle zu ernten. Dies minimiert mögliche Zellverlust und folglich systematische Messfehler. PBS, Permeabilisierung Puffer und Färbelösung verwendet, während alle folgenden Schritte sollte durch 0,2 µm Spritze Filter, zusätzliche Partikel in der Probe entlasten gefiltert werden. Die Färbung einer Probe mit Escherichia coli BL21 (DE3) wie ein biologische Standard mit jeder Probe-Pool wird empfohlen.

1. Kultur pur
   1. Die Proben, Zentrifuge für 5 min bei RT und 5.000 X g Auftauen und den überstand verwerfen.
   2. Aufschwemmen der Zelle Pellet in eiskaltem PBS durch wiederholte pipettieren und passen Sie die OD-_700nm , 0,035 (Pfad Länge_Küvette = 0,5 cm).
   3. Bereiten Sie die Zellen für das Beflecken.
      1. 1 mL der bereinigte Zellsuspension für 5 min bei RT und 5.000 X g Zentrifugieren und den überstand verwerfen.
      2. Die Zellen in 1 mL Permeabilisierung Puffer mit 0,3 M Zitronensäure und 4,1 mM Tween20 aufschwemmen und gründlich mischen.
      3. Inkubation der Probe für 10 min auf Eis durchlässig Zellmembranen für nachfolgende Färbung zu erstellen.
      4. Die Probe für 5 min bei RT und 5.000 x g zentrifugieren und den überstand verwerfen.
   4. 1 mL Färbelösung mit 0,68 µM DAPI in 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ Puffer (289 mM Na₂HPO₄, 128 mM NaH₂PO₄ mit Bi-destilliertes H₂O, pH 7) zugeben, mischen und mindestens 15 min bei RT im Dunkeln inkubieren.
      Hinweis: Genaue OD Einstellung ist entscheidend für vergleichbare Messungen zu gewährleisten, weil die DAPI-Fluoreszenz mit der Zelldichte variiert, wenn die DAPI-Konzentration konstant gehalten wird. Der Überstand sollte sorgfältig durch eine in der Regel fragile Pellet Zellverlust zu verhindern entfernt werden.
      Achtung: Handhabung und Entsorgung DAPI mit Sorgfalt aufgrund seiner mutagenen Eigenschaften.
2. Belebtschlamm Gemeinschaft
   1. Die feste Probe gründlich mischen und 0,6 mL in ein Glasrohr überführen. 1,4 mL PBS und beschallen für 10 min bei RT, wie unter Punkt 1.3.3 beschrieben. Die Probe für 10 min bei 4 ° C und 3.200 x g zentrifugieren und den überstand zu entfernen. 2 mL PBS und mischen Sie gründlich. Für 5 min beschallen.
   2. Passen Sie die OD-_700nm , 0,035 (Pfad Länge_Küvette = 0,5 cm) mit PBS.
   3. Bereiten Sie die Zellen für das Beflecken.
      1. Die Probe für 10 min bei 4 ° C und 3.200 X g Zentrifugieren und den überstand zu entfernen.
      2. Die Zellen in 1 mL Permeabilisierung Puffer mit 0,11 M Zitronensäure und 4,1 mM Tween20 aufschwemmen und gründlich mischen.
      3. Inkubieren Sie für 20 min bei RT durchlässig Zellmembranen für nachfolgende Färbung zu erstellen.
      4. Die Probe erneut für 10 min bei 4 ° C und 3.200 X g Zentrifugieren und den überstand zu entfernen.
   4. Fügen Sie 2 mL Färbelösung mit 0,68 µM DAPI und 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ Puffer, mischen Sie gründlich und inkubieren Sie mindestens 60 min bei RT im Dunkeln.
      Hinweis: Die Verwendung von Glasröhren ist empfohlen, da bestimmte Mikroorganismen sind in der Regel an das Kunststoffrohr Wände halten und möglicherweise während des Prozesses verloren. Inkubation über Nacht ist auch möglich und in der Regel vereinfacht Lab.
      Achtung: DAPI behandelt und mit Sorgfalt aufgrund seiner mutagenen Eigenschaften entsorgt werden muss.
3. Biogas-community
   1. Das getrocknete Zelle Pellet in PBS auszusetzen.
      1. 800 µL PBS hinzufügen, mischen und das Pellet 15 min. einwirken lassen.
      2. Die flüssige Phase mit einer 1.000 µL Pipette abzusaugen und die eingeweichte Pellets in den zylindrischen Abschnitt der Rohrwand mit der Pipettenspitze verschieben. Es sollte dort bleiben.
      3. Verschieben Sie die PIPETTENSPITZE in einer kreisförmigen Bewegung um die Kugel entlang der Rohrwände zu zerquetschen.
      4. Waschen Sie die daraus resultierenden Gülle aus der Rohrwände durch den Verzicht auf der flüssigen Phase von der Pipettenspitze entlang der Rohrwand.
      5. Schütteln Sie die Suspension durch Absaugen und dreimal in der Pipette Aussetzung.
   2. Zweimal waschen Sie die Probe mit PBS.
      1. Für 5 min bei 10 ° C und 4.000 X g Zentrifugieren und den überstand verwerfen.
      2. 1.500 µL PBS und mischen Sie gründlich.
      3. Wiederholen Sie diese beiden Schritte einmal.
   3. Legen Sie die Rohre in ein Ultraschallbad für 1 min wie unter Punkt 1.3.3 beschrieben und anschließend Filtern Sie jede Probe durch ein Filtersieb 50 µL in einem einzelnen Glasrohr.
   4. 2 mL der Probe zu OD_700nm 0,035 verdünnen (Pfad Länge_Küvette = 0,5 cm) mit PBS.
   5. Bereiten Sie die Zellen zum Färben wie in Schritt 2.2.3 oben erläutert.
   6. Fügen Sie 2 mL Färbelösung mit 0,24 µM DAPI und 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ Puffer, gründlich mischen und über Nacht bei RT im Dunkeln inkubieren.
      Achtung: DAPI behandelt und mit Sorgfalt aufgrund seiner mutagenen Eigenschaften entsorgt werden muss.

3. Messung

Hinweis: Die vorbildliche Sample-Sets wurden mit zwei verschiedenen fließen Cytometers analysiert. Der PC und der ASC wurden mit einen komplexeren, hoch verstellbar und leicht anpassbare Forschung zentrierte Zelle Sorter analysiert. Für die PC-Analyse wurde dieses Gerät mit einem Laser gesetzt bis wie in früheren Publikation¹⁶, kurzum eine blaue beschrieben ausgestattet (488 nm, 400 mW) und eine Ultraviolett (334 – 364 nm, 100 mW) Argon-Ionen-Laser. Für die ASC-Analyse, neuere blau (488 nm, 400 mW) und ultraviolet (355 nm, 150 mW) Halbleiter-Laser installiert wurden. In beiden Fällen induzierte der blaue Laser FSC (Bandpass Filter 488 nm ± 5 nm, Graufilter 1,9) und der SSC (Bandpass Filter 488 nm ± 5 nm, Graufilter 1,9, Trigger). Diese optischen Eigenschaften beziehen sich auf Zellengröße und Zelldichte, beziehungsweise. Die UV-Laser begeistert die DAPI-Fluoreszenz (Bandpass filter 450 nm ± 32,5 nm) für die Quantifizierung der zellulären DNA-Gehalt. Das fluidische System lief bei 56 Psi (3,86 Bar) mit der Probe Überdruck bei maximal 0,3 Psi und 70 μm Düse. Alle Parameter wurden als Peak-Höhen statt Peakflächen, die Messauflösung zu verbessern. Das Langzeit-monitoring der Biogas-Community wurde mit der weniger komplex, Fluss Küvette ansässige Bank Top Analyzer durchgeführt. Ein UV-Halbleiter-Laser (355 nm, 50 mW) wurde verwendet, um die FSC induzieren (Bandpass filter 355 nm ± 5 nm) und SSC (Bandpass Filter 355 nm ± 5 nm, Trigger) signalisiert und begeistern die DAPI-Fluoreszenz (Bandpass Filter 455 nm C). Das Wasser für den Mantel Puffer beider Geräte war Bi destilliert und 0,1 µm filtriert. Die PBS zur Probenverdünnung sollte durch 0,2 µm Spritze Filter zur Reduzierung der Partikel Lärm in den Messungen so weit wie möglich gefiltert werden.

1. Kultur pur und Belebtschlamm Gemeinschaft
   1. Starten, Instrument, Laser, Computer und Software und die Vorbereitungen für die Probenanalyse.
      1. Schalten Sie den Laser und laufen für 15 min nach Erreichen der Betriebstemperatur und Strahl Stabilität zu gewährleisten.
      2. Füllen Sie den Mantel Tank mit 10-fach Scheide Puffer (19 mM KH₂PO₄, 38 mM KCl, 166 mM Na₂HPO₄, 1,39 M NaCl mit Bi-destilliertes H₂O) mit Bi-destilliertes H₂O bis 0,2 x Arbeitslösung verdünnt (für Zellsortierung: 0,5 x funktionierende Lösung).
      3. Grundieren Sie die fluidische System mit 56 Psi über Druck und den Fäkalientank mit ca. 6 Psi Vakuum.
      4. Führen Sie das Gerät für mindestens 15 min im Rückspülung Modus, Probenöffnung, Schlauch und Düse spülen.
   2. Kalibrieren Sie mit standard-Perlen.
      1. Bereiten Sie die Wulst-Mischungen für die Kalibrierung in der linearen (1 μm blau + 2 μm gelb-grün fluoreszierend) und logarithmischen Reihe (0,5 μm und 1 μm blau fluoreszierend). Verdünnen Sie die Wulst Suspension aus der ursprünglichen Lager Suspensionen, gleiche Konzentrationen zu erreichen.
      2. Messen den linearen Wulst-Mix und passen die Wulst-Gipfel zu einem voreingestellten Kalibrierungsvorlage durch Manipulation der düsenkanals und laser-Optik-Positionen, das Instrument im linearen Bereich vorab zu kalibrieren.
      3. Wechseln Sie zu der logarithmischen Bereich und Messen Sie kontinuierlich den logarithmischen Korn-Mix. Passen Sie die Wulst Gipfeln zu ihrer voreingestellten Kalibrierungsvorlage zur Feinabstimmung der Hardware des Gerätes. Letzte Anpassungen an der Wulst-Position mit der Gain-Einstellung der Photomultiplier Röhren (PMTs) zu machen.
      4. Überprüfen Sie die Position der instrumentalen Lärm und eventuell anpassen an die Kalibrierungsvorlage anpassen.
         Hinweis: Eine feste Kalibrierungsvorlage für die Position der Perlen vor ein Messprojekt vorbereitet werden muss und kann nicht geändert werden (siehe ergänzende Datei 1-S4)! Instrumentale Lärm durch Partikel in der Probe oder das elektronische Rauschen die PMTs induziert werden kann und immer zu einem gewissen Grad aufgezeichnet werden. Es ist nicht ratsam, den Lärm durch Anpassung oder Grundstück Offset Gewinn vollständig auszublenden. Die Fülle und die Position der Lärm Ereignisse können eine wertvolle Informationsquelle und sollten daher in den Rohdaten enthalten sein. Intensive Proben sehr Teilchen könnte die nachträgliche Entfernung des Rauschens Gründen Plotten und Daten Analyse erfordern. Steuern Sie die Kalibrierung in regelmäßigen Abständen während einer Messung Tages Instrument Stabilität zu garantieren und somit Vergleichbarkeit.
   3. Eine Probe mit der biologischen Standard wie unter 2.1.4 Messen (DAPI gefärbt Escherichia coli BL21 (DE3) abgetastet und während der stationären Phase (16 h) nach dem ASC-Protokoll in 1.2 beschrieben fixiert). Überprüfen Sie die Peak-Position in Bezug auf ihre voreingestellte Kalibrierungsvorlage (siehe ergänzende Datei 1-S5).
      Hinweis: Die Routine Färbung und Messung des biologischen Standards mit jedem Pool von Proben dienen auch als interne Kontrolle für das Färbeverfahren. Wenn das Gerät kalibriert ist mit Perlen und die biologische Norm nicht die voreingestellte Kalibrierungsvorlage passt, muss das Färbeverfahren wahrscheinlich wiederholt werden.
   4. Probe-Akquisition.
      1. Führen Sie die Färbelösung für 10 min spülen die Probenöffnung und Rohr und sorgen für die Stabilität der DAPI Fluoreszenz in nachfolgenden Proben.
      2. Filtern Sie die gefärbte Probe mit einer 50 μm Siebfilter vor der Messung zu verhindern Verstopfung der Düse Cytometer oder Kapillare fließen.
      3. Die Probe überwachen die Instrument-Stabilität und bieten die Möglichkeit für eine nachträgliche Kalibrierung Überprüfung fügen Sie die logarithmischen Wulst-Mischung hinzu. Die Proben sollten zwischen 1.000 und 2.500 Veranstaltungen in jedem der zwei Perlen Tore enthalten.
      4. Erstellen Sie eine Zelle-Tor in der Gerätesoftware während der ersten Studie Messungen eine neue Sample-Set. Dieses Tor sollte die gefärbten Zellen enthalten und ausschließen, die Lärm und Perlen.
      5. Mischen der Proben und Messen mit einer maximalen Geschwindigkeit von 3.000 Veranstaltungen s^-1 bis 250.000 (Gemeinden) oder 50.000 Zellen (Reinkulturen) innerhalb der Zelle Tor erkannt werden.
         Hinweis: Diese Zellzahlen werden basierend auf den Erfahrungen mit den Sample-Sets gewählt. Unterschiedliche Nummern dürfen verwendet werden, um einen Kompromiss zwischen die messeffizienz und den Nachweis von geringen Fülle Untergemeinschaften in beide Richtungen verschieben.
         Fehlerbehebung: Plötzliche Intra-Messung verschiebt sich der Wulst und Zellenposition kann durch in der Düse eingeschlossenen Luftbläschen verursacht werden. Dies erfordert die Beseitigung und Reinigung der Düse und die Spülung des fluidischen Systems mit Scheide Puffer. Das Instrument muss nach Einbau der Düse (beginnen Sie mit Schritt 3.1.2) nachreguliert werden.
      6. Rückspülung das Instrument gründlich mit Scheide Puffer vor dem Herunterfahren und Wechsel Proben.
2. Biogas-community
   1. Starten Sie das Instrument, Laser, Computer und Software zur Vorbereitung für die Probenanalyse.
      1. Rückspülung mindestens 6 mL Scheide Puffer (Bi-destilliertes H₂O) durch die Schläuche und Probenöffnung zu einem lose beiliegenden Schlauch mit der Funktion "Scheide Flüssigkeit Prime" die Gerätesoftware.
      2. Messen Sie Bi-destilliertes H₂O bei 5 µL s^-1 , fluidische System zu spülen, bis weniger als 200 Veranstaltungen s^-1 bei der regelmäßigen Durchfluss von 0,5 µL s^-1erkannt werden.
   2. Kalibrieren Sie das System.
      1. Bereiten Sie die Perle Mischung (0,5 μm und 1 μm blau fluoreszierend). Verdünnen Sie die Wulst Suspension aus der ursprünglichen Stammlösungen, gleiche Konzentrationen zu erreichen.
      2. Messen der Wulst-Mix im Bereich Log₄ und passen die Wulst Gipfeln zu ihrer voreingestellten Kalibrierungsvorlage durch Manipulation der Fluss Küvette und Laser Optiken Positionen. Stellen Sie letzte Anpassungen an der Wulst Position mit der Gain-Einstellung die PMTs.
   3. Kontrollieren Sie die Kalibrierung mit dem biologischen Standard, wie in Schritt 3.1.3 beschrieben.
   4. Probe-Akquisition.
      1. Verdünnen Sie 400 µL gefärbten Probe in 1.600 µL PBS, Messen Sie und überwachen Sie die Anzahl der Ereignisse um eine Konzentration-Test durchführen.
         Hinweis: Angepasste verdünnungsraten möglicherweise für andere Aufnahmequellen notwendig. Die Anzahl der Ereignisse sollte 1.200 Veranstaltungen s^-1 in Partikel reichen Proben Auflösung Verlust in der forward Scatter (Negativbeispiel in ergänzende Datei 1-S2) nicht überschreiten. Reinkulturen können mit bis zu 2.000 Veranstaltungen s^-1gemessen werden.
      2. Erstellen Sie eine Zelle-Tor in der Gerätesoftware während dieser ersten Studie Messungen. Dieses Tor sollte die gefärbten Zellen enthalten und ausschließen, Lärm und Perlen.
      3. Verdünnen Sie die Probe nach den Ergebnissen des Konzentration Tests laufen bei maximal 1.200 Gesamtereignisse s^-1 und die Probe überwachen Instrument Stabilität und bieten die Möglichkeit für eine nachträgliche Kalibrierung überprüfen die Korn-Mischung hinzufügen. Die Proben sollten zwischen 1.000 und 2.500 Veranstaltungen in jedem der zwei Perlen Tore enthalten.
      4. Mischen und Messen der Probenmaterials bis 250.000 (Gemeinden) oder 50.000 Zellen (Reinkulturen) innerhalb der Zelle Tor erkannt werden.
      5. Spülen Sie das Gerät gründlich mit Bi-destilliertes H₂O vor dem Herunterfahren und switching Proben.

4. Zellsortierung

Hinweis: Die Zelle Sortieren Verfahren erfordert zusätzliches Instrument eingerichtet und ist nach veröffentlichten Protokolle¹²durchgeführt.

1. Starten Sie und Kalibrieren Sie das Gerät, wie in 3.1.1-3.1.3 Schritten beschrieben, aber verwenden Sie eine 0,5 x Arbeitslösung des Puffers Hülle.
2. Legen Sie DD-Frequenz und Amplitude der DD Droplet-brechen-Weg zu finden.
3. Montieren Sie die Ablenkplatten, in Rechnung stellen und entscheiden für 2- oder 4-Wege-Sortiermodus.
4. Führen Sie die internen Drop Verzögerung Kalibrierung mit 2 μm gelb-grüne Perlen, die Zeitspanne zu definieren, die ein Teilchen oder Zelle aus dem Verhör Reisen nimmt Punkt (Laserzelle Treffer) bis zum letzten Tropfen an den Strom angeschlossen.
5. Sortieren Sie 6 x 20 Perlen auf einen Objektträger zu und zählen sie mit einem Mikroskop, die Drop-Verzögerung-Kalibrierung zu überprüfen.
6. Vorbereiten der Sortierung Tor-Vorlage.
7. Verwendung der "Einzel- und One-Drop-Modus: höchste Reinheit 99 %" mit einer Rate nicht höher als 2.500 total Veranstaltungen s^-1 um 500.000 Zellen in maximal 4 Tore zu einem Zeitpunkt (4-Wege-Sortiermodus) zu sortieren.
8. Ernte der Zellen durch Zentrifugation (20.000 X g, 6 ° C, 25 min) und das Pellet bei-20 ° C für spätere DNA-Isolierung und Sequenzierung einfrieren.
   Hinweis: Vermeiden Sie Sortieren von Zellen in den Toren mit weniger als 5 % relative Häufigkeit wie die Sortierung Zeit ist umgekehrt proportional zu der relativen Fülle. Die einzelnen Schritte werden in der Zelle Sorter Handbuch ausführlich beschrieben. Die erforderlichen Zellzahlen sind stark abhängig von der jeweiligen Anwendungsfälle und Extraktion Protokolle. Zahlreiche Methoden angewendet wurden: DdPCR (1.000 Zellen^17,19), 16 s rDNA oder McrA Amplikons Sequenzierung (500.000 Zellen^6,10,15) und Proteomics (bis zu 1,1 x 10⁷ Zellen ^16,17). Die Zellsortierung werden besonders vorteilhaft in Kombination mit einem Metagenomik Ansatz wegen der niedrigeren Vielfalt in der sortierten Untergemeinschaften.
   Vorsicht: Berühren Sie nicht die Deflektor-Platten bei der Sortierung durch hohe Spannungen.

(5) Datenanalyse

Hinweis: Die durchflusszytometrischen Messung ergibt "Durchflusszytometrie standard".fcs Data Files mit einem in der Regel einheitliche Datenstruktur. Jedoch unterschiedliche Cytometer Hersteller verwenden leicht angepasste Versionen und ältere Instrumente könnten die 2010 Einführung des neuesten FCS standard 3.1 zurückdatieren. Dies kann zu Dot-Plot Skalierung Probleme auf, die den direkten Vergleich der Ergebnisse mit verschiedenen Instrumenten gesammelt zu verhindern. Die einzelnen Datenpunkte werden jedoch immer in den Zeilen einer Matrix mit den jeweiligen Streuung und Fluoreszenz-Intensität-Werte in den verschiedenen Spalten gespeichert. Die vorgestellten Microbiome Analyse Pipelines verwenden unverwechselbaren Zellengröße und DNA-Gehalt, um mikrobielle Untergemeinschaften zu beschreiben. Diese Parameter sind für die FSC und DAPI Fluoreszenz Kanalintensitäten korreliert (Zelle Sorter: FL-4, Analysator: FL-1) und führen zu Untergemeinschaft Cluster als zweidimensionale FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke visualisiert. Diesen Punkt plottet die Interpretation und Analyse von Flow Cytometry Daten zu ermöglichen und sind in der Regel logarithmisch skaliert. Sie können aus .fcs Dateien mit proprietären Cytometer Software oder Dritter Lösungen angezeigt werden und sind die Basis für die automatisierte (durchflusszytometrischen Histogramm Bildvergleich, CHIC) und semi-automatischen (Cytometric Barcoding, CyBar) Gemeinschaft Analyse.

1. Durchflusszytometrischen Histogramm Bildvergleich
   Hinweis: Der Code, ausführliche Dokumentation und ein Handbuch für dieses Paket gibt es bei http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. Sie wurden auch veröffentlicht²⁰.
   1. Installieren Sie und laden Sie das R-Paket zu, legen Sie das Verzeichnis mit den Dateien .fcs und richten Sie eine Dateiliste durch ausführen:
      > Quelle ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # Enthält das Verzeichnis den Pfad wo die FCS-Dateien befinden
      > # Geben Sie den Pfad in Anführungszeichen
      > setwd("")
      > # Erhalten Sie eine Liste der Dateinamen der FCS Dateien in deinem Arbeitsverzeichnis
      > Dateien <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Erhalten Sie eine Liste der Dateinamen der FCS-Dateien für das Paket enthalten
      > Dateien <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + full = TRUE, Muster = "*.fcs")
      > # Lesen die erste FCS-Datei als FlowFrame
      > Rahmen < - lesen. FCS(files[1],Alter.Names=true,Transformation=false)
      > # Erhalten Sie eine Liste der Parameter/Channel-Namen
      > unname(frame@parameters@data$name)
   2. Erstellen Sie Bilder für die durchflusszytometrischen Rohdaten durch die Ausführung der Funktion "Fcs_to_img"-Paket:
      > # Erstellen die Histogramm-Bilder mit Standardparametern
      > fcs_to_img(files)
   3. Definieren Sie Teilmengen der Histogramm-Bilder durch die Ausführung der Funktion "Img_sub"-Paket:
      > # Das Histogramm erstellen Bild Teilmengen mit Standardparametern
      > Img_sub (Dateien, ch1 = "FS. Log",CH2="fl.4.log")
   4. Berechnen Sie die Überlappung und XOR Werte um die Bildanalyse führen durch das Ausführen der Funktion "Calculate_overlaps_xor"-Paket:
      > # Speichern die Namen aller Teilmenge Bilder als Liste
      > Teilmengen <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # Berechnen, Überschneidungen und XOR-Bilder und Werte in zwei neue Dateien schreiben
      > Ergebnisse <-calculate_overlaps_xor(subsets)
   5. Nicht-metrische Multidimensionale Skalierung (NMD) für Ähnlichkeit Analyse Plots, durch Ausführen der Funktion "Plot_nmds" Paket zu erstellen:
      > # Zeigen einen NMD-Plot der Proben
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
2. Durchflusszytometrischen Barcoding
   Hinweis: Der Code, ausführliche Dokumentation und ein Handbuch für dieses Paket gibt es bei http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. Sie wurden auch veröffentlicht^11,12.
   1. Entwickeln Sie eine master Tor-Vorlage für den Einsatz auf allen Proben.
      1. Laden Sie die .fcs-Dateien in die Analyse-Software mit der Drag & Drop-Funktionalität.
      2. Doppelklicken Sie auf eine Messung und wählen Sie die x- und y-Achse Parameter aus den jeweiligen Dropdown-Listen, ein FSC vs. DAPI-Fluoreszenz-Grundstück zu öffnen.
      3. Verwenden Sie das Polygon-Werkzeug zeichnen, um die Zelle Tor zuvor verwendet, um die Anzahl der analysierten Zellen in den Schritten 3.1.4.5 und 3.2.4.4 Steuern und benennen Sie es entsprechend zu reproduzieren. Ziehen Sie Tor Zelleintrag in der Probenliste auf alle Proben-Gruppe, es zu bündeln.
      4. Doppelklicken Sie auf die Zelle Tor und korrigieren Sie die Zuordnung der Achse um die Zelle Tor Ereignisse zu visualisieren.
      5. Definieren Sie die Untergemeinschaften weit verbreitet in der Muster-Set mit dem elliptischen Tore-Werkzeug nach den veröffentlichten Richtlinien¹² und verwenden Sie das Scannen von SSC oder einem anderen dritten Parameter²¹ , um die Integrität der Tor-Vorlage. Zu bündeln, zu kontrollieren und Anpassen der Untergemeinschaft Zuordnung der anderen Proben.
   2. Exportieren Sie die relative Untergemeinschaft Häufigkeiten in eine txt-Datei für die Verwendung im R-Skript.
      1. Öffnen Sie die Tabellen-Editor mit der Registerkarte "Bearbeiten".
      2. Fügen Sie Spalten für jeden Untergemeinschaft, die war im Schritt 5.2.1.5 definiert und Ausgang Statistik an, die "Frequenz des übergeordneten Elements" und benennen Sie diese.
      3. Erstellen Sie die Tabelle in der "Table Editor" nach der Wahl speichern, Format und Ziel.
         Hinweis: Die Analysesoftware bietet direkt Untergemeinschaft relative Häufigkeiten. Sie können auch durch Teilung der Veranstaltung zählen im einzelnen Untergemeinschaft Tor durch die Anzahl der Ereignisse in der Zelle Tor gewonnen werden. Die Werte müssen in einer Registerkarte getrennt Matrix in eine txt-Datei gespeichert werden, das kann keiner n.a. Felder enthalten und muss einige zusätzliche Anforderungen durch den R-Code (siehe Handbuch und FAQ für spezifische Anweisungen) zu lesen.
   3. Installieren Sie und laden Sie das R-Paket und laden Sie die Daten, indem Sie ausführen:
      > Quelle ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Geben Sie den Pfad in Anführungszeichen
      > setwd("")
      > # Load Dataset
      > data(Cell_number_sample)
      > # Daten anzeigen
      > Cell_number_sample [, -1]
   4. Normalisieren Sie die relativen Häufigkeiten durch Ausführung der "Normalisieren" Paket-Funktion:
      # Normalisieren Sie Daten, Drucken Sie 2 Ziffern
      Normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
   5. Erstellen Sie einen Barcode von der normalisierten und eines BOXPLOTS der ursprünglichen relativen Häufigkeiten durch die Ausführung der Funktion "Cybar_plot"-Paket:
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # Plotten Sie mit Standardparametern
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
   6. Erstellen Sie einen NMD-Plot von der ursprünglichen relativen Häufigkeiten.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > # NMD Handlung des normalisierten Cel Zahlen
      > nmds(Normalized_mean)
   7. Erstellen Sie die Korrelationsanalyse der normalisierten relative Häufigkeiten und anderer Parameter durch Ausführung der Funktion "Korrelation" Paket:
      > # Load Dataset
      > data(Corr_data_sample)
      > # Show Korrelationswerte
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Run Korrelationsanalyse
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      Hinweis: CHIC und CyBar verlassen sich auf relative Häufigkeiten. Durchflusszytometrie kann allerdings auch absolute Zellzahlen, bestimmen, welche für biotechnologische Anwendungen von großem Interesse sein könnte. Um den absoluten Zellzahl bestimmen, gliedert sich die Anzahl der Zellen in das Tor des Interesses durch die untersuchten Probenvolumen. Die analysierten Probenvolumen kann bestimmt werden, indem man Bead Suspension mit bekannter Konzentration in der Probe (Formel in ergänzende Datei 1-S7). Der oberen Bank-Analyzer ist zusätzlich mit einer wahren Volumetrische zählen ausgestattet, die das Volumen in das Probenröhrchen direkt während der Messung quantifiziert. Es wird empfohlen, ein SYBR Green ich Färbeprotokoll für Zellzählung verwenden.

Results

Folgende repräsentative Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit von Wiederholungen und veranschaulichen die verschiedenen Data-Visualisierung und Analyse-Techniken auf jedem der drei Sample-Sets. Sie zeigen die Ergebnisse der möglichen Datenpipelines Bewertung für standard Forschung Fragen zu den jeweiligen Satz geeignet. Die vorgestellten Techniken sind jedoch nicht ausschließlich auf das Sample-Set, die sie mit vorgestellt werden. Die Flow Cytometry Rohdaten wurde öffentlich mit FlowRepository ID FR-FCM-ZY46 zur Verfügung gestellt. Bisher liegen hochgeladenen ASC unter ID FR-FCM-ZYD7.

Biologische und technische repliziert wurden genommen, vorbereitet und nach veröffentlichten Protokolle¹¹analysiert. Biologischer Replikate aus dem PC und ASC wurden aus drei parallelen Kolben. Biologischer Replikate des v. Chr. wurden drei weitere Kostproben an einem Standort in einer pilot-Scale-Anlage gelegt. Drei Aliquote einer Probe wurden fixiert, gefärbt und analysiert, um die technische Reproduzierbarkeit zu gewährleisten. Die Methoden Reproduzierbarkeit wurde nach bereits veröffentlichten Verfahren¹¹bewertet. Eine Tor-Vorlage für alle Proben einer Sample-Set (ergänzende Datei 1-S6) wurde verwendet für die Berechnung der Standardabweichung (%) pro Tor.

Für den PC war die maximale Standardabweichung der relativen Fülle 3,44 %, während die durchschnittliche Standardabweichung 2,13 % (Abbildung 1). Für die ASC und der BC wurden die maximale Standardabweichungen von der relativen Häufigkeiten 1,27 bis 0,88 %, während die Durchschnitte der Standardabweichungen 2.13 bis 0,21 % (ergänzende Datei 1-S8) waren.

Ein Standardverfahren bei der Untersuchung von einer reinen Stamm-Kultur ist die Vorbereitung einer Wachstumskurve, Lag-Phase, Generationszeiten und Zelldichte unter bestimmten Bedingungen zu analysieren. Wir kombinieren dieses Verfahren mit dem Fluss durchflusszytometrischen Analyse Workflow, ein tieferes Verständnis des Systems (Abbildung 2) zu erreichen. Der FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke zeigen die Zellzyklus Staaten der Kultur an verschiedenen Punkten der Batch-Kultur. Kopiervorlage master Tor (ergänzende Datei 1-S6) wurde gegründet, um den Anteil der Zellen mit einem (c1n), quantifizieren zwei (c2n) und mehrere Chromosomen (cXn, Abb. 2 b). Der überwiegende Teil der beimpften Zellen hatte nur ein Chromosom (93,7 % um 0 Uhr). Dies änderte sich drastisch während des exponentiellen Wachstums, wo fast alle Zellen enthalten mehr als eine (99,6 %, 4 h) und über die Hälfte der Bevölkerung (53,1 %) sogar mehr als zwei Chromosomen enthielten. Dies zeigt p. Putidas Fähigkeit, seine Chromosomen schneller als ihre Generationszeit zu replizieren.

Durchflusszytometrischen Analyse erweist sich als sehr nützlich für die Überwachung der Entwicklung der mikrobiellen Lebensgemeinschaften. Es kann Gemeinschaft Dynamik sehr viel näher als die mehr Ressource intensiv molekularbiologische Methoden^5,10folgen. Wir haben diese Dynamik in einem Film und eine Übersicht der Belebtschlamm Gemeinschaft Verschiebungen im Laufe der Zeit gewonnen. Jede Sekunde Frame zeigt ein FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstück einen Auswahlpunkt (ergänzende Datei 2). Eine sehr ausgeprägte Verschiebung zwischen 0 und 4 Tag folgte die Errichtung einer Kern-Community nach Tag 7. Zusätzliche Untergemeinschaften kam am 21. Tag. Wir haben master Tor Vorlage (ergänzende Datei 1-S6), die die Bewertung der mikrobiellen Dynamik auf einer Untergemeinschaft Ebene aktiviert. Die dominierende Untergemeinschaften in verschiedenen Phasen des Experiments waren eindeutig mit dem CyBar-Tool (Abbildung 3). In Kombination mit der Häufigkeitsverteilung der relativen Untergemeinschaft Häufigkeiten half Tore wählen interessante (signifikante Änderung in Hülle und Fülle zu einem wichtigen Zeitpunkt ausgelöst) und tragfähige (über 5 % relative Häufigkeit) für die Sortierung und weitere Analyse²².

Industriellen Maßstab Bioreaktor Anwendungen können mögliche räumliche Heterogenitäten bedingt Unruhe konfrontiert werden. Ändern der Betriebsparameter, wie Veränderungen in der Qualität der nicht-synthetische Substrate sind auch häufig ausgesetzt. Der BC steht für ein solches System und wurde von verschiedenen Orten in einem dynamisch gesteuerte Stecker Fluss Reaktor gesampelt. Der FSC vs. DAPI Fluoreszenz Diagramme (Abbildung 4) von der vorbildlichen Referenzpunkten zeigen nur wenig räumliche, sondern ausgeprägte zeitliche Heterogenität. Der BC wurde mit beiden untersucht, schnell automatisiert CHIC und die tiefer gehende master Tor Vorlage basierenden CyBar Ansatz.

Naturgemäß automatisierte, schnelle und neutrale macht den CHIC in einer industriellen Umgebung besonders interessant für vor-Ort-Kontrolle der Bioprozesse. Es vergleicht rohen .fcs Daten aller verfügbaren Proben. Zwei dieser Vergleiche sind in Abbildung 5dargestellt. Die Ergebniswerte der Unähnlichkeit bestätigen die bisherigen Beobachtungen über räumliche und zeitliche Heterogenität. Die NMD Parzellen erzeugt Form schick Werkzeuge Unähnlichkeit Matrix (Abbildung 6) weiter konkretisiert dieses Ergebnis und visualisiert es entsprechend.

Darüber hinaus haben wir die relativen Häufigkeiten von 23 Untergemeinschaften des v. Chr. mit einem master Tor-Vorlage (ergänzende Datei 1-S6) berechnet. Eine Korrelationsanalyse von 48 Proben aus einem ein-Jahres-Frist wurde durchgeführt, um funktionale Beziehungen in der mikrobiellen Gemeinschaft verstehen. Dies kann helfen, um Tore von Interesse für weitere Untersuchungen (4 Zellsortierung) zu identifizieren. Starke positive oder negative Korrelationen mit abiotischen Parametern wie Produkt Titer können helfen, zu verstehen und Ökosysteme und biotechnologische Prozesse zu optimieren. Die organischen raumbelastung enthalten in diesem Zusammenhang (Abbildung 7) ist ein Beispiel für ein abiotischer Parameter. G4, G5 und G10 weisen starke positive Korrelationen und könnte möglicherweise fermentative Arten enthalten, während die negative Korrelation im G8 in Richtung methanogenen Archaeen andeuten könnten.

Abbildung 1: Reproduzierbarkeit der durchflusszytometrischen Analyse der Reinkultur. FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke mit Kontrolle Perlen (A, B) und bar Grundstücke 3 Untergemeinschaft Häufigkeiten [%] mit Fehlerbalken repräsentieren eine ± Standardabweichung (C, D). Die relativen Häufigkeiten wurden mit der Tor-Vorlage gezeigt in ergänzende Datei 1-S6 bestimmt. Drei biologische Wiederholungen A, B und C die Wachstumskurve um 4 Uhr wurden und drei technische Wiederholungen P1, P2, P3 bereiteten aus Probe A und dreimal, jeweils gemessen: M1, M2, M3, und sind mit ihren jeweiligen Standardabweichungen angegeben. 50.000 Veranstaltungen verzeichneten in der Zelle-Tor. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Zellzyklus Analyse der in Reinkultur, die während einer Wachstumskurve experimentieren über 12 Std. (A). FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke von der Bi-stündlichen Kostproben, die eine Veränderung der DNA-Gehalt in der exponentiellen Wachstumsphase aufweisen. Diese Messreihe enthalten nicht Perlen (siehe ergänzende Datei 1-S3). (B). optische Dichte basierenden Wachstumskurve mit Fehlerbalken repräsentieren eine ± Standardabweichung und relative Häufigkeiten in den Untergemeinschaften im Laufe der Zeit. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Entwicklung der Belebtschlamm Gemeinschaftsstruktur über 24 Tage. (A) die FlowCyBar mit Überlagerung von Häufigkeitsverteilungen in Boxplots für den einzelnen Toren, die Ähnlichkeit der Trends arrangiert werden, visualisiert, die entsprechende Farb-Taste (B) und eine Ähnlichkeit-Analyse in einem NMD Plot Wit R < 0,001 () ( C). die zugrunde liegenden Grundstücke sind in der Filmsequenz in ergänzende Datei 2 dargestellt. Relative Häufigkeiten wurden anhand der Tor-Vorlage, in ergänzende Datei 1 - S6. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: räumliche und zeitliche Heterogenität der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur in industriellem Maßstab plug Flow biogasreaktor. (A) der Vergleich der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur der vier Probenahme Häfen I-IV am Tag 223. (B) der Vergleich der Zeit abhängigen Gemeinschaft Struktur Variationen von Tag 0, Tag 384 im Hafen II. Der Lärm hat verspätet abgeschnitten worden, um die Visualisierung zu verbessern. 250.000 Ereignisse wurden in der Zelle-Tor (ergänzende Datei 1-S6) gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Bildvergleich durchflusszytometrischen Histogramm – schick. Das Prinzip des CHIC-Algorithmus wird durch den Vergleich zweier Proben repräsentieren die räumliche und zeitliche Heterogenität jeweils illustriert. (i) schicke Bilder entstehen aus .fcs Dateien nach Auswahl zwei Parameter (FSC vs. DAPI Fluoreszenz) angezeigt. Die Graustufen (0 – 255) kodiert die Anzahl der Ereignisse in einem Pixel. (Ii) CHIC Teilmengen werden nach Angabe des Bereichs, in Zellen generiert (hier: 200 < x 4000 200 < < y < 2200). (Iii) XOR Kombination Bild entsteht durch den Vergleich Pixel zwischen den Untergruppen. Kein Unterschied ist gleich 0 und wird als schwarz angezeigt. Maximale Differenz entspricht 200 und wird als weiß angezeigt. Der entsprechende XOR-Wert berechnet, indem die Graustufen-Werte alle Pixel im Bild XOR. (iv) Überlagerungsbild Kombination entsteht, wenn die Graustufen-Werte der Pixel der Teilmengen. Der entsprechende Overlay-Wert wird berechnet durch zählen der Pixel ein Overlay-Bild, die nicht gleich NULL und deshalb enthalten Informationen. (V) Unähnlichkeit Werte sind XOR und Overlay Werte dividiert. Diese sind die Basis für die NMD-Darstellung in Abbildung 6. Die Unähnlichkeit Werte und NMD Handlung zeigen eine vernachlässigbare räumliche- und eine ausgeprägte zeitliche Gemeinschaft Heterogenität. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: CHIC basierte Ähnlichkeit Analyse der Biogas Gemeinschaft Proben. Die 0-Day-Probe wurde aus dieser Handlung aufgrund seiner extrem unterschiedlichen Gemeinschaftsstruktur verzerren die Analyse (ergänzende Datei 1-S11) ausgeschlossen. Die NMD Handlung bestätigt die Annahme über räumliche niedrig- und höhere zeitliche Heterogenität mit dem CHIC-Tool gemacht und erklärt in Abbildung 5. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7: Korrelationsanalyse auf der Biogas-Community. Die Matrix wurde mit Spearmans Rangfolge Koeffizient berechnet und basiert auf der relativen Häufigkeiten von 23 Untergemeinschaften, die mit dem master Tor Template in ergänzende Datei 1-S6 ermittelt wurden. Sie wurden korreliert mit der organischen raumbelastung (OLR) für 48 Proben aus einem Zeitraum von einem Jahr. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8: Ähnlichkeit Analyse von planktonischen (P) und Schlamm basiert (S) Gemeinschaften im Abwasser. Von der primären Klär (PCL), aktiviert Schlamm Becken (AS) und Digester Tank (DT) eine komplette Kläranlage (Punkt plottet in ergänzende Datei 1-S10) wurden Proben genommen. Relative Häufigkeiten wurden anhand der Tor-Vorlage in ergänzende Datei 1-S6 gezeigt. Diese Untergemeinschaft Häufigkeiten wurden auch mit dem FlowCyBar-Werkzeug erstellen Sie ein CyBar (ergänzende Datei 1-S10) und NMD analysiert Plot (R < 0,01). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 9: Fixierung Stabilität der Reinkultur. Proben aus dem Wachstum Kurve Experiment genommen um 0 Uhr wurden nach der Fixierung in 15 % Glycerin über 28 Tage bei-80 ° C gelagert. FSC vs. DAPI Fluoreszenz Grundstücke mit Perlen gezeigt werden. Messreihe beinhaltet keine Perlen (ergänzende Datei 1-S3). 50.000 Veranstaltungen verzeichneten in der Zelle-Tor (ergänzende Datei 1-S6). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Ergänzende Datei 1: Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Klicken Sie bitte hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Eine erfolgreiche Analyse der mikrobiellen Populationen und Gemeinschaften erfordert gut abgestimmte Cytometers, eine geeignete Wahl der zellenparameter und einen zuverlässigen Workflow von Probenahme und Fixierung auf die Messung und Datenauswertung. Die ausgewählte zellenparameter müssen mit den verfügbaren Erregung Wellenlängen Gemahl. Wir nutzen und empfehlen DAPI, die sehr empfindlich bei niedrigen Konzentrationen ist; aber muss mit einem UV-Laser, angeregt werden, die in der Regel nicht im standard Cytometer Aufbauten besteht. Andere Farbstoffe, wie z. B. SYBR Green I, auch ganze Bevölkerungen Fleck oder Gemeinschaften aber liefern in der Regel schlechter als Auflösungen. Wir empfehlen nicht, mit Fisch-Verfahren oder Lebensfähigkeit Tests in mikrobieller Gemeinschaften. Diese Ansätze sind nicht zu quantifizieren, zu überprüfen und zu steuern, weil ihre Auswirkungen auf die einzelnen Arten in der Gemeinschaft ist ungewiss. Sie können nicht zuverlässig getestet werden, solange ein Großteil der typischen Gemeinschaften als eine Reinkultur noch nicht verfügbar ist.

Wichtige Schritte im Protokoll gehören Probenahme und Fixierung Verfahren sowie Zellsortierung. Die Probenahme kann kompliziert werden, durch die Tendenz bestimmter Reinkulturen und mikrobieller Gemeinschaften zu aggregieren, Flocken oder Partikel von der Probenmatrix einhalten. Es ist wichtig, diese Aggregate zu zerstreuen und die Zellen in einer Probe zu trennen, bevor man sie zur durchflusszytometrischen Analyse um zuverlässige Ergebnisse zu garantieren. Die vorgestellten Vorbereitung Protokolle wurden optimiert, um einzelne Zelle Analyse zu ermöglichen. Eine endgültige 50 µm Filtrierung erfolgt vor der Messung entfernen alle verbleibenden Aggregate und verhindern, dass die 70 µm Düse von der Zelle Sorter und die Strömung Küvette des Analysators verstopfen. Zelle Flocken aus Kläranlagen sind besonders reichlich, robust und entscheidend für die Funktion des Systems. Wir untersuchten die planktonischen und Schlamm Basis mikrobielle Gemeinschaften in verschiedenen Tanks mit einer Full-Scale Kläranlage, das etablierte Protokoll zu testen. Der Schlamm bilden Zelle, die Aggregate deutlich abgeführt wurden und die Zusammensetzung der Gemeinschaft blieb stabil. Darüber hinaus stellte planktonischen und Schlamm-basierten Gemeinschaften bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen ihnen in allen drei gesampelten Tanks (Abbildung 8, ergänzende Datei 1-S10). Diese Ergebnisse wurden durch vergleichende 16 s rDNA Amplikons Sequenzierung von einem frisch, ein Formaldehyd behandelten-überprüft ein Formaldehyd und Ethanol fixiert-, und eine sortierte Probe¹⁰. Dennoch kann außerordentlich anspruchsvoll Umweltproben, wie starke Biofilme oder Bakterien wachsen in eng vernetzten Ketten abführen möglich. Bodenproben können besonders problematisch sein, da die allgegenwärtigen Partikel im Histogramm angezeigt und können die Zellen durch schieren Fülle verdecken. In solchen Fällen müssen traditionelle sequenziermethoden angewendet werden.

Die Fixierung Stabilität jeder neuen Sample-Set sollte getestet werden, bevor Sie das Experiment damit Ergebnis gültige entwerfen. Gute Fixierung Stabilität ermöglicht auch die gepoolten Färbung und Messung von mehreren Referenzpunkten Zeit an einem einzigen Tag. Es ermöglicht außerdem Replikation Messungen und Retrospektive Zellsortierung von entscheidenden Zeitpunkten nach den Abschluss und die endgültige Auswertung des Versuchs. Die Fixierung Stabilität der Reinkultur wurde über 28 Tage (Abbildung 9) überprüft. Für vor-Ort-Untersuchungen einschließlich der Probentransport sollte die Fixierung Stabilität über einen längeren Zeitraum (in diesem Fall 60 Tage für die Gemeinschaft Belebtschlamm 195 Tage für die Biogas-Community, ergänzende Datei 1-S9) getestet werden.

Die Färbung ist in der Regel nicht problematisch, aber mit einem biologischen Standard Anwendung von der bioinformatische Bewertungsinstrumente darf gesteuert werden muss. Wir nutzten die mock-Stamm E. Coli BL21 (DE3), nach dem ASC-Protokoll fixiert und wurde für den Einsatz in jeder Färbung Charge gehortet.

Abgesehen von DAPI, SYBR Green wurde ich erfolgreich angewendet um mikrobielle Gemeinschaften für mehrere Jahre^{14,23,24,25,26}zu beheben. SYBR Green ich lösen Gemeinschaften in hohen und niedrigen Nukleinsäure Teilmengen (HNA und LNA) mit lebenden Zellen in ein Online-Modus. DAPI, ist genauer in seiner Bindung an DNA und ermöglicht die Unterscheidung von mehr als 50 Untergemeinschaften in einem Muster-Set jedoch erfordert einen Fixierung Schritt vor der Färbung.

Zellsortierung ist ein herausragendes Merkmal dieses Ansatzes und kann angewendet werden, wenn bestimmte Untergemeinschaften von Interesse sind. Es muss betont werden, dass weder PFA-(durchgeführt für nur 30 min) noch Ethanol Behandlung oder DAPI-Färbung¹⁰ wirkt sich negativ auf die nachfolgenden 16 s Amplikons Sequenzierung hatte. Potenzial beeinflusst die Fixierung und Färbung Verfahren auf Untergemeinschaft Metagenom Analysen noch geprüft werden müssen.

Eine Menge von Informationen über die Community-Funktionen und Trend Dynamik erhalten Sie unabhängig von der Sortierung Ansatz bei der Bioinformatik-Werkzeuge mit, die Community-Funktionen auf einer virtuellen Ebene der Zelle für Zelle lösen und verbinden Sie diese Funktionen mit abiotischen Parameter.

Kürzlich eine Reihe von neuen Bioinformatik Bewertung, alles nützliche Werkzeuge für beide die SYBR Green ich und DAPI-Ansätze, wurden entwickelt, um durchflusszytometrischen Gemeinschaft Mustern zu lösen. Dies sind FlowFP²⁷, die Pakete in dieser Studie (FlowCHIC²⁰, FlowCyBar²⁸) verwendet, ein Dekonvolution Modell mit frischem Wasser Gemeinschaften²⁹ etabliert und ein Werkzeug benutzt, um die Stämme nach ihrer physiologischen diskriminieren Eigenschaften-³⁰. Darüber hinaus kann durchflusszytometrischen Vielfalt bestimmt²⁵ und sogar Stabilitätseigenschaften mikrobieller Gemeinschaften können jetzt mit einem online-Tool¹⁰verfolgt werden.

So haben fließen durchflusszytometrischen Analyse einen großen Vorteil, wenn es darum geht, schnelle Auswertung von mikrobiellen Gemeinschaften und möglichen abiotischen Parameter Korrelationen. Allerdings gibt es immer noch Beschränkungen in Bezug auf die Methode. Es kann nicht wirklich online mit dem FlowCyBar-Werkzeug aufgrund der erfahrenen basierend Tor Einstellvorgang angewendet werden. Darüber hinaus würde die Entwicklung nach Maß, bedienungsfreundlich fließen Cytometers stark die Verbreitung des Analyseansatzes Fluss durchflusszytometrischen Microbiome voranzutreiben. Erste Schritte in diese Richtung sind durchgeführte²⁸.

Zukünftige Anwendungen der mikrobiellen Durchflusszytometrie können in der mikrobiellen Ökologie vorgestellt werden, wie es ermöglicht Hochfrequenz Überwachung im Bereich der bakteriellen Generationszeiten und es nachgewiesen wurde, dass ökologische Paradigmen durchflusszytometrischen Daten^{5 anwendbar sind ,10}. Die Methode ist sehr nützlich für Routine-Screenings von Naturlandschaften wie die obligatorische Trinkwasser-Steuerelemente in der Schweiz³¹. Es kann auch ein wertvolles Instrument für medizinische Anwendungen wie menschliche¹⁵ oder tierischen³² Microbiome Screening. Darüber hinaus können neueste Entwicklungen in der Bioinformatik mikrobielle Durchflusszytometrie ein integraler Sensor in die Prozesssteuerung von verwalteten mikrobieller Systeme zu ermöglichen. Mikrobielle Gemeinschaft zytometrie bietet auch ein Screening-Instrument für Zellsortierung, wodurch höhere Auflösung genomische Untersuchungen von bestimmten Community Teilmengen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Milli-Q System Synthesis A10	Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Ultrafiltration Cartridge	Merck, Darmstadt, (GER)	CDUF BI0 01
MoFlo Legacy cell sorter	Beckman-Coulter, Brea, California (USA)
Innova 90C	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150	Lumentum, Milpitas, Kalifornien, USA		355 nm, 150 mW
Photomultiplier-Röhren R928 und R3896	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
Summit 4.3 Software	Beckman-Coulter, Brea, Kalifornien (USA)
1 µ M  FluoSpheres	Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)	F8815	350/440 blau fluoreszierend
2 μ m YG FluoSpheres	Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)	F-8827	505/515 gelb-grün fluoreszierende Kügelchen
0,5 μm m Fluoresbrite BB Carboxylat-Mikrosphären	PolyScience, Niles, Illinois (USA)	18339	360/407
1 μ m Fluoresbrite BB Carboxylat-Mikrosphären	PolyScience, Niles, Illinois (USA)	17458	360/407 blau fluoreszierend
1 & micro; mYG FluoSpheres	Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)	F-13081	505/515 gelb-grün fluoreszierende Kügelchen
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	CAS-Nr. 7778-77-0
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	CAS-Nr. 7447-40-7
Cyflow Space	Sysmex Corporation, Kobe (Japan)
UV Laser Genesis CX,Coherent	, Inc , Santa Clara (USA)		355 nm, 150 mW
H6779-32 Serie PMTs	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japan)
FloMax Software	Sysmex Partec GmbH, Gö rlitz, (GER)
alle optischen Filter	Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	CAS-Nr. 7778-77-0
KCl	Carl Roth, Karlsruhe (GER)	6781.3
FlowJo 10.0.8r1	FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)		Herstellernummer: 42398
R-software v.3.4.3	R Core Team
flowCHIC	a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar	http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html