Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

Summary

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Mikropipette-Methode, um eine kontrollierte Kraft direkt in den Zellkern in einer lebenden Zelle anwenden. Dieser Test ermöglicht Verhör der nuklearen mechanischen Eigenschaften in der lebendigen, anhaftende Zelle.

Abstract

Die mechanischen Eigenschaften des Kerns bestimmen seine Reaktion auf mechanische Kräfte, die in den Zellen erzeugt. Da der Kern mit dem Zytoskelett Molekular kontinuierlich ist, werden Methoden benötigt, das mechanische Verhalten in adhärenten Zellen zu untersuchen. Hier diskutieren wir die unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP) als Instrument zur Kraft direkt in den Zellkern in lebenden adhärente Zellen anwenden. Wir legen einen schmalen Mikropipette zur nuklearen Oberfläche mit Absaugung. Die Mikropipette wird vom Nucleus, übersetzt, was bewirkt, den Kern dass zu verformen und zu übersetzen. Wenn die Rückstellkraft der Saugkraft entspricht, wird der Kern löst und elastisch entspannt. Da der Saugdruck genau bekannt ist, wird die Kraft auf die nukleare Oberfläche bezeichnet. Diese Methode hat ergeben, dass Nano-Maßstab Kräfte ausreichen, um zu verformen und übersetzen den Zellkern in adhärenten Zellen und identifiziert Zellskelett Elemente, mit die den Kern Kräften widerstehen können. Die DFP kann verwendet werden, um die Beiträge der zellulären und nuklearen Komponenten zur nuklearen mechanischen Eigenschaften in lebenden Zellen zu sezieren.

Introduction

Krankheiten wie Krebs betreffen Änderungen an nuklearen Form und Struktur^1,2, die in der Regel von einer Erweichung der Kern^3,4begleitet werden. Nukleare Widerstand gegen mechanische Verformung hat in der Regel durch Krafteinwirkung auf isolierten Kernen⁵gekennzeichnet.

Kern in Zellen ist Molekular mit dem Zytoskelett der Linker Nucleoskeleton und Cytoskelett (LINC) komplexe^6,7,8,9verbunden. Infolgedessen ist der Kern mechanisch mit dem Zytoskelett und durch Zelle-Substrat Verwachsungen, die extrazelluläre Matrix integriert. Mechanisch sondieren des Kerns im Inneren adhärente Zellen bieten einen Einblick in diese mechanischen Integration. Methoden der Kerne in lebenden Zellen zu manipulieren zählen Mikropipette Anspruch^10,11und atomic Force Microscopy^12,13,14. Wir beschrieben vor kurzem eine unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP), die mechanische Kräfte direkt auf den Kern in einem lebendigen adhärente Zellen¹⁵gilt.

Hier beschreiben wir das Verfahren für die Nutzung einer Mikroinjektion Systems, die häufig in Mikroskopie Einrichtungen, eine bekannte, Nano-Maßstab mechanische Kraft direkt in den Zellkern in eine adhärente Zellen anzuwenden. Ein Femtotip (0,5 µm Durchmesser Mikropipette Spitze) ist montiert und die Mikroinjektion System durch ein Rohr verbunden. Der Tipp, positioniert in einem 45° Winkel relativ zur Oberfläche der Kulturschale sinkt bis angrenzend an der nuklearen Oberfläche. Das Rohr ist dann nicht getrennt und die Atmosphäre, die schafft eines negativen Saugdruck an der nuklearen Oberfläche und dichtet die Mikropipette Spitze gegen die nukleare Oberfläche eröffnet. Durch die Übersetzung der Mikropipette Spitze ist der Kern verformt und schließlich (abhängig von der Größe der Krafteinwirkung), losgelöst von der Mikropipette. Diese Abteilung tritt auf, wenn die Rückstellkräfte (widerstehen), ausgeübt durch den Kern und die Zelle, die Saugkraft durch die Mikropipette aufgetragen gleich. Analyse kann erfolgen durch die Verschiebung des Kerns, Messung der Länge Dehnung (Gleichung 1) oder der Bereich Belastung (Abb. 1A).

Protocol

1. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung

Hinweis: Die unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP) kann für adhärente Zelltypen jeglicher Art verwendet werden. Hier werden NIH-3 t 3-Maus-Fibroblasten als die Modell-Zell-Linie für dieses Protokoll verwendet.

1. Kultur NIH-3 t 3-fibroblastenzellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % Spender Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin auf einem 35-mm-Glasboden Schale bis zum gewünschten Konfluenz. Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂zu erhalten.
   1. Achten Sie darauf, alle 35 mm unten Glasschalen mit 5 µg/mL Fibronektin (oder ähnliche ECM-Protein), Mantel vor der Aussaat NIH-3 t 3-Zellen für die Bildgebung.
      Hinweis: Die Zellen müssen vollständig verteilt und Anhänger auf dem Teller für das Experiment. Es gibt keine Einschränkungen in Bezug auf die Konfluenz für die DFP-Methode zu arbeiten.
2. Unmittelbar vor dem Experiment waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS gefolgt von einem einzigen waschen mit vollständigen Wachstumsmedium.
3. Die untere Glasschale 3 mL komplette Wachstumsmedium hinzufügen.

2. Mikroskopie und Bildaufnahme

Hinweis: Ein umgekehrtes Fluoreszenz Mikroskop (oder Äquivalent) mit Mikromanipulator auf den Seitenarm, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers installiert. Das Mikroskop sollte auch mit einer Klimakammer weiterhin die Temperatur bei 37 ° C und CO_-2 -Ebene mit 5 % ausgestattet werden. Ein Mikromanipulator und Microinjector mit dem Mikroskop verbunden ist ebenfalls erforderlich. Ein Öl-Immersion 40 X / 1,3 NA oder 60 X / 1,49 NA (oder gleichwertige Ziele) werden empfohlen für die Experimente. Das Mikroskop sollte auf einem Rütteltisch isoliert montiert werden.

Abbildung 1 . Nukleare Verformung und Mikroskop mit Schwerpunkt
A. maximale nukleare Verformung und Entspannung der nuklearen Verformung. Vor der Berechnung maximale nukleare Deformation, wurden die hinteren Kanten der nuklearen Formen zuerst fiel um für die Übersetzung von deformierten Kern zu korrigieren. Die Form des Kerns zum Zeitpunkt der Mikropipette Tipp Ablösung war vor dem abziehen auf nukleare Ausgangsform überlagert. Der Unterschied im Bereich zwischen den beiden Formen als Δ gemessen wurdeeine₁. Die maximale nukleare Verformung wurde als ΔA₁ geteilt durch die ursprünglichen nuklearen Bereich definiert. Auch ein zweiter Parameter, Δ₂, kann durch die Überlagerung der endgültigen Steady-State nuclear Form nach Mikropipette Ablösung auf die nukleare Originalform definiert werden. B. konzentrieren sich die Zelle auf der Fläche A und Verschieben der Brennebene bis Ebene B Mikropipette Tipp zu finden. Während der Aufnahme, wurde die Mikropipette nach rechts (Richtung oranger Pfeil) übersetzt. Diese Zahl wurde von Neelam Et al.modifiziert. ¹⁵. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

1. Schalten Sie die Microinjector pro des Herstellers Protokoll.
2. Tragen Sie mit einer eintauchen Öl Pipette einen einzigen Tropfen Immersionsöl auf das Objektiv.
3. Klemmen Sie die Schüssel fest in die Schale Halter und laden Sie die Schale Halter auf die Bühne.
   Hinweis: Die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂ während des Experiments einzuhalten.
4. Passen Sie die Höhe des Ziels, die Zellen in den Fokus (Ebene A, Abbildung 1 b) bringen.
5. Bewegen Sie den Mikroskoptisch, eine Zelle von Interesse zu finden.
6. Drehen Sie den Joystick auf der Mikromanipulator, pipettieren Halter an die oberste Position zu bewegen. Laden Sie die 0,5 µm Durchmesser Spitze Mikropipette auf den Halter pipettieren.
   1. Zur Vermeidung von Zelladhäsion, die Mikropipette Vorbehandeln der Mikropipette Spitze mit 0,3 mg/mL PLL-g-PEG-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur. Haftung durch Berühren der Mikropipette in den Zellkern ohne Saug Druck, und dann übersetzen die Mikropipette vom Nucleus testen. Keine Haftung kann von einem völligen Mangel an nuklearen Verformung und Übersetzung erkannt werden.
      Hinweis: Führen Sie Herstellung Vorschläge, um das Paket zu öffnen.
7. Erhöhen die objektiven Brennebene über Flugzeug A und am oberen Rand der Zelle nach Flugzeug B durch die Feinsteuerung einstellen (Abbildung 1 b, siehe Punkt 2.4).
8. Legen Sie die Mikromanipulator auf grob Kontrolle. Bringen Sie langsam die Mikropipette bis Flugzeug B durch die Beobachtung für die Silhouette des mikropipette, bis die Mikropipette voll ins Blickfeld kommt.
9. Sobald die Mikropipette Tipp korrekt ausgerichtet ist, soll der Mikromanipulator Feinsteuerung .
10. Senken Sie das Ziel, die äquatorialebene der Zelle (Ebene A, Abbildung 1 b) und senken Sie die Mikropipette bis etwa 15 µm über Ebene A (Abb. 1 b, gestrichelten Mikropipette).
11. Die Entschädigung Druck (P-_c) auf die Microinjector auf den gewünschten Druck einstellen; warten Sie einige Sekunden für den Druck zu stabilisieren.
    Hinweis: Der optimale Druck-Sollwert richtet sich nach Zelltyp und die spezifischen Ziele des Experiments. In den meisten Fällen wäre 300 hPa ein guter Ausgangspunkt.
12. Stellen Sie sicher, dass die Mikropipette nicht verstopft ist, mit Hilfe der Clean -Einstellung im Feld Mikromanipulator und überprüfen, um sicherzustellen, dass Luftblasen aus der Mikropipette Spitze entstehen.
13. Führen Sie die Spitze in die Zelle durch eine schrittweise Senkung der Mikropipette bis die Spitze die nuklearen Oberfläche leicht berührt.
    Hinweis: Wenn die Mikropipette absenken, die Silhouette der Mikropipette Spitze wird klar, wie es in den Fokus kommt. Bevor die Mikropipette den Kern berührt, erhöhen Sie den Objektive Fokus zu und richten Sie die Mikropipette Spitze mit Kern (gleichen X-y-Koordinate, höheren Z-Ebene). Im Mittelpunkt der Äquatorebene des Kerns (Ebene A, Abbildung 1 b) zurück wieder und senken Sie allmählich die Mikropipette Spitze.
14. Erstellen Sie eine Dichtung zwischen der Mikropipette Spitze und die Kernmembran durch das Trennen der Druck-Zuleitung von der Mikroinjektion System, und eröffnet damit die Mikropipette Rohrende in die Atmosphäre. Dieser Schritt schafft einen negativen Druck gleich P_c an der nuklearen Oberfläche.
15. Bilder mit den Mikroskopen Bild Datenerfassungs-Software zu erwerben. Eine Avi-Erwerb (Video) oder Nd-Erwerb (Bilder) in der Bild-Datenerfassungs-Software einrichten.
    Hinweis: Für jede Imaging Software zu erwerben, eingerichtet in Echtzeit video Bildgebung oder Zeitraffer Bild Akquisitionen mit einem kurzen Zeitintervall.
16. Umschalten auf das entsprechende Leuchtstoff imaging Channel (z. B. GFP, RFP, etc.) und Bildgebung zu beginnen.
17. Übersetzen die Mikropipette Spitze vom Körper der Zelle (nach rechts, Abbildung 1 b) bis der Kern aus der Mikropipette löst.
    Hinweis: Ziehen Sie die Spitze entlang der positiven X-Richtung (nach rechts in das Blickfeld). Die ziehende Rate kann programmiert und gesteuert durch Computer oder der Joystick kann manuell verschoben werden. Haben wir nicht gefunden, eine Korrelation zwischen der ziehen-Rate und nukleare Verformung¹⁵ schlägt eine in erster Linie elastische Reaktion zu zwingen.

(3) Datenanalyse

1. Führen Sie Bildanalyse mit grundlegenden Bildverarbeitungs-Software zur Verfügung. Das Ausmaß der nuklearen Verformung kann durch die Länge Belastung (Ɛ) oder der Bereich Belastung (Abbildung 1A) quantifiziert werden. Quantifizieren, Länge Belastung mit Formel 1, wo L und L₀ darstellen bzw. die Länge des Kerns auf maximale Deformation und die ursprüngliche Position.
   (Gleichung 1)

Results

Abbildung 2A zeigt einem NIH-3 t 3 Maus Fibroblasten Kern zu zwingen. Die Mikropipette Spitze auf der rechten Seite übersetzt wird, der Kern verformt sich und löst sich schließlich von der Mikropipette Spitze. Die Länge Belastung des Kerns wird gesehen, mit zunehmender Saugkraft (Abb. 2 b) zu erhöhen. Die Vorderkante des Kerns (Mikropipette Kante ziehen) bildet eine nukleare Vorwölbung und die Hinterkante ist von seiner ursprüngl...

Discussion

Messung der mechanischen Integration des Kerns mit dem Zytoskelett ist eine Herausforderung für die aktuellsten Methoden, z. B. Mikropipette Anspruch¹⁶, weil sie entweder einzelne Kerne erfordern (wo ist der Kern von dem Zytoskelett entkoppelt) oder Kerne in den suspendierten Zellen (wo extrazelluläre Kräften wie Zugkräfte, fehlen). Auf den Kern wurde Kraft angewandt, indem biaxiale Beanspruchung auf Zellen Anhänger auf eine Membran^17,18; ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorschale		WPI FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
Femtotips	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	eingestellt, aktuelles gleichwertiges Modell: InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	Aktuelles Modell FemtoJet 4i
Plan Fluor Öl Immersion 40x	Nikon	NA
Apo TIRF Öl Immersion 60x	Nikon	NA
Donor Rinderserum (DBS)	ThermoFisher Wissenschaftliche	16030074	NIH 3T3-Serum
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM)	Mediatech Cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 Medium
Penicillin-Streptomycin	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 Medium Ergänzung
Immersionsöl Typ LDF Nicht fluoreszierend	Nikon	77007	Immersionsöl für Objektiv