Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

Summary

In diesem Protokoll beschreiben wir eine Mikropipette-Methode, um eine kontrollierte Kraft direkt in den Zellkern in einer lebenden Zelle anwenden. Dieser Test ermöglicht Verhör der nuklearen mechanischen Eigenschaften in der lebendigen, anhaftende Zelle.

Abstract

Die mechanischen Eigenschaften des Kerns bestimmen seine Reaktion auf mechanische Kräfte, die in den Zellen erzeugt. Da der Kern mit dem Zytoskelett Molekular kontinuierlich ist, werden Methoden benötigt, das mechanische Verhalten in adhärenten Zellen zu untersuchen. Hier diskutieren wir die unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP) als Instrument zur Kraft direkt in den Zellkern in lebenden adhärente Zellen anwenden. Wir legen einen schmalen Mikropipette zur nuklearen Oberfläche mit Absaugung. Die Mikropipette wird vom Nucleus, übersetzt, was bewirkt, den Kern dass zu verformen und zu übersetzen. Wenn die Rückstellkraft der Saugkraft entspricht, wird der Kern löst und elastisch entspannt. Da der Saugdruck genau bekannt ist, wird die Kraft auf die nukleare Oberfläche bezeichnet. Diese Methode hat ergeben, dass Nano-Maßstab Kräfte ausreichen, um zu verformen und übersetzen den Zellkern in adhärenten Zellen und identifiziert Zellskelett Elemente, mit die den Kern Kräften widerstehen können. Die DFP kann verwendet werden, um die Beiträge der zellulären und nuklearen Komponenten zur nuklearen mechanischen Eigenschaften in lebenden Zellen zu sezieren.

Introduction

Krankheiten wie Krebs betreffen Änderungen an nuklearen Form und Struktur^1,2, die in der Regel von einer Erweichung der Kern^3,4begleitet werden. Nukleare Widerstand gegen mechanische Verformung hat in der Regel durch Krafteinwirkung auf isolierten Kernen⁵gekennzeichnet.

Kern in Zellen ist Molekular mit dem Zytoskelett der Linker Nucleoskeleton und Cytoskelett (LINC) komplexe^6,7,8,....

Protocol

1. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung

Hinweis: Die unmittelbaren Zwangs-Sonde (DFP) kann für adhärente Zelltypen jeglicher Art verwendet werden. Hier werden NIH-3 t 3-Maus-Fibroblasten als die Modell-Zell-Linie für dieses Protokoll verwendet.

1. Kultur NIH-3 t 3-fibroblastenzellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % Spender Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin auf einem 35-mm-Glasboden Schale bis zum gewünschten Konfluenz. Zellen bei 37 ° C und 5 % CO₂zu erhalten.
   1. Achten Sie darauf, alle 35 mm unten Glasschalen mit 5 µg/mL Fibronektin (oder ähnliche ECM-Protein), Mantel vor der....

Results

Abbildung 2A zeigt einem NIH-3 t 3 Maus Fibroblasten Kern zu zwingen. Die Mikropipette Spitze auf der rechten Seite übersetzt wird, der Kern verformt sich und löst sich schließlich von der Mikropipette Spitze. Die Länge Belastung des Kerns wird gesehen, mit zunehmender Saugkraft (Abb. 2 b) zu erhöhen. Die Vorderkante des Kerns (Mikropipette Kante ziehen) bildet eine nukleare Vorwölbung und die Hinterkante ist von seiner ursprüngl.......

Discussion

Messung der mechanischen Integration des Kerns mit dem Zytoskelett ist eine Herausforderung für die aktuellsten Methoden, z. B. Mikropipette Anspruch¹⁶, weil sie entweder einzelne Kerne erfordern (wo ist der Kern von dem Zytoskelett entkoppelt) oder Kerne in den suspendierten Zellen (wo extrazelluläre Kräften wie Zugkräfte, fehlen). Auf den Kern wurde Kraft angewandt, indem biaxiale Beanspruchung auf Zellen Anhänger auf eine Membran^17,18; .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluorschale		WPI FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
Femtotips	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	eingestellt, aktuelles gleichwertiges Modell: InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	Aktuelles Modell FemtoJet 4i
Plan Fluor Öl Immersion 40x	Nikon	NA
Apo TIRF Öl Immersion 60x	Nikon	NA
Donor Rinderserum (DBS)	ThermoFisher Wissenschaftliche	16030074	NIH 3T3-Serum
Dulbecco's Modification of Eagle's (DMEM)	Mediatech Cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 Medium
Penicillin-Streptomycin	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 Medium Ergänzung
Immersionsöl Typ LDF Nicht fluoreszierend	Nikon	77007	Immersionsöl für Objektiv