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Methodenartikel

Ethanol-induzierte zervikalen sympathischen Ganglion Block-Anwendungen für die Förderung der Eckzahn minderwertig alveoläre Nervenregeneration mit einer künstlichen Nerv

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DOI:

10.3791/58039

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30. November 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Dental Anesthesia, Nippon Dental University Hospital at Tokyo, 2Department of Dental Anesthesiology, Nippon Dental University School of Life Dentistry at Tokyo, 3Department of Bioartificial Organs, Institute for Frontier Medical Science, Kyoto University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir bewerten die Wirkung der zervikalen sympathischen Ganglion Block auf Nerv Reparatur mit künstlichen Nerv Leitungen. Männliche Beagle Hunde wurden jeweils mit einer künstlichen Nerv über einen 10 mm Spalt im linken minderwertigen alveoläre Nerv implantiert; linken zervikalen sympathischen Ganglion wurde blockiert, durch die Injektion von 99,5 % Ethanol über laterale Thorakotomie.

Zusammenfassung

Polyglycolic Säure Kollagen (PGA-C) Rohre sind Bio-resorbierbaren Nerv Rohre gefüllt mit Kollagen Mehrkammer-Struktur, bestehen aus dünnen Kollagen Filme. Günstige klinische Ergebnisse erzielt werden, wenn diese Rohre für die Behandlung von Geschädigten schlechter als alveoläre Nerv (IAN) verwenden. Ein entscheidender Faktor für die erfolgreiche Nervenregeneration mit PGA-C Röhren ist Blut-Versorgungsmaterial des umgebenden Gewebes. Zervikalen sympathischen Ganglion Block (CSGB) erstellt eine sympathische Blockade in der Kopf-Hals Region damit Erhöhung des Blutflusses in der Gegend. Um eine ausreichende Wirkung zu gewährleisten, muss die Blockade mit Lokalanästhetika ein bis zwei Mal täglich für mehrere Wochen hintereinander verabreicht werden; eine Herausforderung bei der Erstellung Tiermodelle zur Erforschung dieser Technik. Um diese Einschränkung zu beheben, haben wir eine Ethanol-induzierten CSGB in einem Eckzahn Modell der langfristigen Steigerung des Blutflusses in der orofazialen Region entwickelt. Wir prüfen, ob IAN Regeneration über PGA-C Rohr Implantation durch dieses Modell verbessert werden kann. Vierzehn Beagles waren jeweils mit einem PGA-C-Rohr über einen 10 mm Spalt in der linken IAN implantiert. Die IAN befindet sich innerhalb des Unterkiefers Kanals von Knochen umgeben, deshalb wählten wir piezoelektrischen Chirurgie, bestehend aus Ultraschall-Wellen für die Verarbeitung von Knochen, um den Nerv und Gefäß Verletzungsrisiko zu minimieren. Mit diesem Ansatz wurde ein gutes OP Ergebnis erhalten. Eine Woche nach der Operation wurden sieben dieser Hunde linken CSGB durch Injektion von Ethanol unterzogen. Ethanol-induzierte CSGB führte zu verbesserte Nervenregeneration, was darauf hindeutet, dass die erhöhte Durchblutung effektiv Nervenregeneration IAN Mängel fördert. Diese Hunde-Modell kann zu weiterer Forschung über die langfristigen Auswirkungen der CSGB beitragen.

Einleitung

Traumatische Verletzungen des minderwertigen alveoläre Nervs (IAN) ist in vielen Fällen iatrogene, häufig verursacht durch die Extraktion der dritten Molaren oder die Platzierung von Zahnimplantaten1,2,3. Verletzungen der IAN kann führen zu Defiziten in der thermischen und berühren Empfindungen sowie Parästhesien, Dysästhesien, Hypoesthesia und Allodynie. Nervenverletzung ist nicht nur durch eine konservative Therapie, sondern auch durch andere Methoden, einschließlich Nähen und Autotransplantation Platzierung behandelt. Diese Methoden haben jedoch Nachteile, die häufig das Fehlen der Symptom-Verbesserung und neurologische Defekte an der Spender Seite4,5,6.

Die künstlichen Nerv-Polyglycolic Säure-Kollagen (PGA-C) Rohr wurde ursprünglich in Japan entwickelt. Es ist ein Bio-resorbierbaren Rohr mit seiner inneren Lumen, gefüllt mit einer spongiformen Kollagen7. Im Tierversuch dieses Rohr wurde zur Nervenregeneration bei Beagle-Hunden mit peroneus defekt zu verbessern, und wurde gezeigt, dass höhere Verwertung als autologe Nerv Transplantation8zu fördern. Die klinische Anwendung der PGA-C Röhre begann im Jahr 2002 bei Patienten mit peripheren Nervenverletzungen. Darüber hinaus wurden günstige klinische Ergebnisse bei der Behandlung von Trigeminus Neuropathie (IAN und lingual Nerv)9,10,11erreicht. Ein entscheidender Faktor für erfolgreiche Nervenregeneration mit PGA-C Röhren ist Blut-Versorgungsmaterial zu den umliegenden Gewebe8. Zervikalen sympathischen Ganglion Block (CSGB) schafft eine sympathische Blockade in der Kopf-Hals-Region und erhöht den Blutfluss zu den jeweiligen innervierten Bereich12; so hat es bei der Behandlung von komplexen regionalen Schmerzsyndrom und Herz-Kreislauf-Insuffizienz13,14,15eingesetzt. Allerdings gab es nur wenige experimentelle Untersuchungen über die Wirksamkeit der CSGB in immer mehr Blut fließen16,17. Um ausreichende CSGB Effizienz zu gewährleisten, muss die Blockade zusammen mit Lokalanästhetika ein-bis zweimal täglich für mehrere Wochen angewendet werden und stellen somit eine Herausforderung beim Generieren von Tiermodellen um diese Technik zu untersuchen. Bewältigung dieser Einschränkung in einer früheren Studie entwickelten wir ein eckzahn des langfristigen erhöht den Blutfluss in der orofazialen Region18. Das Modell wurde generiert durch die Durchführung einer CSGB durch die Injektion von 99,5 % Ethanol. Wir bewerten die oralen Mukosa Blutfluss und nasale Hauttemperatur durch Laser-Doppler-Flowmetry und Infrarot-Thermografie einmal pro Woche für 12 Wochen. Wir fanden, dass die Durchblutung der orofazialen Region für 7 – 10 Wochen in diesem Modell erhöht wurde.

In der vorliegenden Studie haben wir die Auswirkungen der Ethanol-induzierte CSGB auf Nervenregeneration ausgewertet.
Das PGA-C-Rohr wurde über einen 10 mm Spalt in der linken IAN Beagle Hunde implantiert. Eine Woche später wurde CSGB durchgeführt, durch die Injektion von Ethanol. Drei Monate nach der Operation, führten wir eine Vielzahl von elektrophysiologischen, histologische und morphologische Studien zur Bewertung der Auswirkungen von CSGB auf Nervenregeneration. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für IAN Rekonstruktion mit einem PGA-C Rohr und Ethanol-induzierten CSGB.

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Protokoll

Diese Studie wurde im Einklang mit den Leitlinien für die Pflege und Nutzung von Tieren und den vom Ausschuss angenommenen für Animal Research der Universität Kyōto (Kyoto, Japan, Zulassungsnummer: R-16-16). Alle Anstrengungen wurden unternommen, um die Leiden der Tiere zu minimieren, und alle Abschnitte dieses Berichts befolgen die Ankunft (Animal Research: Meldung von in Vivo Experimente) Richtlinien.

1. Herstellung von der PGA-C-Schlauch

  1. Um die künstlichen Nerv Leitung mittels eines resorbierbaren Polyglycolic Acid (PGA) Rohres zu fabrizieren, verwenden Sie eine röhrenförmige Flechtmaschine ausgestattet mit 48 Spindeln und fünf PGA-Fasern, bestehend aus Bündeln von 26 Filamente (Abbildung 1)18.
  2. Um die PGA Rohroberfläche hydrophilen rendern, setzen Sie Plasmaentladung aus.
  3. Verwenden Sie 1 % V/w Atelokollagen in Hydrochlorid-Lösung7.
    Hinweis: Atelokollagen ist aus Schweinehaut über Enzymbehandlung extrahiert und einer Virenprüfung unterzogen. Hauptsächlich besteht aus Typ I (70 – 80 %) und Typ III Kollagen, das Verhältnis von denen an anderer Stelle ausführlich beschrieben ist7. Bereiten Sie die Kollagen-Lösung durch Auflösen von Kollagen 1 g in 100 mL-Hydrochlorid-Lösung (pH = 3,0). Da die Dichte des Hydrochlorid-Lösung ca. 1,0 beträgt, ist die w/w Kollagen Konzentration fast 1 %.
  4. Beschichten Sie das Rohr mit den Kollagen-Schichten durch immer wieder eintauchen in die 1 % Kollagen-Hydrochlorid-Lösung für 5 s jedes Mal.
    1. Nach dem Eintauchen, trocknen Sie das Rohr auf einer sauberen Werkbank bei Raumtemperatur. Führen Sie nächsten eintauchen nachdem Sie sichergestellt haben, dass das Rohr (ca. 6 h für Lufttrocknung) komplett trocken ist.
    2. Wiederholen Sie der Beschichtungsprozess 10 Mal.
  5. Vorbehaltlich den PGA-C-Schlauch 140 ° C für 24 h unter Vakuum (Dehydrothermalvernetzung Behandlung), um Bio-Absorption und Vernetzung der Kollagenmoleküle zu kontrollieren. Durchzuführen Sie den gesamten Prozess unter aseptischen Bedingungen.
    Hinweis: Dieses Verfahren erzeugt eine Tube endgültige Länge 14 mm, 3 mm Innendurchmesser und 50 μm Dicke.

2. chirurgische Verfahren einrichten

  1. Verwenden Sie Erwachsene männliche Beagles von 9,0 bis 13,0 kg.
    1. Haustiere in getrennten Käfigen unter kontrollierten Zwinger Bedingungen (12-h-hell-dunkel-Zyklus).
    2. Geben Sie festen Nahrung und Wasser Ad Libitum.
  2. Wiegen Sie die Beagles.
  3. Autoklav alle chirurgischen Instrumente.
  4. Sterilisierte Handschuhe schlüpfen und alle Oberflächen der operativen Einstellung mit einer 80 % igem Ethanol-Lösung zu desinfizieren. Entsorgen Sie die verwendeten Handschuhe.
  5. Führen Sie chirurgische Händewaschen.
  6. Setzen Sie auf eine frische Maske, Kleid und sterile Handschuhe.

3. Anästhesie und Vorbereitung der Haut

  1. Den Hund mit einer Mischung von 5 mg/kg Ketamin Hydrochlorid und 1 mg/kg Xylazin durch eine intramuskuläre Injektion zu betäuben.
  2. Intubation mit einer Trachealkanüle Röhre von 7,5 mm Durchmesser und 25 cm Länge.
  3. Legen Sie den Hund auf der rechten Seitenlage. Vollnarkose mit 3,2 % Sevofluran mit Sauerstoff (1,0 L/min) zu erhalten.
  4. Verwenden Sie ein Heizkissen auf Körpertemperatur bei 37 ° C.
  5. Wenden Sie eine ophthalmologische Gel über die Vorderfläche der Augen Hornhaut Abrieb zu vermeiden.
  6. Rasieren Sie sorgfältig das OP-Feld (linken Brustbereich) mit chirurgischen Clippers. Die Operationsstelle besprühen Sie eine erhebliche Menge an alkoholischen Lösung. Warten Sie mindestens 15 Sek. die Anwendung 3 Mal wiederholen.
  7. Notieren Sie die Herzfrequenz und die Sauerstoffsättigung während der Operation.

4. minderwertige alveoläre Nerv Rekonstruktion mittels PGA-C Rohr: Entwicklung der Wiederaufbau nur Modell

  1. 3 mL von 1 % Lidocain mit einer 27 G Nadel auf der linken Unterkiefer Gingiva als örtlicher Betäubung und Schmerzmittel zu injizieren.
  2. Führen Sie einen 5 cm queren Schnitt mit einer Skalpellklinge Nr. 15 in der linken Unterkiefer Gingiva zu die Mandibeln des Tieres zu entlarven.
  3. Verwenden Sie Piezo-Ultraschall-Schwingungen den proximalen Aspekt des Unterkiefers zu einem 3 cm × 8 mm Rechteck durch Foramen posterior geistige Schleifen.
    Hinweis: Die Vibrationsfrequenz war 28 \u2012 32 kHz.
  4. Entfernen Sie den vorderen Teil des Unterkiefers Knochenplatte (Abmessungen, 3 cm × 8 mm), die linke IAN (Abbildung 2A)18verfügbar zu machen.
    Hinweis: Die Wiederaufbau Website entspricht der Wurzelspitze der ersten Molaren
  5. Transekt IAN mit einem Skalpell um ein 10-mm-Segment zu entfernen.
  6. Die proximalen und distalen Stümpfe des abgetrennten Nerven in den Nerv Rohr bis zu einer Tiefe von 2 mm einsetzen.
  7. Verwenden Sie 8-0 Nylon Nähte und ein Operationsmikroskop bei 8 X Vergrößerung, um das Rohr auf den proximalen und distalen Nerv Enden (Abb. 2 b)18Naht.
  8. Die Knochenplatte an seinem ursprünglichen Standort im Unterkiefer zurück.
  9. Schließen Sie die Wunde mit 4: 0-Nylon-Fäden.
  10. Bestätigen Sie einen Tag nach der Operation, dass der Unterkiefer Knochenplatte in seiner richtigen Position.
    1. 4.10.1 führen Sie Computertomographie (CT) Bildgebung des Gesichts Knochens unter Narkose. CT-Parameter wie folgt eingestellt: 120 kVp, 200 mAs, 0,5 mm/s, 0,5 mm Schnittstärke.
      1. Verwalten Sie Anästhesie mit einer Mischung aus 5 mg/kg Ketamin Hydrochlorid und 1 mg/kg Xylazin (Abbildung 3).
  11. Ampicillin (100 mg/Tag) als Antibiotikum und Paracetamol (100 mg/Tag) als Analgetikum für eine Woche nach der Operation zu verwalten.

(5) Ethanol-induzierte CSGB: Entwicklung der Wiederaufbau + CSGB Modell

  1. Durchführen Sie IAN Rekonstruktion, wie in Abschnitt 4 beschrieben und erlauben Sie eine Woche für die Wiederherstellung.
  2. Betäuben Sie das Tier mit 1,5 % Sevofluran in Sauerstoff (4 L/min) und Luft (6 L/min). Rasieren Sie und reinigen Sie die geplante OP-Feld zu, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
  3. Markieren Sie die Schnittführung mit einer chirurgischen Haut Markierung durch Ziehen einer Linie auf der linken Seite Brustbereich (Abbildung 4, die Schnittführung ist 20 cm lang).
  4. 5 mL von 1 % Lidocain mit einer 21 G Nadel auf der linken Seite Brustbereich als örtlicher Betäubung und Schmerzmittel zu injizieren.
  5. Einschneiden der linken Brusthaut mit einer Skalpellklinge Nr. 10.
  6. Einschneiden der Fettschicht mit einem elektrischen Skalpell um die Muskel-Faszie freizulegen.
  7. Aussetzen der Serratus Ventralis Muskel- und Scalenus Muskel.
  8. Erhöhen Sie die Serratus Ventralis Muskel und Scalenus Muskel von Ventral, dorsal, die zweiten und dritten Rippen (Abbildung 5) verfügbar zu machen.
  9. Führen Sie einen linken seitlichen Thorakotomie im zweiten und dritten Intercostalneuralgie Space, setzen Sie den linken zervikalen sympathischen Ganglion (Abbildung 6).
  10. Injizieren Sie 0,2 mL von 99,5 % Ethanol in der zervikalen sympathischen Ganglion mit einer 30 G-Nadel unter direkter Visualisierung (Abbildung 7).
  11. Schließen Sie die Intercostalneuralgie Raum mit resorbierbaren Nähten unterbrochen 1-0.
  12. Schließen Sie die Haut mit unterbrochenen 3-0-Nylon-Fäden.
  13. Ampicillin (100 mg/Tag) als Antibiotikum und Paracetamol (100 mg/Tag) als Analgetikum für eine Woche nach der Operation zu verwalten.
  14. 1 Woche nach CSGB messen Sie Gesichtshaut mit Infrarot-Thermografie, die CSGB zu bestätigen.

6. elektrophysiologische Aufnahmen

  1. Um sensorische Nerven Aktionspotential (SNAP) und sensorischer Nervenleitgeschwindigkeit (SCV) von der IAN drei Monate nach der Rekonstruktion messen, betäuben Sie Tiere wie in Abschnitt 3 beschrieben.
    Hinweis: SNAP und SCV sollte beidseitig der experimentellen und normale Kontrolle für jeden Hund in beiden Behandlungsgruppen gemessen werden.
  2. Machen Sie einen Einschnitt in den linken Unterkiefer Zahnfleisch mit einem Skalpellklinge Nr. 10.
  3. Entfernen Sie vorsichtig den Unterkiefer Knochenplatte nicht physisch beschädigt regenerierte Nervus.
  4. Stimulieren Sie die IAN mit einem Paar von Nadelelektroden, SNAP und SCV aufzeichnen.
    1. Legen Sie die Elektroden proximal zu den Nerv-Conduit.
    2. Gelten Sie 10 kHz elektrische Reiz 20 Mal.
  5. Analysieren Sie die Ergebnisse.
    1. Bestimmen Sie SNAP durch die Berechnung der durchschnittliche Antwort Amplitude auf die elektrische Stimulation.
    2. Messen Sie die Peak-Latenz und Peak Amplitude von den Diagramm-Aufnahmen.
    3. Die Recovery-Index mit der folgenden Gleichung berechnen: Peak Amplitude der linken IAN der Wiederaufbau nur oder Wiederaufbau + CSGB Gruppe / Peak Amplitude der normalen Steuerung (mittlere Segment der richtige IAN in der Wiederaufbau nur Gruppe)19 ,20.

(7) histologische Analyse

  1. Abschnitt Vorbereitung
    1. Ernten Sie drei Monate nach der Rekonstruktion, die linken IAN, einschließlich 1 cm des Nervs auf beiden Seiten des Standortes rekonstruierten.
    2. Ernte der rechten IAN auf der Ebene entspricht der Ernte-Website auf der linken Seite.
    3. Das Präfix der geernteten Nerven durch Eintauchen in 2,5 % Glutaraldehyd in einer 0,1 M Cacodylate Pufferlösung (pH 7.4, 48 ° C, 24 h).
    4. Postfix mit 2 % Osmium ausgefällt Lösung (48 ° C, 4 h) und Kaliumferrocyanid in 0,1 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7.4, 2 h).
    5. Die Nerven mit einer Reihe von abgestuften Ethanol Lösungen zu entwässern.
    6. Betten Sie in Epoxidharz (Paraffin ein).
    7. Abschnitt der Proben bei einer Dicke von 0,5 \u2012 1,0 μm.
  2. Toluidin blauer Färbung und morphologische Analyse
    1. Führen Sie Abschnitte mit Toluidin blauer Lösung zu Flecken.
    2. Mikroskopie-Bilder mit dem Lichtmikroskop bei 400 X Vergrößerung in den folgenden Regionen entlang der Proben zu erhalten: verließ IAN, der Mitte des regenerierten Segments und 2 mm distal an den Stumpf; richtige IAN, der Mitte des Segments IAN entspricht der Ernte-Website auf der linken Seite.
    3. Wählen Sie Bilder aller Regionen mit regenerierten Nervenfasern.
      1. Nach dem Zufallsprinzip ausgewählte 8 \u2012 10 Bereiche von 100 μm × 100 μm mit regeneriert Nervenfasern.
      2. Morphologische Analyse mit Hilfe einer geeigneten Software folgende Parameter messen: Markhaltige Nervenfaser Durchmesser (μm) und Dichte (Anzahl/Fläche), Nerv Gewebe Prozentsatz und G-Wert (Markhaltige Axon Durchmesser/Markhaltige Nervenfaser Durchmesser ).
  3. Immunostaining
    1. Folgen Sie Standardprotokolle für Paraffin Abschnitt Färbung.
    2. Brüten Sie mit Primärantikörpern für 30 min bei 25 ° C.
    3. Waschen Sie mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung 3 Mal bei 25 ° C.
    4. Inkubieren Sie mit Sekundärantikörper beschriftet mit Meerrettich-Peroxidase für 30 min bei 25 ° C.
    5. Bilder mit einem Lichtmikroskop zu erhalten.
  4. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)
    1. Bereiten Sie Nerven, wie unter Punkt 7.1 beschrieben.
    2. Abschnitt Nerven bei einer Dicke von 70 \u2012 90 μm ein regungsloses verwenden.
    3. Führen Sie Abschnitte mit Blei Citrat und Uranyl Reynold es zu Flecken.
    4. Untersuchen und Bild von Transmissions-Elektronenmikroskopie.

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Ergebnisse

Wir beobachteten eine Zunahme der Gesichtshaut Temperatur der blockierten Seite 1 Woche nach der linken CSGB (Abbildung 8).

Auf 3 Monate nach dem Wiederaufbau der PGA-C-Rohr im Bereich Wiederaufbau wurde aufgenommen und Regeneration des Nervs minderwertig alveoläre verzeichneten die Wiederaufbau-only und Wiederaufbau + CSGB Gruppen (Abbildung 9A, B)

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Diskussion

Wir präsentieren eine effiziente Methode für IAN Regeneration mithilfe einer bioresorbierbare Nerv Röhre in Kombination mit Ethanol-induzierten CSGB. Für diese Studie verwendet wir Hunde, seit anderen Tiermodellen wie Mäuse, Ratten und Kaninchen, eine kurze Lebenserwartung und kleine Körpergröße haben, und daher können nicht verwendet werden, um die genaue chirurgische Eingriffe. Da die IAN gelegen innerhalb des Unterkiefers Kanals von Knochen umgeben ist, ist eine chirurgische Technik notwendig, Nerven und Blutgefäße be...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Abteilung bioartifizielle Organe in Kyoto University Institute for Frontier Medical Science. Wir möchten das tierärztliche Personal des Instituts für Frontier Medical Science danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NMP Collagen PSNippon Meatpackers301-84621Atelokollagen, das durch Enzymbehandlung aus junger Schweinehaut gewonnen
wird Chirurgische HaarschneidemaschineRoboz Surgical Instrument CompanyRC-5903
Einweg-Skalpell (Nr.15)Kai medical219ABBZX00073000
VarioSurg3NakanishiVS3-LED-HPSC, E1133Piezoelektrische Chirurgie für Knochen Verarbeitung
von 4-0 Nylon-NähtenEthicon8881H
8-0 Nylon-NahtmaterialEthicon2775G
IsepamicinsulfatNichi-Iko620005641
Einweg-Skalpell (Nr.10)Kai medical219ABBZX00073000
30-Gauge-NadelNipro1134
1-0 resorbierbare SticheEthiconJ347H
3-0 NylonsticheEthicon8872H
Neo ThermoNEC AvioTVS-700Infrarot-Thermografie 
Neuropack & Sigma;NIHON KOHDENMEB-5504Orthodromischer Rekorder für elektrophysiologische Aufzeichnung
ToluidinblauSigma-AldrichT3260-5G
LichtmikroskopKeyenceBZ-9000
Maus Anti-Humanes Neurofilament Protein monoklonaler AntikörperDAKON1591
Polyklonaler Kaninchen Anti-S100 AntikörperDAKOZ0311
TransmissionselektronenmikroskopieHitachi High TechnologiesHitachi H-7000
Dynamische ZellzählungKeyenceBZ-H1CSoftware zur morphologischen Auswertung

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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