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Methodenartikel

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

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DOI:

10.3791/58041

⸱

3. August 2018

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Pharmacology, University of Miami Miller School of Medicine, 2School of Pharmacy, Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation (Yantai University), Ministry of Education, Collaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of Shandong, Yantai University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow zur Fluoreszenz-Imaging-basierte zellbiologischen Studien Proteinaggregation und selbstverdauende Fluss in das zentrale Nervensystem der Drosophila -Modelle von quantitativen Daten entlocken entwickelt. Neurodegeneration.

Zusammenfassung

Mit der steigenden Verbreitung von neurodegenerativen Erkrankungen ist es zunehmend wichtig, die zugrunde liegende Pathophysiologie zu verstehen, die zu neuronalen Dysfunktion und Verlust führt. Fluoreszenz-imaging-Tools und Technologien ermöglichen beispiellose Analyse der subzellulären neurobiologischen Prozesse, doch gibt es noch eine Notwendigkeit für Objektive, reproduzierbare und zugänglich Ansätze zur Extraktion von quantifizierbaren Daten aus bildgebenden Verfahren . Wir haben einen einfachen und flexiblen Workflow um quantitative Daten von Fluoreszenz basierende bildgebenden Studien mit Drosophila Modelle der Neurodegeneration zu extrahieren entwickelt. Im einzelnen beschreiben wir einen easy-to-Follow, halbautomatischen Ansatz mit Fidschi/ImageJ um zwei zelluläre Prozesse zu analysieren: Erstens quantifizieren wir aggregierte Proteingehalt und Profil in der Drosophila -Optik-Lappen mit Leuchtstoff-Tags Mutant Huntingtin-Proteine; und zweitens bewerten wir Autophagie-Lysosomen Flussmittel in Drosophila visuellen Systems mit ratiometrischen basierende Quantifizierung der fluoreszierenden Tandem Reporter der Autophagie. Wichtig ist, enthält das Protokoll hier skizzierten einen semi-automatischen Segmentierung Schritt um sicherzustellen, dass alle fluoreszierende Strukturen analysiert werden, um Selektionsbias zu minimieren und Auflösung der subtilen Vergleiche zu erhöhen. Dieser Ansatz für die Analyse von anderen biologischen Zellstrukturen erweitert werden kann und Prozesse verwickelt in Neurodegeneration, wie proteinhaltige Puncta (Stress-Granulat und synaptischen komplexe), sowie Membrane-springen Fächer (Mitochondrien und Menschenhandel membranvesikel). Diese Methode bietet eine standardisierte, noch anpassbar Referenz für Bildanalyse und Quantifizierung, und könnte Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit über das Feld erleichtern, und letztlich mechanistisches Verständnis der Neurodegeneration verbessern.

Einleitung

Neurodegenerative Erkrankungen betreffen Millionen von Menschen jedes Jahr und die Häufigkeit nimmt mit einer alternden Bevölkerung1. Während jeder Neurodegenerative Erkrankung hat eine einzigartige Ätiologie, zeichnen Aggregation fehlgefaltete Proteine und Aufschlüsselung des proteostase Netzwerks gemeinsame pathologische viele dieser Krankheiten. Erläuterung, wie die Störung dieser grundlegenden und zusammenhängende Prozesse schief geht ist als Beitrag zu neuronalen Dysfunktion und Zelle Tod entscheidend für Verständnis neurodegenerativen Erkrankungen sowie therapeutische Interventionen führen. Fluoreszenz-basierte Bildgebung ermöglicht eine Untersuchung dieser komplexen und dynamischen Prozesse in Neuronen und trug wesentlich zum Verständnis der neuronalen Zelle Biologie. Analyse von eindringmittel tagged Proteinen ist anspruchsvoll, vor allem, wenn Experimente in Vivo, aufgrund der äußerst kompakten Gewebe, verschiedene Zelltypen und morphologischen Heterogenität durchgeführt werden. Manuell assistierte Quantifizierung ist erschwinglich und einfach, aber ist oft zeitaufwändig und unter menschlichen Vorspannung. Daher gibt es eine Notwendigkeit für Objektive, reproduzierbare und zugänglich Ansätze zur Extraktion von quantifizierbaren Daten aus bildgebenden Verfahren.

Wir haben einen einfachen und anpassungsfähigen Workflow mit Fidschi/ImageJ, eine leistungsfähige und frei zugänglichen Bildverarbeitungs-Software2,3, um quantitative Daten aus Fluoreszenz bildgebenden Studien in experimentellen Modellen der skizziert. Neurodegeneration mit Drosophila. Anhand dieses Protokolls Proteinaggregation und selbstverdauende Flussmittel Quantifizierung – zwei Handy-biologischen Funktionen, die für Neurodegenerative Krankheit-Pathologie von großer Bedeutung sind — wir bewiesen die Sensitivität und Reproduzierbarkeit dieses Ansatzes. Analyse der Gewebekulturen tagged mutierte Huntingtin (Htt) Proteine in der Drosophila -Optik-Lappen ergab die Anzahl, Größe und Intensität von proteinaggregaten. Wir visualisieren einen Tandem fluoreszierende Reporter des selbstverdauende Flusses in Drosophila visuellen Systems, die verschiedenen Emission Signale je nach wohnzimmertaugliche Umwelt4anzeigt. Ratiometrischen basierende Analyse des Tandem Reporter für eine quantitative und umfassende Ansicht der Autophagie-Lysosomen Flux von Autophagosome Bildung, Reifung und Transport zu einer Verschlechterung in den Lysosomen zulässig, und zusätzlich hervorgehoben anfällig Fächer in neurodegenerativen Erkrankungen gestört. Wichtig ist, finden Sie in beiden Analysen halbautomatische Schwellwerte und Segmentierung Schritte in unser Protokoll zu minimieren unbewusste Vorurteile, Probenahme-Leistung zu erhöhen, und bieten einen Standard, um Vergleiche zwischen ähnlichen Studien zu erleichtern. Die einfache Workflow soll mächtige Fidschi/ImageJ Plugins (entwickelt von Informatikern, basierend auf mathematischen Algorithmen) zugänglicher Neurobiologen und die Life-Sciences-Gemeinschaft insgesamt.

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Protokoll

1. Überlegungen und Vorbereitungen für die Gestaltung von Bild-Analyse-Experiment

  1. Vorherbestimmen Sie geeignete anatomische, Mobilfunk oder subzellulären Markierungen dienen als Wahrzeichen für die Standardisierung einer Region of Interest (ROI) über verschiedene Proben, z. B. 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI), Membran-Marker, lokalisierte Leuchtstofflampen Protein, etc.
  2. Wählen Sie einen fluoreszierenden Marker, der diskrete Puncta jenseits Hintergrundkonzentrationen für die Struktur des Interesses abgrenzen kann.
    Hinweis: Dieses Protokoll ist für proteinhaltige Strukturen (z.B. fehlgefaltete Protein-Aggregate) und Membrane-springen Organellen (z.B. Autophagie Reporter) optimiert. Um Proteinaggregation zu visualisieren, wurde ein RFP-Tags N-terminale Fragment des menschlichen Htt-Protein mit einer pathogenen PolyQ-Darm-Trakt von 138 Wiederholungen (RFP-hHttQ138) verwendeten5. Das mutierte Htt-Protein bildet zytoplasmatischen Aggregate ausgedrückt unter neuronalen bestimmte Treiber z. B. Ilav-GAL45,6. Um Autophagosome-Lysosomen Flussmittel zu visualisieren, diente der Aktin-GAL4 ubiquitär Ausdruck der Tandem-mCherry-GLP-Atg8a-Reporter fahren. mCherry - und GFP-positiven Puncta zeigen autophagosom, und der Fluss wird überwacht, wie GFP Fluoreszenz in das saure Milieu der Lysosomen wo Säure-unempfindliche mCherry bleibt abgeschreckt ist, bis das Protein abgebaut7. Für ratiometrischen Analyse kann ein einziger Kanal, der eine einheitliche Markierung der Struktur ist für die Segmentierung verwendet oder gegebenenfalls eine Projektion von zwei oder mehr Kanälen kann verwendet werden, um Strukturen, zu umreißen zwar nicht explizit in diesem Protokoll beschrieben. In diesem Beispiel wird mCherry als es Säure-unempfindlich ist und bleibt in dem Fach in der gesamten Fluss durch den Weg für die Segmentierung der Atg8-positiven Teilchen verwendet.
  3. Die open-Source-Bild-Analyse-Plattform ImageJ oder Fidschi herunterladen und installieren – die bevorzugte Distribution von ImageJ mit gebündelt Plugins2,3.
  4. Installieren Sie das Plugin für h-Maxima interaktive Wasserscheide.
    Hinweis: Dieses Protokoll verwendet Fidschi; zusätzliche Plugins sein für ImageJ erforderlich. Das plug-in entwickelt von Benoit Lombardot für SCF-MPI-CBG ist online verfügbar (https://imagej.net/Interactive_Watershed).
  5. Navigieren Sie zu "helfen | Update", wählen Sie"Update-Sites verwalten"aus der"ImageJ-Updater", der SCF-MPI-CBG-Update-Site aus der Liste auswählen und dann schließen und neu starten, Fidschi.

2. Gehirn Sie sezieren und Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Machen Sie Silikon Elastomer gesäumten Dissektion Gerichte.
    1. Gießen Sie Silikon Elastomer-Komponenten in ein Becherglas, wie durch die Hersteller und unter Rühren gut bis gut vermischt.
    2. Verwenden Sie eine Pipette, um 5 cm füllen Gewebekultur Gerichte ein Drittel bis die Hälfte voll (ca. 10 mL von Elastomer-Mischung). Lassen Sie Luftblasen an die Oberfläche aufsteigen und entfernen vorsichtig mit Seidenpapier. Decken Sie die Gerichte zu und legen Sie sie auf einer ebenen Fläche für 48-72 h bei Raumtemperatur (RT) zu heilen.
  2. Sezieren Sie Drosophila Gehirn und visuelle System bei Bedarf.
    1. Führen Sie Drosophila Gehirn Dissektion als zuvor beschriebenen8,9. Durchführen Sie die Dissektion in Elastomer gesäumten Dissektion Gerichte mit ein Elastomer-Boden, um das Gehirn zur Vermeidung von schädlichen Gewebe oder Zangen zu stabilisieren.
    2. Der Lamina intakt zu halten, während der Dissektion, schieben Sie zwei Pinzetten unter die Netzhaut und sanft durch die Mitte des Auges, die Netzhaut zu entfernen. Ziehen Sie jede netzhautgewebe an der Lamina mit Zange statt parallel zur Lamina Oberfläche befestigt.
      Hinweis: Restliche Pigment wird in den folgenden Schritten abwaschen und in der Regel nicht stört Antikörper Färbung und imaging.
    3. Verdünnen Sie 37 % Formaldehyd in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), eine Endkonzentration von 3,7 % in einem 500 µL Microcentrifuge Schlauch vor Gebrauch frisch zu machen. Übertragen Sie des sezierten Gehirns Microcentrifuge Schlauch mit Fix-Lösung und inkubieren Sie für 15 min bei RT mit sanftes Schaukeln.
      Hinweis: Formaldehyd hat eine natürliche Tendenz zu oxidiert werden, produzieren Ameisensäure. Daher ist es vorgeschlagen, um Aliquot der 37 % Formaldehyd für die Lagerung und verdünnte auf 3,7 % frisch vor jedem Gebrauch. Übermäßige Fixierung oder unzureichende Fixierung wird die Integrität des Gewebes und Fluoreszenz10beeinflussen.
    4. 3 Mal mit PBTx waschen (PBS mit 0,4 % Triton x-100) für 15 Minuten.
  3. Immunohistochemistry durchführen und Proben zu montieren.
    1. Wenn Antikörper Färbung erforderlich ist, entfernen Sie PBTx zu, fügen Sie Primärantikörper in PBTx mit normalem ziegenserum 5 % verdünnt hinzu und auf einem aliquoten Mixer über Nacht bei 4 ° c inkubieren
    2. Entfernen Sie Primärantikörper und waschen Sie 3 Mal mit PBTx für 15 min. Hinzufügen Sekundärantikörper in PBTx mit normalem ziegenserum 5 % verdünnt und 1 h bei RT inkubieren oder über Nacht bei 4 ° c Waschen Sie 3 Mal mit PBTx für 15 min.
    3. Nach Bedarf DAPI-Färbung PBTx zu entfernen, fügen Sie DAPI-Lösung (Lösung auf Lager: 5 mg/mL zu verdünnen, zu einer Arbeit Konzentration von 15 µg/mL in PBTx), und 10 min bei RT. Wash 3 Mal mit PBTx für 15 min inkubieren.
    4. Um das Gewebe zu löschen, geben Sie einen Tropfen Eindeckmedium auf die Mitte einer Mikroskopie-Folie mit einem Abstandhalter eine Schicht aus durchsichtigem Klebeband auf beiden Seiten. Übertragen Sie das Gehirn auf den Tropfen Eindeckmittel zu, und 1 – 2 min. warten Sie, bis das Gehirn durchsichtig wird. Entfernen Sie vorsichtig das Eindeckmittel mit einer Pipette.
    5. Zur Montage, geben Sie einen Tropfen frisch Eindeckmedium auf die Köpfe auf der Folie. Überlagern Sie sorgfältig ein Deckglas Luftblasen zu vermeiden. Die Schnittflächen mit Gummilösung versiegeln, und Trocknen bei RT für 20 min. weiter zur Bilderfassung für optimale Ergebnisse zu erzielen.

3. die Bildaufnahme

  1. Mikroskop Aufnahmeparameter, wie räumliche Auflösung, Ziel, Zoom, Scan-Geschwindigkeit, zu optimieren und Schrittweite, um die Auflösung der Strukturen von Interesse zur semi-automatischen Segmentierung während Bildanalyse Erleichterung zu maximieren.
    Hinweis: Es möglicherweise sinnvoll, ein Beispielbild zu erfassen und semi-automatischen Segmentierung (in Schritt 5 dieses Protokolls) zu testen, bevor alle experimentellen Proben imaging. Auf diese Weise kann der Benutzer bildgebende Einstellungen anpassen, so dass Analysewerkzeuge die biologische Struktur der Interesse leicht erkennen können.
  2. Einstellungen Sie Bild Detektor um die höchsten Signal-Rausch-Verhältnis und höchste Dynamik der Probe zu erfassen.
    1. Verwenden Sie eine LUT (siehe Tabelle), die angibt, Pixel Sättigung (Exposition zu hoch) oder Undersaturation (Offset zu niedrig) beim einstellen (Abb. 3 b, rote zeigt Pixel Sättigung durch eine LUT Hi/Low).
    2. Stellen Sie sicher, dass Gain und Offset Einstellungen für alle experimentellen Gruppen geeignet sind, wie experimentelle Manipulationen wahrscheinlich die Struktur von Interesse verändern.
      Hinweis: Es ist zwingend notwendig, dass die gleichen Einstellungen für alle Gruppen verwendet werden, um quantitative Vergleiche anzustellen.
  3. Bild durch das Gewebe, alle Daten zu erfassen.
    Hinweis: Es wird empfohlen, alle verfügbaren Daten während einer bildgebenden Sitzung zu erfassen und einen präziseren Bereich bei ROI Auswahl in Schritt 4 zu definieren, bei Bedarf.
  4. Speichern Sie das Bild als Dateityp durch die Software zur Abbilderstellung unterstützt, um Metadaten wie z. B. Aufnahmeparameter und räumlichen Kalibrierung zu bewahren. Speichern Sie das Bild mit einem Dateinamen einschließlich der experimentellen Datum, genetischen Hintergrund und fluoreszierende Reporter, Antikörper oder Farbstoffe, die entsprechenden Kanäle gescannt wie [experimentelle Gruppenname] _ [Muster-Name] _ [Experiment Datum] _Ch1. [Fluorophor-Ziel /Dye]_Ch2.[Fluorophore-Target/Dye], etc.

(4) Fidschi/ImageJ Bildimport und ROI-Auswahl

  1. Öffnen Sie ein Bild in Fidschi. Verwenden Sie das Dialogfeld "Bio-Formate importieren Optionen", wählen Sie "Ansicht-Stack mit: Hyperstack" und "Farbmodus: Graustufen".
    Hinweis: Es wird empfohlen, den Dateityp Mikroskop als Metadaten zu öffnen, wie z. B. räumliche Kalibrierung von Fidschi gelesen werden kann.
  2. Identifizieren Sie einen Bereich aus einer Z-Ebene oder eine Projektion basiert auf die Marker-Kanäle, die als eine standardisierte ROI über Proben (Abbildung 1, ROI-Auswahl) verwendet werden können.
    1. Verwenden Sie die Bildlaufleiste "C", um die Kanäle verwendet, um die Marker(s) im Schritt 1.1 bezeichneten erfassen anzuzeigen.
    2. Verwenden Sie die "Z" Scrollbar durch die fokale Flugzeuge bewegen. Wählen Sie ein einzelnes Stück oder eine Projektion von mehreren Scheiben zu erstellen, indem Sie auf "Bild | Stapel | Z-Projekt"und setzen"Start Scheibe"und"Stop Scheibe"um den ROI zu umfassen.
      Hinweis: Die " "Projektion Einstellungstyp "bis"Max Intensität"in der"Z-Projekt"Dialogfeld oft eignet sich am besten um Strukturen für die Segmentierung in Abschnitt 5, betonen wenn dies möglicherweise nicht für alle Anwendungen geeignet. Wenn eine andere Art der Projektion für die Analyse erforderlich ist, achten Sie darauf, zu speichern und diese Datei als solche zur Merkmalsextraktion in Abschnitt 6 bzw. 7 zu dokumentieren.
    3. Erzeugen Sie ein neues Bild mit der Kanäle und fokale Maschine(n) von Interesse, die folgenden Schritte in der Bild-Analyse-Protokoll zu vereinfachen. Wählen Sie "Bild | "Duplizieren", legen Sie die gewünschten "Kanäle" (c) und "Scheiben" (Z), und ändern Sie den Namen der Datei entsprechend die Auswahl (z.B., [experimentelle Gruppenname] [Muster-Name] _ _ [date]_[Channel(s)]_[z-plane(s)]) experimentieren.
  3. Verwenden Sie eine der "Auswahl-Werkzeuge" auf der Fidschi-Symbolleiste einen standardisierte ROI anhand der Auswahlkriterien in Schritt 4.2 ermittelten manuell auswählen.
  4. Den ROI für den ROI-Manager hinzufügen, indem "Analyze | Werkzeuge | ROI-Manager "und klicken Sie auf"Hinzufügen"im Menü ROI Manager. Speichern Sie den ROI ROI-Manager im Menü, indem Sie auf "mehr | Speichern", und benennen Sie die Datei, um den ROI zu reflektieren (z.B., [experimentelle Gruppenname] [Muster-Name] [Experiment Datum] _ [Kanäle] _ [Z-Maschine(n)] _ [ROI Beschreibung]).
    Hinweis: Dies kann in Fidschi für spätere Analysen wieder geöffnet werden oder kann auch auf andere Kanäle oder Bildern wie in Abschnitt 5.3.

5. die Vorverarbeitung und Segmentierung mit h-Maxima wasserfesten

  1. Führen Sie die Vorverarbeitung auf dem Kanal verwendet, um die Strukturen von Interesse zu erfassen.
    1. Wenn die Image-Datei aus mehreren Kanälen besteht, trennen Sie die Kanäle durch Klicken auf "Bild | Farbe | Split-Kanäle", der Kanal von Interesse zu isolieren.
    2. Wenden Sie einen Filter wie z. B. ein Medianfilter reduzieren Lärm oder Gaußsche Unschärfe zum Glätten, indem Sie auf "Prozess | Filter | Filtertyp"(z.B."Median-Filter"oder"Gaußscher Weichzeichner").
      1. Probieren Sie verschiedene Filter und Filtern Sie Parameter auf Bilder aus jeder experimentellen Gruppe. Fahren Sie durch Schritt 6.2 mit ein repräsentatives Beispiel aus jeder Gruppe Segmentierung Leistung zu überprüfen. Wählen Sie Filter und Einstellungen, die Segmentierung der Strukturen von Interesse zu erleichtern.
    3. Notieren Sie die Filter und Einstellungen. Wenden Sie diese Parameter auf Versuchsgruppen.
    4. Speichern Sie eine Kopie des Bildes als Tiff-Datei einschließlich der angewendeten Filters zu Referenzzwecken. Verwenden Sie einen detaillierten Namen wie [experimentelle Gruppenname] [Muster-Name] [Experiment Datum] [Channel] _ _ [Z-Maschine(n)] _ [Filter mit Parameter].
  2. Durchführen Sie Segmentierung der Strukturen von Interesse mit dem interaktiven h-Maxima-Wasserscheide-Werkzeug auf das vorverarbeitete Bild generiert und gespeichert im Schritt 5.1.
    1. Das vorverarbeitete Bild aktiv in Fidschi und initiieren die h-Maxima-interaktive Wasserscheide-Tool durch Klicken auf "SCF | Kennzeichnung | Interaktive H_Watershed".
      Hinweis: Dieses Plugin berechnet zuerst die Wasserscheide und dann kann der Benutzer die Auswirkungen von lokalen Maxima und Schwelle Optionen auf Segmentierung durch ein Ausgabebild sofort aktualisierte untersuchen.
    2. Passen Sie aus der Systemsteuerung Samen Dynamik (h), Intensität Schwelle (T) und Peak Überschwemmung (%) um Segmentierung zu optimieren an.
      Hinweis: Beziehen sich immer auf das raw-Bild vor Vorverarbeitung von Abschnitt 4.2, Leistung der Segmentierung der Strukturen von Interesse manuell zu überprüfen.
    3. Wenn Sie mit Segmentierung Ergebnissen zufrieden sind, wählen Sie "Export Regionen Maske" und "Exportieren". Dadurch wird ein binäres Abbild der Wasserscheide Ergebnisse (Abbildung 1, Segmentierung) generiert.
    4. Die Segmentierung Parameter zu erfassen; Diese Parameter auf Versuchsgruppen für quantitative Vergleiche angewendet werden müssen. Die binäre Ergebnisse Maske zu speichern, wenn gewünscht als Referenz mit Segmentierung Parameter im Namen wie [experimentelle Gruppenname] [Muster-Name] [Experiment Datum] _ [TV] _ [Z-Maschine(n)] _ [Filter mit Parameter] _ [H_Watershed Parameter].
  3. Extrahieren Sie die Strukturen von Interesse aus den Ergebnissen der Wasserscheide.
    1. Öffnen Sie die gespeicherte ROI von Schritt 4.4 im ROI-Manager. Wählen Sie mit der binären Regionen Maske aus Schritt 5.2.4 aktiv den ROI aus der ROI-Manager auf das Bild zur Merkmalsextraktion zum standardisierten ROI Begrenzung angewendet.
    2. Mit den ROI auf die binäre Wasserscheide Maske aktiv, wählen Sie "Analyze | Analysieren Sie Partikel"mit"Hinzufügen zum Manager"im Dialogfeld ausgewählt werden, um Funktionen zu extrahieren.
      Hinweis: Dadurch wird eine Partikel-ID für jede Struktur abgegrenzt, während der Segmentierung zur ROI-Manager hinzugefügt. Optionen sind verfügbar in diesem Menü auszuschließende Features basierend auf Größe oder Zirkularität bei Bedarf zu verfeinern, Strukturen, die in die Analyse einbezogen.
    3. Speichern Sie die Partikel durch Klicken auf "mehr | Speichern Sie"aus dem ROI-Manager-Menü. Sicherstellen Sie, dass Bezeichner deaktiviert sind und alle Partikel in einer Zip-Datei gespeichert werden werden. Verwenden Sie einen detaillierten Namen wie [experimentelle Gruppenname] [Muster-Name] [Experiment Datum] _ [TV] _ [Z-Maschine(n)] [Filter mit Parameter] _ [H_Watershed Parameter] _ [Strukturen].

6. Menge, Bereich und Intensität Quantifizierung und Analyse

  1. Öffnen Sie die raw-Bild generiert und gespeichert in Schritt 4.2. Scrollen Sie zum Kanal für die Erfassung der Strukturen von Interesse.
    Hinweis: Es ist entscheidend für die Intensität Messungen aus den raw-Bild (vor Vorverarbeitung) zu nehmen, als das Anwenden von Filtern im Schritt 5.1 Änderungen die Pixelwerte.
  2. Öffnen Sie die Partikel aus Merkmalsextraktion im Schritt 5.3 gewonnen und wählen Sie "Alle anzeigen" von ROI-Manager.
    Hinweis: Diese Aktion wird eine Gliederung der einzelnen Partikel auf der "ROI-Manager" auf das Bild überlagern und sollten die Kanten der Strukturen von Interesse (Abbildung 1, Merkmalsextraktion) übereinstimmen.
  3. Legen Sie die gewünschten Messungen durch Klicken auf "Analyze | Eingestellten Messungen".
    Hinweis: Der Bereich, Intensität und Dichte der Partikel können durch Auswahl von "Bereich" und "integrierte Dichte" gemessen werden. Wenn Sie integrierte Dichte ausgewählt ist, wird Fidschi zwei Werte produzieren: "Integrierte Dichte" als das Produkt aus Fläche und mittleren Grauwert und "Raw integrierte Dichte" gemessen als Summe der Pixelwerte berechnet. Dichte des fluoreszierenden Proteins in der Partikel errechnet sich als Summe der Pixelwerte geteilt durch die Fläche. Die Anzahl der Teilchen erzeugt im Schritt 5.3 gibt die Menge der Teilchen innerhalb des Gewebes, den ROI im Schritt 4.4 definiert.
  4. ROI-Manager im Menü wählen Sie "Maßnahme". Die Ergebnisse werden in kalibrierten Einheiten ausgedrückt, solange die Messungen von Dateien, die Software zur Abbilderstellung in Fidschi abgeleitet. Die Ergebnisse aus dem Ergebnisfenster kopieren und Einfügen in Tabellenkalkulations-Software für die Zusammenstellung und weitere Berechnungen.

(7) ratiometrischen Quantifizierung und Analyse der Daten

  1. Führen Sie die Schritte 6.1 und 6.2, Partikel-IDs auf dem ersten rohen Kanal von Interesse zu öffnen.
  2. Legen Sie die gewünschten Messungen durch Klicken auf "Analyze | Eingestellten Messungen".
    Hinweis: Die durchschnittliche Intensität pro Partikel kann durch die Wahl "Gray Mittelwert" gemessen werden.
  3. Der ROI-Manager wählen Sie "Maßnahme". Daten aus Fenster kopieren und Einfügen in Tabellenkalkulations-Software.
  4. Verschieben der "C" Bildlaufleiste zum zweiten rohen Kanal von Interesse, GFP in diesem Beispiel (Abb. 4A), und wiederholen Sie die Schritte 7.2. und 7.3.
    Hinweis: Die Partikel im Schritt 5.3 gespeichert werden standardmäßig auf den Kanal und die Scheibe aus der es erzeugt wurde. Achten Sie darauf, dass Partikel auf den richtigen Kanal von Interesse angewendet werden.
  5. Berechnen Sie das Verhältnis der Intensität von einem Kanal auf die Intensität des zweiten für jedes Partikel in der Tabellenkalkulations-Software.
  6. Verwenden Sie ein Punktdiagramm zu visualisieren und zu quantifizieren ratiometrischen Daten aus Fluorophore, die einzelne Änderungen der zugrunde liegenden biologischen Prozesse reflektierende aufweisen.
    1. Generieren Sie ein Streudiagramm in der Grafik-Software.
      Hinweis: Jeder Datenpunkt stellt eine Struktur von Interesse, wo die Intensität der ersten Fluorophor von Interesse ist der "X-Wert" und die Intensität des zweiten Fluorophor ist der "y-Wert" von jedem Teilchen gemessen.
    2. Legen Sie Anspritzung Schwellenwerte für jede Fluorophore, die Quadranten zu definieren.
  7. Verwenden Sie Linienprofil Fluorophor Intensität über eine Struktur von Interesse zu visualisieren.
    1. Wählen Sie einen ROI im Schritt 5.3 erzeugt und mithilfe des geradlinigen Tools auf der Symbolleiste Zeichnen einer geraden Linie durch den ROI. Fügen Sie die Zeile ROI in den ROI-Manager.
    2. Für jeden Kanal von Interesse, mit der Linie ROI aktiv ist, wählen Sie "Analyze | Plot-Profil".
      Hinweis: Der Plot-Profil-Funktion generiert ein Histogramm-Grundstück und eine Tabelle mit den Werten der Intensität entlang der Linie. Kopieren Sie Ergebnisse von jedem Kanal und Paste in Tabellenkalkulations-Software generieren einen Plot zeigt beide Kanäle entlang der Linie gemessen.

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Ergebnisse

Quantifizierung der Anzahl, Fläche und Intensität der Gewebekulturen tagged mutierten Htt-Aggregate in der Drosophila -Optik-Lappen

Fehlgefaltete Proteinaggregation in das zentrale Nervensystem eine Drosophila -Modell der Huntington-Krankheit, RFP-Tags Mutant untersuchen menschliche Htt mit einem nicht-pathologischen (FH-RFP-hHttQ15) oder pathologische Erweiterung ( UAS-RFP-hHttQ138) und Membran ...

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Diskussion

Die hier beschriebene Protokoll lässt sich vehement und reproduzierbar quantitate Zelle biologische Prozesse visualisiert durch Fluoreszenz-basierte Bildgebung. Zusammenhang mit biologischen und technischen Einschränkungen müssen sorgfältig geprüft werden, um das experimentelle Design führen. Fluoreszierenden Marker der subzellulären Strukturen von Interesse, ob immunhistochemische, farbstoffbasierte oder genetisch ausgedrückt, müssen über Hintergrund von Morphologie und Intensität unterscheiden. FH/GAL4 -System...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wird unterstützt durch die Sheila und David Fuente neuropathischen Schmerzen Forschung Programm Graduate Fellowship (zu J.M.B.), Lois Pope LIFE Fellows Programm (, C.L., Y.Z und J.M.B.), die Snyder-Robinson Foundation Predoctoral Fellowship (zu cl), Dr. John T . Macdonald Foundation (CL), Verträge, Bewilligungen von der National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 und R56NS095893 (zu R.G.Z.), und von Taishan Gelehrter Project (Provinz Shandong, Volksrepublik China) (R.G.Z.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
SYLGARD(R) 184 Silikon-Elastomer-KitDow Corning CorporationPF184250Sezierschale
Falcon 35 mm nicht TC-behandelt Easy-Grip Style Bakteriologische PetrischaleCorning351008Sezierschale
Dumont #5 PinzetteFine Science Tools11251-20Sezierwerkzeug
NatriumchloridSigmaS3014PBS-Lösung
Natriumphosphat zweibasisch SigmaS5136PBS-Lösung
Kaliumphosphat MonobasischSigmaP5655PBS-Lösung
Triton  X-100SigmaT9284Wasch- und Antikörper-Inkubationslösung. 
37% FormaldehydVWR10790-710
Einweg-Mikrozentrifugenröhrchen zur Fixierung (0,5 ml, blau)VWR89000-022Fixierungs-, Wasch- und Antikörperinkubation.
Glatte und mattierte Mikro-Objektträger (25-fach; 75mm)VWR48312-004Objektträger für die konfokale Bildgebung
Micro Cover Gläser, rechteckig (22 fach; 40mm)VWR48393-172Objektträger für konfokale
Bildgebung Gummi ZementSchleim1051-AHalterung
VECTASHIELD Antifade EindeckmediumVector Laboratories, Inc.H-1000Montage
Scotch Magic 810 Unsichtbares Klebeband (19mm&mal; 25.4m)3M Company810Montage
Normales ZiegenserumThermo Fisher ScientificPCN5000Antikörper-Inkubaton
DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid) Thermo Fisher ScientificD1306Nukleinsäure-Färbung. In entionisiertem Wasser auflösen, um eine 5 mg/ml-Stammlösung herzustellen, und bei -80 °C lagern. Auf eine Arbeitskonzentration von 10-20 μm verdünnen; g/mL in PBTx.
3,5X-90X Stereo-Zoom-Inspektion IndustriemikroskopAmScopeSM-1BNZDissektions-Oszilloskop. Ausgestattet mit 6W LED Dual Schwanenhalsbeleuchtung
ImageJ/FijiNIHv1.51uMit SCF_MPI_CBG Plugins (Version 1.1.2)
FV1000-IX81 Konfokal-Laser-Scanning-MikroskopOlympus
Recombinant ConstructBloomington Drosophila Stock CenterBL37749

Referenzen

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Neurodegeneration bei DrosophilaFluoreszenzbildgebungImageJ-AnalyseProteinaggregateAutophagie-Flusssemi-automatisierte SegmentierungOptischer LobusHuntingtin-ProteinAtg8-ReporterFluoreszenzmarkierung
Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ
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