Aufrechterhaltung der biologischen Kulturen und Messung der Genexpression in Aphis Nerii: Non-Modellsystem für Pflanzen-Insekten-Interaktionen

Blattläuse sind kleine, hemimetabolous Insekten, die auf unterschiedlichen Pflanzenfamilien weltweit zu kolonisieren. Sie sind charakteristisch für verschiedene Funktionen, insbesondere ihre komplexen Lebenszyklen mit zyklische Parthenogenese und diskrete Polyphenisms und ihre obligatorische ernährungsphysiologischen Symbiosen mit Bakterien oder Hefen Endosymbionts, die Nährstoffversorgung fehlt Ihre Ernährung der Pflanze SAP-¹. Während die meisten Blattläuse Host Pflanze Spezialisten, einige allgemeine Arten sind wichtige Pflanzenschädlinge zuzufügen beträchtlichen wirtschaftlichen Schaden auf Pflanzen entweder direkt oder über die Krankheitserreger und Viren sie Vektor-². Die Veröffentlichung des ersten Blattlaus-Genoms im Jahr 2010 die Erbse Blattlaus Acyrthosiphon Pisum³, markiert einen wichtigen Meilenstein in der Erforschung der Biologie der Blattlaus, weil es die genomischen Ressourcen für Adressierung Fragen rund um des Insekts zur Verfügung gestellt Anpassungen an den pflanzenfressenden Lebensstil, einschließlich derer, die zu einer besseren Kontrolle Strategien⁴führen könnte. Seit dieser Zeit haben zusätzliche genomische Ressourcen mit der Veröffentlichung von einer kommentierten Genom für die Sojabohne Blattlaus Aphis Glycine⁵und öffentlich verfügbare gesamte Genom Ressourcen für eine weitere drei-Blattlaus-Arten (Myzus angesammelt. Cerasi (schwarze Kirsche Blattlaus), Myzus Persicae (Pfirsich-Kartoffel-Blattlaus), Rhopalosiphum Padi (Vogel-Kirsche-Oat Blattlaus)⁶. Wertvolle de Novo transkriptomischen Ressourcen stehen zur Verfügung sowie für eine Reihe von anderen blattlausarten (e.g.,Aphis Gossypii (Baumwolle Blattlaus)⁷, Sitobion Avenae (Korn Blattlaus)⁸, Cinara Pinitabulaeformis (Kiefer Blattlaus)⁹, Aphis Nerii (Wolfsmilch-Oleander Blattlaus)¹⁰).

Auch unternommen dauerhafte Beiträge zu unserem Verständnis von der Pflanzen-Insekten-Interaktionen und die Ökologie des Lebens die Blattläuse auf Pflanzen¹¹. Ein Bereich wo Blattläuse besonders wichtige Beiträge geleistet haben, ist in unserem Verständnis der chemischen Ökologie von der Gastgeber-Pflanze-Interaktionen. Pflanzenfressenden Insekten zum Ausdruck bringen vielfältige Anpassungen profitieren für Überwindung Pflanze Verteidigung, und einige sogar pflanzlichen Abwehrmechanismen für eigene kooptieren^12,13,14. Beispielsweise ist die Wolfsmilch-Oleander-Blattlaus Aphis Nerii, ein helles Gelb, invasive Blattlaus gefunden in gemäßigten und tropischen Regionen der Welt, die Pflanzen in der Familie Wolfsmilch (Lobelia) besiedelt. Pflanzen in der Familie Lobelia entstanden diverse Chemische Abwehr, einschließlich milchige Latex und Herzglykoside bekannt als Cardenolides, die Binden des kation Trägers Na, K-ATPase und wirksame Abschreckung Generalist Pflanzenfresser^{15, 16}. Wolfsmilch Spezialisten express verschiedene Modi des Widerstands gegen die Cardenolides und einige selektiv oder passiv ansammeln oder Cardenolides in ihren Geweben zu ändern, als ein Mittel, um Raub zu verhindern oder für andere Leistungen-¹⁷. A. Nerii wird gedacht, um Cardenolides auf diese Weise absondern, obwohl die Mechanismen und funktionale Vorteile unklar^{10,18 bleiben}.

Angesichts der genomischen Mittel zur hand, bietet A. Nerii ein ausgezeichnetes experimentelles Modell für die Untersuchung der molekularen und genetischen Mechanismen die Chemo-ökologische Wechselwirkungen zwischen toxischen Wirtspflanzen und ihrer fachlichen Pflanzenfresser. Es ist erwähnenswert, dass, während einige der frühesten Studien der A. Nerii konzentrierte sich auf Sequestrierung von Cardenolides¹⁹, seit dieser Zeit Studien von A. Nerii Einblicke in eine breite Palette von evolutionären und ökologische Fragen zur Verfügung gestellt haben, einschließlich der genetischen Struktur von invasiven Insekten²⁰ und das Zusammenspiel zwischen Bottom-Up- und Top-Down-Verordnung über die Pflanzenfresser Dichte²¹. A. Nerii ist somit ein guter Kandidat als ein experimentelles Modell für eine besonders breite Palette von Studien über das Insekt-Pflanze-Interaktionen. Kritisch für den Erfolg jeder Studie mit A. Nerii ist die sorgfältige Kultur der Blattlaus Bevölkerungen, die die Kultur der Pflanzen umfasst die Blattläuse abhängen, sowie eine effiziente Erzeugung von qualitativ hochwertigen - Omic Daten. Unser Ziel ist es, den Leser durch beide führen. Nachstehend beschriebenen sind Methoden für die Erzeugung und die Wartung der Anlage und Blattlaus Kulturen im Gewächshaus und Labor, DNA und RNA Extraktionen, Mikrosatelliten-Analyse, de Novo Transkriptom Montage und Annotation, Transkriptom differentielle Expressionsanalyse und qPCR rufsakademie ausgedrückt differentiell Gene. Während diese Methoden für A. Neriigeschrieben werden, können die allgemeinen Methoden der Kultivierung, Extraktion und Analyse verschiedener blattlausarten erweitern.

(1) Pflanzenkulturen

1. Samen von einem kommerziellen Anbieter erwerben oder sammeln von ausgewachsenen Pflanzen im Feld.
   Hinweis: Dieses Protokoll ist für die meisten im Handel erhältlichen Wolfsmilch-Arten (z. B. Asclepias wurzelsud, A. Syriaca, A. Curassavica, Gomphocarpus Physocarpus) geeignet. Manche Samen müssen kalt stratifiziert werden, und Anweisungen vom Samen Lieferanten überprüft werden.
2. Pflanzen Sie die Samen in einem feinen keimenden Boden (60 – 70 % feinen Torf, Perlite, Vermiculit, Kalkstein).
   1. Füllen Sie ein standard Sämling Tablett mit Keimen Mix Boden; um sicherzustellen, dass die Erde oben auf dem Brunnen erreicht. Machen Sie in jede Vertiefung eine Einrückung erstelle ich ein Loch in den Boden über eine 3 cm tief.
   2. Legen Sie einen Samen in jedem Loch und Wasser sehr gut mit einer Gießkanne, so dass der Boden die Samen bedeckt und gesättigt ist.
   3. Samen in einem Gewächshaus wachsen (siehe Bedingungen unter 1,5). Wasser regelmäßig, täglich, jeden zweiten Tag; genug, um die Bodenfeuchtigkeit zu einem moderaten Niveau zu halten.
3. Wenn die Setzlinge haben ihren ersten Satzes voller Blätter, Umtopfen Sämlinge in einem allgemeinen Blumenerde mischen (50 – 60 % Torf, Rinde und Kalkstein) (Abb. 1A).
   1. Verwenden Sie 4-Zoll-runde Töpfe, die dicht mit der Tasse Käfige passen. Mit allgemeinen Blumenerde bis zu ca. 5 cm unter den Rand füllen.
   2. Erstellen Sie ein Loch in den Boden tief genug, um den Boden des Topfes zu erreichen.
   3. Mit der Hand sanft die Reife Sämling aus dem Brunnen schöpfen und platzieren Sie es tief in das Loch in der 4-Zoll-Topf. Den Keimling mit der Erde zu decken. Wasser sehr gut.
   4. Wachsen Sie Pflanzen im Gewächshaus und Wasser regelmäßig, täglich, jeden zweiten Tag; genug, um moderate Bodenfeuchtigkeit beizubehalten.
4. Gewächshausbedingungen.
   1. Legen Sie die Gewächshaus-Thermostate, Tagestemperaturen zwischen 18-28 ° C und Nachttemperaturen zwischen 16-22 ° C mit den Anweisungen des Herstellers zu erhalten.
   2. Während der Wintermonate, wenn die Tage kürzer werden, ergänzen Sie das Tageslicht mit 600 W Natriumdampf-Lampen (12 h, 08:00 – 20:00).
5. Steuern Sie unerwünschte Schädlinge (z. B. Thripse, Blattläuse) jedoch mit einer Blatt-Bio Seifenlösung zu, verwenden Sie diese Produkte mit Vorsicht.
   1. Machen Sie die Seifenlösung nach Empfehlung des Herstellers und bewerben Sie sich mit einer Sprühflasche.
   2. Lassen Sie die Seife auf den Pflanzen für 4 – 24 h. sanft spülen Sie die Pflanzen mit Wasser, Seife 4 – 24 h nach Anwendung entfernen und spülen Sie sie mit Wasser einen zweite Zeit vor der Verwendung mit Labor-Blattlaus-Kulturen.
6. Kultur der durchschnittliche Blattlaus Bevölkerung auf Pflanzen, die mindestens 3 – 4 Sätze voller Blätter gewachsen und sind mindestens 10 cm hoch (Abbildung 1B).

(2) Blattlaus Kulturen

1. Die Labor-Blattlaus-Populationen aus einer vorhandenen Lab Isoclonal Bevölkerung anfangen Sie oder von den Bereich gesammelt Blattläuse nach den Anweisungen unten.
   1. Beim Start einer Labor-Bevölkerung aus einer vorhandenen Lab Isoclonal Bevölkerung übertragen Sie Blattläuse wie in 2.3.1–2.3.3 beschrieben.
2. Wann beginnt die neue Isoclonal, Feld-gesammelten Blattlaus Populationen und legen Sie eine einzelne, reproduzierende, Erwachsene Blattlaus auf geeigneten Wirtspflanze wie in Schritt 1.6 erwähnt.
   Hinweis: Populationen können gestartet werden von geflügelten (alate) oder unwinged (apterous) Erwachsene.
   1. Manuell überprüfen Sie Pflanzen aus dem Gewächshaus für unerwünschte Schädlinge vor dem Gebrauch mit Labor Blattläuse. Fixieren Sie alle Pflanzen mit unerwünschten Blattläuse. Falls gewünscht, verwenden Sie eine Ethanol-Isolierflasche, um Thripse oder andere Schädlinge zu entfernen.
      Hinweis: Achten Sie darauf, spülen Pflanzen, die behandelt wurden mit Seife vor dem Gebrauch wie in Schritt 1.5.2 beschrieben.
   2. Eine einzelne Erwachsene Blattlaus mit einem Pinsel oder einer Mund-Pipette erstellt mit ID 3/16" x 1/4" OD Kunststoffschlauch, ein 1.000 µL Pipettenspitze und eine 2,00 µL PIPETTENSPITZE (Abb. 2A) sicher zu übertragen.
   3. Sicher decken Sie Pflanzen mit Blattläusen mit einem Cup-Käfig mit einem Plastikbecher mit der Spitze abgeschnitten, erstellt mit einem feinmaschigen bedeckt und mit Klebeband (Abbildung 2B) gesichert.
   4. Blattläuse befallen Pflanzen in ein Fach und in einem kontrollierten Klimakammer (16 L: 8, 22 ° C, Luftfeuchtigkeit von 70 %).
3. Um das Lager Populationen zu erhalten, übertragen Sie Blattläuse auf frische, neue Pflanzen wöchentlich (2.2.1–2.2.3).
   1. 1 – 3 2^Nd sicher zu übertragen oder 3^rd instar Nymphen und 1 Erwachsenen-Alter Blattläuse mit einer Mund-Pipette (Figuren 2A, 3).
      Hinweis: Aktien sind am besten durch die Übertragung von unwinged Personen gepflegt.
   2. Sicher decken Sie Blattlaus-befallenen Pflanzen mit einem Cup-Käfig mit einem Plastikbecher mit der Spitze abgeschnitten, erstellt mit einem feinmaschigen bedeckt und mit Klebeband gesichert.
   3. Legen Sie Pflanzen in eine Schale und halten Sie Blattläuse in einer Klimakammer (16 L: 8, 22 ° C, Luftfeuchtigkeit von 70 %).
   4. Alternativ, falls gewünscht und wenn die Wirtspflanze von guter Qualität ist, verwenden Sie eine Ethanol-Isolierflasche Bevölkerung verlassen nur eine Reproduktion von Erwachsenen zu reduzieren und zwei bis drei 2. oder 3. instar Nymphen.
4. Um gleichen Alter Bevölkerung für den Einsatz in Experimenten zu erstellen, legen Sie bis zu 5 Erwachsene (vorzugsweise unwinged) aus der Lagergesamtheit auf einer neuen Wirtspflanze.
   1. Entfernen Sie die Erwachsenen 24 h später.
   2. Etwa 5 – 7 Tage später, legen sobald die F₁ Nachkommen bis zum Erwachsenenalter, gereift Sie bis zu 5 unwinged F₁ Erwachsene auf einer neuen Wirtspflanze. Entfernen Sie die Erwachsenen 24 h später.
   3. Nachdem die F₂ Bevölkerung bis zum Erwachsenenalter gereift ist, kann dieser Population in Experimenten verwendet werden.
      Hinweis: Dieser Prozess stellt sicher, dass die experimentelle Bevölkerung ungefähr ist das gleiche Alter und werden von ungefähr gleichen Alter Mütter geboren.
5. Bestätigen Sie die genotypischen Unterschiede zwischen Feld gefangen Isoclonal Linien mit Mikrosatelliten Genotypisierung (siehe unten, Abschnitte 3 und 4).

3. DNA-Extraktion

1. Vorbereitung
   1. Verwenden Sie sterile Techniken, um 1 L Lyse Puffer (0,1 M NaCl, 0,2 M Saccharose, 0,1 M Tris (pH 9.1), 0,05 M EDTA, 0,05 % SDS) vorzubereiten.
   2. Heizblock zu wärmen oder Wasserbad bis 65 ° C.
2. Gewebe-Homogenisierung und Lyse
   1. Legen Sie die Blattlaus am unteren Rand einen sterilen, 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
   2. Legen Sie die sterile Stößel in der Röhre mit der Blattlaus und Tauchen Sie den Boden des Röhrchens in flüssigem Stickstoff.
      Hinweis: Optimale Gewebe Zerfall wird erreicht, wenn die Blattlaus zwischen dem Stößel und Seite des Rohres positioniert ist.
   3. Schleifen Sie die Blattlaus mit dem Stößel zu zunächst Zellen lysiert.
   4. Verwenden Sie für eine einzelne Erwachsene Blattlaus 200 µL (aufgeteilt in 2 x 100 µL Aliquots) des Puffers Lyse. Fügen Sie der ersten Aliquot zu Schleifen und die zerkleinerte Blattlaus aufzuwirbeln, bis die Probe sichtlich zerfallen ist hinzu, dann verwenden Sie die zweite Teilprobe der Stößel abwaschen.
   5. Inkubieren Sie die zerkleinerten Blattläuse in Lyse Puffer bei 65 ° C im Wasser Baden oder Hitze Block für 30 min.
3. DNA-Fällung
   1. Während die Röhre warm ist, fügen Sie 14 µL 8 M KOAc. Kehren Sie um das Rohr zu mischen. Speichern Sie die Probe für 30 min auf Eis.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und Proben können bei-20 ° C bis zu 24 Stunden gelagert werden.
   2. Zentrifugieren Sie bei 13.000 X g für 15 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den überstand auf neue 1,5 mL-Tube mit einer Pipette. Achten Sie darauf, dass Sie nicht die gebeizte Schmutz zu entfernen.
   3. Zur Verbesserung der DNA-Pellet Visualisierung fügen Sie 2 µL Glykogen (20 µg/mL hinzu) überstand. Wenn die Größe der Stichprobe groß genug ist, überspringen Sie diesen Schritt.
   4. Der Überstand 200 µL kalt 100 % Molekulare Grade Ethanol hinzufügen. Invertieren Sie Rohre zu mischen und bei Zimmertemperatur mindestens 15 min inkubieren.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und Proben können bei-20 ° C bis zu 24 Stunden gelagert werden.
   5. Zentrifugieren Sie bei 13.000 X g für 15 min bei Raumtemperatur. Pipettieren, um Ethanol zu entfernen.
4. DNA-Waschanlagen und elution
   1. Fügen Sie 200 µL von kaltem 70 % Molekulare Grade Ethanol. Dann streichen Sie die Röhre um aufschwemmen und waschen das Pellet.
   2. Zentrifuge bei 13.000 X g für 5 Minuten. Bei der Visualisierung der Pellet, sorgfältig entfernen Sie das Ethanol durch pipettieren und 200 µL kalt 100 % Molekulare Grade Ethanol.
   3. Zentrifuge bei 13.000 X g für 5 Minuten. Entfernen Sie bei der Visualisierung der Pellet vorsichtig Ethanol durch pipettieren.
      Hinweis: Wiederholen Sie die 100-70-100 Ethanol waschen wenn nötig.
   4. Luft trocknen die Pellets für 5 – 10 min mit dem Rohr verlegen horizontal auf einem Papiertuch geöffnet.
   5. Das DNA-Pellet in 80 µL des niedrigen TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA) aufzuwirbeln.
   6. Die resuspendierte DNA mit einem Spektralphotometer zu quantifizieren.
   7. Shop bei 4 ° C.

4. Mikrosatelliten PCR und Sequenzierung für die Blattlaus Genotypisierung

1. Bestellen Sie die entsprechenden F und R Primer für Mikrosatelliten Sequenzierung (Tabelle 1-²⁰).
   Hinweis: Rückwärts-Primer-Sequenzen sollten mit 5'-6-FAM oder 5'-5-HEX Fluoreszenzmarkierungen gemultiplexten Proben für Mikrosatelliten-Sequenzierung ermöglichen geändert werden.
2. Durchführen Sie PCR mit einzelnen Blattlaus DNA-Proben (beschrieben in Abschnitt 3) und Gewebekulturen beschrifteten Mikrosatelliten Primer.
   1. PCR-Reaktionen nach dem Hersteller-Protokoll (0,2 µM F/R Grundierung, 2,5 mM MgCl₂, 50 – 200 ng DNA Schablone) mischen.
   2. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen Thermocycler: erste Denaturierung bei 94 ° C für 4 min, 35 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 58 ° C für 35 s, 72 ° C für 45 s und eine endgültige Dehnung Schritt bei 72 ° C für 10 Minuten.
3. Kombinieren Sie PCR-Proben mit verschiedenen fluoreszierenden Tags, reduzieren Sie die Anzahl der Proben sequenziert und Sequenz die Mikrosatelliten-Proben bei einer Genotypisierung Anlage.
4. Analysieren Sie die .fsa raw Beispieldateien mit Mikrosatelliten-Analyse-Software.

(5) RNA-Extraktion

1. Blattläuse Proben für die RNA-Extraktion in 1,5 mL RNase / DNase-freie Schläuche und sofortige Einfrieren in flüssigem Stickstoff.
   Hinweis: Wenn die folgenden Schritte nicht sofort durchgeführt werden, können die Proben bei-80 ° c gelagert werden
2. Gewebe-Homogenisierung
   1. Frieren Sie mit der sterilen Stößel in der Röhre mit Blattlaus in flüssigem Stickstoff für 10 – 15 Sekunden, bis die Probe Stop brutzeln ein. Zerdrücken Sie die Blattlaus gut mit den Stößel, wie in Schritt 3.2 beschrieben.
      Hinweis: Optimale Gewebe Zerfall wird erreicht, wenn die Blattlaus zwischen dem Stößel und Seite des Rohres positioniert ist.
   2. Fügen Sie in der Dunstabzugshaube 800 µL Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform Extraktion-Reagenz zur Probe (1 – 5 Erwachsene Blattläuse hinzu). Proben mit dem Stößel und entsorgen den Stößel zu homogenisieren.
3. Phasentrennung
   Hinweis: Alle Schritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden.
   1. Inkubieren Sie die homogenisierten Proben für 5 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie 160 µL Chloroform zu probieren. Schütteln Sie kräftig von Hand für 15 s.
   2. Ca. 2-3 min bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifuge für 15 min bei 12.000 X g bei 4 ° C.
      Hinweis: Nach Zentrifugation, trennt sich das Gemisch in 3 Schichten: eine untere, rote Phenol-Chloroform-Phase, eine Interphase und eine farblose oberen wässrigen Phase. Die RNA bleibt ausschließlich in der wässrigen Phase. Die Lautstärke von der wässrigen wird ~ 480 µL.
4. RNA-Niederschlag
   1. Übertragen Sie unter einem Abzug die wässrige Phase auf ein frisches, RNase-freie Rohr. Stören Sie die Zwischenphase nicht.
   2. Überstürzen Sie sich die RNA durch Zugabe von 400 µL Isopropanol und inkubieren Sie die Probe bei-20 ° C für 10 min.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und Proben können bei-20 ° C bis zu 24 Stunden gelagert werden.
   3. Zentrifugieren Sie die Probe für 10 min bei 12.000 X g bei 4 ° C.
5. RNA-Waschanlagen und elution
   1. Den überstand zu entfernen; Achten Sie auf die RNA-Pellet.
   2. Waschen Sie die RNA-Pellet mit 1 mL 75 % Ethanol in DEPC-behandeltem Wasser. Durch langsame Vortexen mischen. Zentrifuge für 5 min bei 7.500 X g bei 4 ° C.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 5.5.1–5.5.2 um Phenol Verunreinigungen zu entfernen.
   4. Entfernen des Überstands und das Pellet für ca. 5-10 min mit Rohr Verlegung horizontal offen auf einer sterilen Bank der Luft trocknen lassen. Lassen Sie sich nicht von der RNA-Pellet vollständig trocknen.
   5. Die RNA-Pellet in 30 µL RNase-freie oder DEPC-behandeltem Wasser auflösen. Pipette vorsichtig rauf und runter um zu mischen. 10 – 15 min. bei 55-60 ° C inkubieren.

6. RNAseq De Novo Transkriptom Montage, Beschriftung und differentielle Expression Analysis

1. Analysieren Sie RNA probenkonzentration und Qualität mit Hilfe eines Chip-basierten elektrophoretischen Kapillarsystem.
   Hinweis: Ein Chip-basierte Kapillarelektrophorese-System ist die bevorzugte Methode der Wahl als mit einem Spektrophotometer zu analysieren, da es ein exaktes und gefühlvolles Maß für RNA-Konzentration und Qualität bietet.
   1. Bei Proben von angemessener Qualität (≥ 250 ng total, RIN (RNA-Integrität-Nummer) ≥ 5) führen Sie RNA Sequenzierung aus.
      Hinweis: Wichtig ist, da diese Sequenzierungsdaten für beide Ausdruck profilieren und de Novo Transkriptom Assembly verwendet werden, lesen Sie mehr Tiefe in einer höheren Qualität Transkriptom führen wird. Für eine relativ umfassende Montage mit Illumina Sequenzierungstechnologie, 100 Millionen 100 bp wäre gepaarte Ende liest eine empfohlene Ausgangspunkt. Insgesamt mRNA Bibliothek Vorbereitung und RNA Sequenzierung wurden durch eine Sequenzierung durchgeführt.
2. Überprüfen Sie die Qualität der Lesevorgänge mit schnell QC²².
3. Kombinieren Sie alle Probe mal gelesen und montieren Sie das Transkriptom de Novo mit Trinity^23,24 (Trimmomatic Qualität Filterung aktiviert).
4. Verfeinern Sie die assembly
   1. Transdecoder²⁵ mit dem open Reading Frames (ORFs) bestimmt, die mindestens 100 Aminosäuren in der Länge sind.
   2. Homologie Suchvorgänge für übersetzte ORFs gegen Pfam²⁶ und UniProt²⁷ Datenbanken mit BLASTP²⁸ und HMMER²⁹, beziehungsweise.
   3. Entfernen Sie bakterielle Transkripte (übersetzten Sequenz, deren beste Explosion getroffen, wurde zu einem bakteriellen gen mit einem Bit-Score von über 300 und eine minimale Aminosäure-Sequenz Identität von 50 %).
   4. Blenden Sie vollständige, übersetzte ORFs, die Ebene der Aminosäure mit CD-HIT³⁰mindestens 99 % identisch sind.
   5. Zusammenbruch der verbleibenden, unvollständige ORFs, die Ebene der Nukleotid mit CD-HIT³⁰mindestens 95 % identisch sind.
   6. Weisen Sie die verbleibenden Nukleotidsequenzen mit einzigartigen, artspezifische Bezeichner (z. B. APHNE-0001).
5. Prüfen Sie die Vollständigkeit der Assemblée verfeinert, mit BUSCO (http://busco.ezlab.org/) und die Arthropoda gen Dataset³¹.
6. Transkriptom-annotation
   1. Erstens kommentieren Sie das raffinierte Transkriptom HMMER gegen Pfam Datenbank^26,29verwenden.
   2. Zweitens, kommentieren Sie das Transkriptom mit BLASTP gegen die UniProt Datenbank^27,28.
   3. Drittens, kommentieren Sie das Transkriptom mit BLASTP gegen die kodierenden Sequenzen von ausgewählten Insekten mit veröffentlichten, kommentierte Genomen.
   4. Zuletzt das Transkriptom mit BLASTP gegen die Erbse Blattlaus-Protein-Datenbank nur mit Anmerkungen versehen.
   5. Verwenden Sie Trinotate, um GO-Anmerkungen aus UniProt Beitritte zu generieren.
   6. Verwenden Sie Trinotate, organisieren die Annotation-Ergebnisse in einer SQLite-Datenbank und einen Annotation-Bericht generieren.
7. Differentielle Expressionsanalyse
   Hinweis: Mit der raffinierten Transkriptom als Referenz, ausrichten und jede Bibliothek separat zu quantifizieren.
   1. Verwenden Sie Trimmomatic, um Qualität-Filter und schneiden Sie die ursprünglichen Dateien lesen Sie³².
      Hinweis: Wenn Sie diesen Schritt nach einer Trinity Montage durchführen, kann man stattdessen die Trimmomatic Ausgabe von diesem Schritt verwenden.
   2. Führen Sie für jede Probe mit Bowtie2³³lokalen Achsen.
   3. Jede Probe individuell mit SAMtools³⁴entziehen Sie lesen Sie Grafen.
   4. Berechnen Sie die differentielle Expression zwischen Proben mit DESeq2 mit den Standardparametern und eine parametrische passen³⁵.

(7) qPCR Überprüfung der differenziell ausgedrückt Gene

Hinweis: Wenn Benutzer in differentiell exprimierten Genen ihrer RNAseq Experimente interessiert sind, das folgende Protokoll lässt sich Muster der differentielle Expression zu überprüfen.

1. RNA-Proben zu generieren, wie oben (Schritt 5) beschrieben.
2. Quantitate RNA-Extraktion mit einem Spektralphotometer für die Qualität zu überprüfen und die Konzentration zu erhalten.
3. CDNA Proben mit einem kommerziell erhältlichen Kit nach Empfehlung des Herstellers zu synthetisieren.
4. Bestimmen Sie die Grundierung Wirkungsgrade für Gene von Interesse, präzise zweifache PCR Verstärkung zu gewährleisten.
   1. Basierend auf der ursprünglichen RNA-Konzentrationen, Verdünnungsreihen durchführen (10¹) 3 cDNA-Konzentrationen zu erhalten.
   2. Mit einer quantitativen PCR-master-Mix, dreifacher qPCR Reaktionen nach der Hersteller-Protokoll mit drei Grundierung Konzentrationen mischen (z. B. 100 nM, 200 nM, 300 nM) mit drei seriell verdünnt cDNA-Konzentrationen (z. B. 0,1 ng/µL, 10 ng/µL, 100 ng/µL).
   3. Berechnen Sie für jedes Zielgen die Steigung (m) der Linie erstellt, indem die mittlere C-_t -Werte für jede Probe als die abhängigen Variablen und das Protokoll (cDNA Konzentration) als unabhängige Variablen (drei Punkte insgesamt).
   4. Verwenden Sie die folgende Gleichung, um die Grundierung Effizienz (E) zu berechnen wo m ist die Steigung in 7.4.3 berechnet:
      E = 10^(-1/m)
      Hinweis: Primer Wirkungsgrade zwischen 90-110 % eignen sich für Analysen. Dieser Prozess garantiert gleich Verstärkung aller Gene in die Berechnungen einbezogen.
5. Verwenden Sie die ΔΔC_t -Methode mit einem Zimmermädchen-gen, um die differentielle Expression für Gene Interesse³⁶zu quantifizieren.

Kulturen zu Pflanzen: Samen dauert etwa zwei bis vier Wochen, je nach Jahreszeit, um groß genug, um wieder vergossen (Abb. 1A). Neu eingetopften Pflanzen dauert weitere zwei bis vier Wochen auf eine optimale Größe für Blattlaus Kulturen (Abbildung 1B) wachsen.

Blattlaus Kulturen: Erwachsenen A. Nerii zeichnen sich durch einige abgedunkelten Cauda und möglicherweise unwinged (apterous, Abbildung 3A, B) oder geflügelten (alate, Abbildung 3C, D). Entwickelnden Flügel Pads werden sichtbar, wenn Nymphen die dritte Instar (Abbildung 3E, F) erreichen. Stammkulturen werden am besten durch die Übertragung von ein bis drei Mid Instar und ein Erwachsenen-Alter unwinged Blattläuse gepflegt; Dies sorgt für ein gesundes, gemischte Bevölkerung im Alter. Bevölkerung für Experimente verwendet werden sollten mit unwinged Blattläuse wie beschrieben (2.4) kultiviert werden. 1 A. Nerii Erwachsenen kann 3-10 Nachkommen pro Tag, abhängig von der Wirtspflanze und Blattlaus-10Jahre produzieren.

DNA und RNA-Extraktion: Einzelne, Erwachsene A. Nerii erbringt ca. 100 – 200 ng/µL DNA (80 µL Elution; Abbildung 4 ( A) und 150 – 300 ng/µL RNA (30 µL Elution; Abbildung 4 ( B). Vertreter Mikrosatelliten Gipfel sind in Abbildung 5dargestellt. Repräsentative relative Expression eines Gens der Kandidat unter drei Bedingungen (Kontrolle, Behandlung 1 Behandlung 2) sind in Tabelle 2 berechnet und in Abbildung 6dargestellt.

Abbildung 1 : Repräsentative Anlagen für Blattlaus Kulturen. (A) Sämlinge können wieder vergossen werden, nachdem sie ihre ersten vollständigen Satz der Laubblätter entwickelt haben. (B) Pflanzen können für Blattlaus Kulturen verwendet werden, wenn sie 3-4 Sätze der Laubblätter entwickelt haben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Beispiele für Hilfsmittel für das Züchten Blattläuse. (A) Mund Pipetten mit ID 3/16" x 1/4" OD Kunststoffschlauch, ein 1.000 µL Pipettenspitze und eine 200 µL PIPETTENSPITZE erstellt werden können. (B, C) Verwenden Sie Tasse Käfige (klare Plastikbecher mit der Spitze abgeschnitten und mit feinmaschigen gesichert) sicher oberhalb des 4 Zoll Töpfe verwendet für Blattlaus Kulturen passen. Dies ermöglicht für viel Licht und Belüftung, ein geeignetes Umfeld für die Blattläuse und Werk zu schaffen, und hält die Blattläuse enthaltenen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Repräsentative Erwachsene und Nymphe Aphis Nerii. (A, B) Apterous (unwinged) Erwachsenen A. Nerii sind mit abgedunkelten Cauda an ihrem hinteren Ende gekennzeichnet. (C, D) Alate (geflügelte) Erwachsene sind gekennzeichnet durch voll entwickelte Flügel und verdunkelt Cauda auf ihr Hinterteil. (E, F) Entwickelnde A. Nerii Nymphen vier Instar Stadien durchlaufen und Entwicklung Flügel Pads werden während der dritten Phase von Instar deutlich. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Repräsentative Gele. (A) DNA Extraktionen (1 kb Leiter). 7 A. Nerii DNA Extraktionen werden in Bahnen 3-9 visualisiert. Negative Kontrolle ist in Gasse 10. (B) RNA-Extraktion. Elf A. Nerii RNA Extraktionen werden in Bahnen 3-13 visualisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5 : Vertreter Mikrosatelliten Gipfeln. 6-FAM-markierten Gipfel sind in blau dargestellt. LIZ-500 Leiter ist Orange dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6 : qPCR Überprüfung eines differentiell exprimierten Gens. Repräsentative mRNA relative Menge (RQ) Ausdruck (berechnet mit der ΔΔCt-Methode, Tabelle 2) zeigt für ein Kandidaten-gen des Interesses unter drei Bedingungen: Kontrolle, Behandlung 1 Behandlung 2. Diagramm zeigt verminderte Expression des Gens der Kandidat unter Behandlungen 1 und 2 im Vergleich zur Kontrolle (Tabelle 2). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1: Mikrosatelliten-Primer-Sequenzen zur Genotyp APHIS nerii 20 .

Tabelle 2: Berechnungen für qPCR-ΔΔC t Prüfung der Kandidaten-gen. Kandidaten-gen-Expression ist relativ zu ef1a berechnet (Abbildung 6). 1.1-1.6 dar, die unter der Kontrolle der Behandlung sechs biologische repliziert Proben; Proben die sechs biologische Behandlung 1 repliziert 2.1-2.6 repräsentieren; Muster 3.1-3.6 repräsentieren sechs biologische Behandlung 2 repliziert. Ct Std. Dev. errechnet sich aus drei technischen repliziert.

Die Autoren haben nichts preisgeben.