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Methodenartikel

Multimodale Biolumineszenz und Positronic-Emissions-Tomographie/Computational Tomographie Bildgebung des multiplen Myeloms Knochenmark Xenotransplantate NOG Mäuse

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DOI:

10.3791/58056

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7. Januar 2019

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1Greater Los Angeles Veteran Administration Healthcare System, 2San Diego Veterans Administration Healthcare System, 3University of California, Los Angeles, 4Perkin Elmer

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier verwenden wir Biolumineszenz, Röntgen und Positronen-Emissions-Tomographie/berechnet Tomographie Bildgebung wie hemmende mTOR-Aktivität zu studieren Auswirkungen des Knochenmarks pfropfte Myelom Tumoren in einem Xenograft-Modell. Dies ermöglicht eine physiologisch relevante, nicht-invasive und multimodalen Analysen der Anti-Myelom-Wirkung von Therapien gezielt Knochenmark pfropfte Myelom Tumoren in Vivo.

Zusammenfassung

Multiples Myelom (MM) Tumoren Einheilungschancen im Knochenmark (BM) und ihr Überleben und ihren Verlauf sind abhängig von komplexen molekularen und zellulären Interaktionen, die innerhalb dieser Mikroumgebung vorhanden sind. Noch dürfen nicht der BM Mikroumgebung leicht replizierten in Vitro, die potenziell die physiologische Relevanz viele in-vitro- und ex-Vivo experimentelle Modelle beschränkt. Diese Probleme können überwunden werden, durch die Verwendung eines Xenograft-Modells in die Luciferase (LUC)-transfizierten Zellen 8226 MM werden speziell in der Maus Skelett Einheilungschancen. Wenn diese Mäuse das entsprechende Substrat gegeben sind, kann durch Messung der Biolumineszenz Bilder (BLI) produziert von den Tumoren in VivoD-Luciferin, die Auswirkungen der Therapie auf Tumorwachstum und überleben analysiert werden. Eine Zusammenführung dieser Daten BLI mit positronic-Emissions-Tomographie/computergestützte Tomographie (PET/CT) Analyse mit dem metabolischen Marker 2-Deoxy - 2-(18F) Fluoro-D-Glucose (18F-FDG) wird verwendet, um Veränderungen im Stoffwechsel Tumor im Laufe der Zeit zu überwachen. Diese bildgebenden Plattformen ermöglichen mehrere nichtinvasive Messungen innerhalb der Tumor/BM Mikroumgebung.

Einleitung

MM ist eine unheilbare Krankheit, bestehend aus bösartigen Plasma B-Zellen, die die BM zu infiltrieren und Knochenabbau, Anämie, Niereninsuffizienz und Infektion verursachen. MM macht sich 10-15 % aller malignen hämatologischen Erkrankungen1 und ist die häufigste Krebserkrankung, das Skelett2einzubeziehen. Die Entwicklung von MM ergibt sich aus der onkogenen Transformation der langlebigen Plasmazellen, die in den germinal Zentren der lymphatischen Geweben hergestellt werden, bevor Sie schließlich an die BM3homing. Die BM zeichnet sich durch sehr heterogen Nischen; wie vielfältige und kritischen zelluläre Komponenten, Regionen der niedrigen pO2 (Hypoxie), umfangreiche Vaskularisierung, komplexen extrazellulären Matrizen und Cytokine und Wachstumsfaktoren Netzwerke, die auf MM Tumorgenesis4beitragen. Somit wäre die Entwicklung eines disseminierten MM Xenograft-Modells zeichnet sich durch Tumoren, die streng in der BM aufgeprägt sind ein sehr mächtiges und klinisch relevante Werkzeug MM Pathologie in Vivo5,6zu studieren. Zahlreiche technische Hürden können jedoch die Wirksamkeit der meisten Xenograft-Modelle, so dass sie kostspielig und schwierig anzuwenden einschränken. Dazu gehören Probleme im Zusammenhang mit konsistent und reproduzierbare Tumor Engraftment innerhalb der BM-Nische, eine längere Zeit zur Entwicklung von Tumoren und Einschränkungen in der Fähigkeit, direkt beobachten und Messen von Veränderungen der Tumor Wachstum/überleben ohne Opfern Sie Mäuse im Verlauf des Experiments7,8.

Dieses Protokoll verwendet eine modifizierte Xenograft-Modell, das ursprünglich von Miyakawa Et Al. entwickelt wurde 9, in denen eine intravenöse (IV) Herausforderung mit Myelom-Zellen ergibt "verbreitet" Tumoren, die konsequent und reproduzierbar in BM NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) Mäuse10weiterhin. Die in Situ -Visualisierung dieser Tumoren wird erreicht, indem die beständigen Transfection 8226 menschlichen MM-Zell-Linie mit einem LUC Allel und seriell messen die Veränderungen in der BLI durch diese eingepflanzt Tumor Zellen6produziert. Wichtig ist, kann dieses Modell erweitert werden um verschiedene andere LUC exprimierenden menschlichen MM Zelllinien (z. B.U266 und OPM2) zu verwenden mit einer ähnlichen Neigung, speziell in das Skelett von NOG Mäusen Einheilungschancen. Die Identifizierung der Tumoren durch Biolumineszenz-Bildgebung der Mäuse gefolgt wird durch die Messung der Aufnahme von radiopharmazeutischen Sonden (z. B. 18F-FDG) von PET/CT zusammen, dadurch für zusätzliche Charakterisierung von kritischen biochemischen wegen (z.B. Veränderungen im Stoffwechsel, Änderungen in Hypoxie und die Induktion der Apoptose) innerhalb der Tumor/BM Mikroumgebung. Die großen Stärken dieses Modells können hervorgehoben werden, durch die Verfügbarkeit einer breiten Palette von radioaktiven, Biolumineszenz und fluoreszierende Sonden und Markierungen, die verwendet werden können, um MM Fortschreiten und Pathologie in Vivozu untersuchen.

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Protokoll

Alle tierische nachstehend beschriebene Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Verwendung Committee (IACUC) von den größeren Los Angeles VA Healthcare System genehmigt und steril und Pathogen-freies Bedingungen durchgeführt wurden.

1. Vorbereitung der Luciferase exprimierenden 8226 Zellen (8226-LUC)

  1. Pflegen der menschlichen MM Zelllinie 8226 in RPMI-1640 Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid (CO2) ergänzt.
  2. Stabile LUC exprimierenden Reporter 8226 Zellen zu generieren von transfecting 1 x 106 8226 Zellen mit einem Luciferase Reporter Vektor, gefolgt von einer Auswahl mit Hygromycin (100-350 mg/mL) wie oben beschrieben6.
  3. Pflegen Sie die Zellen unter sterilen Kultivierung Standardbedingungen für 2-3 Wochen, ändern des Mediums täglich, bis die Einrichtung einer stabil transfizierten 8226 Zelllinie generiert wurde.
  4. Bestätigen Sie die in-vitro- Luciferase-Aktivität in 1 x 106 transfizierten Zellen/100 µL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Zugabe des Substrates Luciferase, D-Luciferin (150 µg/mL Arbeitslösung in vorgewärmte Kulturmedium), und die Messung der Biolumineszenz der Zellen in einem Reagenzglas oder einer 96-Well-Platte mit einem Luminometer6.

(2) orthotopen Xenograft-Modell

  1. Pflegen Sie NOG Mäuse (4-6 Wochen alt, männlich oder weiblich) unter sterilen/Pathogen-freies Bedingungen in einer Einrichtung für entsprechende Pflege der Tiere.
  2. IV-Injektion in die NOG Mäuse (~ 5 x 106 Zellen/Maus) am Tag des Experiments 8226 LUC-transfizierten Zellen vorbereiten. Waschen Sie die Zellen 3 X in eiskaltem PBS, zählen sie, und sie in eiskaltem PBS (minus Antibiotika und FBS) auf eine Endkonzentration von 5 x 106 Zellen/200 µL PBS Aufschwemmen) in ein steriles Röhrchen. Halten Sie die Zellen auf dem Eis und fordern Sie die Mäuse so schnell wie möglich (innerhalb von 30-120 min).
  3. Betäuben Sie die Maus (mit Isofluran, 1 % - 3 % in der Luft bei 0,5 - 1 L/min) zu und legen Sie das Tier in Rückenlage auf ein Heizkissen mit dem Kopf nach entfernt. Überprüfen Sie die Höhe der Anesthetization durch Kneifen der Zehs. Ophthalmologische Salbe auf die Augen anwenden.
  4. Die 8226-LUC-Zellen in den Mäusen durch die Rute Vene (200 µL/Injektion) mit einer 1 mL Spritze mit Insulin und eine 26-G-Nadel zu injizieren.
    Hinweis: Eine Wärmelampe kann verwendet werden, um Rute, damit die Vene Dilatation und Erhöhung der Wirksamkeit von Injektionen warm.
  5. Zurückkehren Sie das Tier zu ihrem Hause Käfig und überwachen Sie die Tiere zu, bis sie sich vollständig erholt haben.
  6. Bestätigen Sie das Engraftment 8226-LUC Zellen in der Maus Skelett durch Messung der BLI bei narkotisierten Mäusen (unten beschrieben und dargestellt in Abbildung 1A).
    Hinweis: BM Exsudate können auch für menschliche CD45 Ausdruck mit Durchflusszytometrie (Abbildung 1 b) oder durch die Immunohistochemistry geernteten Knochen (Abbildung 1) gebeizt werden.

3. Messung der BLI In Vivo

Hinweis: In der Regel messbar BLI aus eingepflanzt-Tumoren in Mäusen beobachtet werden erste zwischen 10-20 Tage Postchallenge, aber dies kann experimentell ermittelt werden müssen.

  1. Betäuben Sie die Maus (mit Isofluran, 1 % - 3 % in der Luft bei 0,5 - 1 L/min) zu und überprüfen Sie die Höhe der Anesthetization durch Kneifen der Zehs. Gelten Sie ophthalmologische Salbe für die Augen.
  2. Geben Sie dem Tier eine IP-Injektion (200 µL/Injektion) von "in-Vivo-Grade" D-Luciferin Substrat (30 mg/mL in sterilen Kochsalzlösung verdünnt).
  3. Die BLI innerhalb von 5-10 Minuten nach der Injektion von Luciferin Substrat (obwohl die BLI-Aktivität in den Mäusen für bis zu 45-60 min zu beobachten sein kann) zu messen, indem man das narkotisierten Tier in Rückenlage in einem kleinen Tier-imaging-System (Abbildung 2 ). Wählen Sie leuchtende und Röntgenstrahlanalyse und Abrufen von Bildern (Abbildung 3).
    1. Messen Sie die durchschnittliche Ausstrahlung (Photonen/s/cm2/steradian) in ausgewählten Regionen von Interesse (ROIs) über imaging-Software (Abbildung 4).
    2. Das Tier in seiner Heimat Käfig zurück und überwachen, bis es vollständig erholt hat (ca. 15-20 min).

4. Behandlung der Mäuse mit gezielten Therapie

  1. Messen der Grundlinie BLI und zufällig die Tiere in Behandlungsgruppen (4-8 Mäuse/Gruppe).
  2. Behandeln Sie die Mäuse mit einer IP-Injektion (200 µL/Injektion) Temsirolimus (0,2 - 40 mg/kg Maus) mit einer Therapie mit fünf täglichen Injektionen der IP gefolgt von 2 Tage der Ruhe und eine zusätzliche fünf täglichen Injektionen von11.
  3. Messen die Luciferase-Aktivität (Photonen/s/cm2/steradian) 2 X pro Woche wie in Abschnitt 3 und Grundstück von der BLI Umrüstzeit beschrieben. Änderungen im Tumor kann BLI als serielle Bilder von den Mäusen (Abb. 5 b) vorgestellt werden.
    Hinweis: Es wird empfohlen, dass die tägliche Überwachung der Tiere durchgeführt werden, bis sie die folgenden Symptome (in der Regel innerhalb von 45-60 Tage der ersten Challenge) präsentieren: Gewicht Verlust (Verlust von mehr als 10 % bezogen auf das Gewicht vor der Implantation) und/oder Hind Extremität Lähmung, zu welchem Zeitpunkt sie mit einer CO2 Kammer gefolgt von zervikale Dislokation eingeschläfert werden sollte.

5. PET/CT-Analyse mit 18F-FDG nach Maß im Tumor Stoffwechsel ändert

  1. Schnell die Tiere in ihrer Heimat Käfig durch das Entfernen ihrer Nahrung für 24 h vor dem Experiment, überschüssige unspezifischen Aufnahme von 18F-FDG zu vermeiden.
  2. Bereiten Sie 18F-radioaktiv FDG-PET-Sonden (50-100 µCi/Injektion in steriler Kochsalzlösung) am Tag des Experiments. Nehmen Sie die Zeit und die Aktivität des Prüfpunkts 18F-FDG mit ein Dosis-Kalibrator.
    Hinweis: Da das 18F hat eine relativ kurze Halbwertszeit (~ 2 h), müssen eine sorgfältige Vorbereitung und Planung für die Verwendung von diesen Proben hergestellt werden.
  3. Betäuben Sie das Tier (mit Isofluran, 1 % - 3 % in der Luft bei 0,5 - 1 L/min) zu und legen Sie sie in Rückenlage auf ein Heizkissen mit dem Kopf nach entfernt. Überprüfen Sie die Höhe der Anesthetization durch Kneifen der Zehs. Gelten Sie ophthalmologische Salbe für die Augen.
  4. Injizieren der Sonde über die Rute Vene (100 µL/Injektion) mit eine abgeschirmte 1 mL Insulin Spritze und Nadel eine 26-G.
    Hinweis: Eine Wärmelampe kann verwendet werden, um Rute, damit die Vene Dilatation und Erhöhung der Wirksamkeit von Injektionen warm.
  5. Messen Sie die verbleibenden Radioaktivität in der Nadel/Spritze in eine Dosiseichgerät und beachten Sie die Aktivität und die Zeit.
    Hinweis: Die Standardisierung der Maus Inkubation, Dosierung und Timing ist wichtig, Daten Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit zu gewährleisten.
  6. Pflegen Sie die Mäuse unter Narkose und bei 37 ° C mit einem Heizkissen während des gesamten Zeitraums der Sonde Aufnahme (~ 45-90 min).
    Hinweis: Es ist wichtig, dass die Mäuse bleiben ruhenden und bei 37 ° C, unspezifische Aufnahme der Sonde zu vermeiden.
  7. Staffeln Sie die Injektionen des Prüfpunkts 18F-FDG in ca. 20 - 30 min Intervallen um ähnliche Kennzeichnung Zeiten bei den Mäusen zu gewährleisten.
    Hinweis: Richtige Workflow und Timing der Sonde Injektionen optimale und reproduzierbare imaging Bedingungen führen.
  8. Messen Sie die 18F-FDG-Aktivität eines PET/CT Small Animal imaging Systems in ausgewählten Regionen von Interesse, die eingepflanzt Tumoren (Abbildung 6) entsprechen.
    Hinweis: Zunächst ein 10-min statische PET Belichtung und eine 2-min CT Belichtung empfohlen, aber die genaue Belichtungszeiten müssen experimentell bestimmt werden.
  9. Die Tiere in ihrer Heimat Käfige zurück und überwachen sie erst vollständig erholt. Haus der Mäuse in einem eigenen Rückkehr Saal für 24 h während der Sonde zerfällt, Hintergrund-Niveaus.
    Hinweis: Wegen der kurzen Halbwertszeit von 18F, können mehrere Messungen mit einer frischen Sonde regelmäßig 2 X pro Woche erfolgen.

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Ergebnisse

In ersten Pilotstudien entwickeln IV Injektionen von 8226-LUC Zellen in NOD/SCID Mäuse nicht BM pfropfte MM Tumoren, obwohl plattenepithelialen Tumoren MM leicht waren (100 % Erfolgsquote) gebildet. Im Gegensatz dazu erzeugt IV Herausforderungen mit 8226 Zellen in NOG Mäuse (innerhalb von 15-25 Tage) Tumoren im Skelett (und nur selten geformte Tumoren im nicht-Skelett Gewebe, wie z.B. der Leber oder Milz). Da Tumoren des Skeletts nicht visuell bestätigt werden konnte durch die physisch Un...

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Diskussion

Trotz einer Vielzahl von präklinischen Xenograft Modelle MM6,9,11,12,13bleibt die Fähigkeit, die Tumor/BM-Interaktionen innerhalb der BM Mikroumgebung schwierig 14. die hier beschriebenen Techniken ermöglichen die schnelle und reproduzierbare Engraftment 8226-LUC Tumoren Zellen in das Skelett von NOG Mäusen.

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Offenlegungen

Der Autor Kevin Francis ist ein Mitarbeiter von Perkin-Elmer.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine VA-Verdienst-grant1I01BX001532 von der Vereinigte Staaten Abteilung der Veteranen Angelegenheiten biomedizinische Laborforschung und Entwicklung Service (BLRDS), P.F und E.C. erkennt an Unterstützung aus dem VA klinische Wissenschaft R & D Service ( Merit Award-I01CX001388) und VA Rehabilitation R & D Service (Merit Award I01RX002604). Weitere Unterstützung kam von einem UCLA Fakultät Seed Grant, j.k. Diese Inhalte repräsentieren nicht unbedingt die Meinung der uns Department of Veterans Affairs oder der US-Regierung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
8226 humane MyelomzelllinieATCCCCL-155
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Mäuse (NOG)Jackson Labs5557
VivoGlo Luciferin-SubstratPromegaP1041
Hypoxyprobe-1KitHPLHP1-100
PE-CD45 (Klon H130)BD Biosciences555483Wird für die Durchflusszytometrie verwendet, um humane CD45+-Tumorzellen in BM-Exsudat
zu identifizieren Kaninchen Anti-Human-CD45 (Klon D3F8Q)Zellsignalisierung Technologie70527Primärer Antikörper für die Immunhistochemie von exzidiertem Knochen
Ziege Anti-Kaninchen IgG (HRP-konjugiert)ABCAMab205718Sekundärer Antikörper für die Immunhistochemie von exzidiertem Knochen
Dual-Luciferase Reporter Assay SystemPromegaE1910
pGL4.5 Luciferase Reporter VectorPromegaE1310
IVIS Lumina XRMS In Vivo BildgebungssystemPerkin Elmer
Sofie G8 PET/CT BildgebungssystemPerkin Elmer

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Biolumineszenz-ImagingPET/CT-ImagingXenograft-ModellTemsirolimus-BehandlungD-Luciferin-Substrat18F-FDG-SondeKleintier-Imaging
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