Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Summary

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Abstract

Myeloische Vorläuferzellen, die Neutrophilen, Monozyten und dendritischen Zellen (DCs) ergeben können identifiziert und isoliert aus dem Knochenmark von Mäusen für hämatologischen und immunologischen Analysen. Beispielsweise können Studien über die zellulären und molekularen Eigenschaften der myeloischen Vorläuferzellen Bevölkerung enthüllen Mechanismen leukämischen Transformation oder zeigen, wie das Immunsystem reagiert auf Erreger Exposition. Zuvor beschriebenen Flow Cytometry Strategien zur myeloischen Vorläuferzellen Identifikation konnten erhebliche Fortschritte in vielen Bereichen, aber die Fraktionen, die sie identifizieren sind sehr heterogen. Die am häufigsten verwendeten gating Strategien definieren Knochenmark Brüche, die sind für die gewünschte Bevölkerung bereichert, sondern auch zahlreicher "verunreinigen" Vorfahren enthalten. Unsere jüngsten Studien haben viel von dieser Heterogenität gelöst und das Protokoll präsentieren wir hier erlaubt die Isolation der 6 Subpopulationen von Oligopotent und Lineage-committed myeloische Vorläuferzellen von 2 oben beschrieben Knochenmark Brüche. Das Protokoll beschreibt 3 Phasen: (1) Isolierung von Knochenmark Zellen, (2) Bereicherung für hämatopoetische Vorläuferzellen von magnetisch aktivierte Zellsortierung (Linie Abbau von MACS) und (3) Identifikation der myeloischen Vorläuferzellen Teilmengen von Durchflusszytometrie (einschließlich Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren, FACS, falls gewünscht). Dieser Ansatz ermöglicht Stammvater Quantifizierung und für eine Vielzahl von in Vitro und in Vivo Anwendungen isoliert und hat bereits neue Einblick in die Wege und Mechanismen der Neutrophilen, Monocyte und DC Differenzierung geführt.

Introduction

Monozyten, Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) sind myeloische Zellen, die aus hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark, in erster Linie durch einen Prozess namens Myelopoiesis entstehen. Gemeinsamen myeloische Vorläuferzellen (CMPs) haben das Potenzial, myeloische Zellen, als auch Megakaryozyten und Erythrozyten, aber nicht lymphoiden Zellen zu produzieren. Granulozyten-Monocyte Stammväter (GVP), die von CMPs abgeleitet sind, Granulozyten und Monozyten zu produzieren, aber Megakaryocyte und Erythrozyten mögliche verloren haben. Monozyten und klassische und plasmazytoide DCs (cDCs/pDCs) sind auch gedacht, um ergeben sich aus gemeinsamen Vorfahren bekannt als Monocyte-DC Stammväter (MDPs), die entstehen durch CMPs. schrittweise Einschränkung der Linie Potenzial letztlich zu Lineage-committed führt Vorfahren: Granulozyt Stammväter, Monocyte Stammväter und dendritischen Zellen Stammväter (Abbildung 1).

Weissman und Kollegen berichteten, dass CMPs im Lin^– c-Kit⁺ Sca-1^– (LKS^–) CD34 gefunden werden⁺ FcγR^lo Bruchteil der Maus Knochenmark, während GVP in der LKS^– CD34 enthalten sind⁺ FcγR ^Hallo Bruchteil¹. Jedoch sind diese "CMP" und "GMP" Fraktionen sehr heterogen. Beispielsweise enthält der "GMP" Bruch auch Lineage-committed Granulozyten Stammväter und Monocyte Stammväter^1,2. MDPs wurden separat berichtet, dass CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ Vorfahren, die auch CD34 und FcγR^3,4Ausdrücken. MDPs geben Anlass zu cDC/pDC-Herstellung von gemeinsamen DC Stammväter (CDPs), die untere Ebenen des c-Kit (CD117) Ausdrücken gemeldet wurden und sind nicht in den LKS^– Teil⁵enthalten.

Zuvor war davon auszugehen, dass Monozyten über einen einzigen Weg (CMP-GMP-MDP-Monocyte) entstehen. Einklang mit diesem Modell, Monocyte begangen Stammväter, produziert von GVP (benannt Monocyte Stammväter, m/s)² und MDPs (benannt gemeinsame Monocyte Vorfahren, cMoPs)⁶ scheinen die gleichen Zellen auf der Grundlage der gemeinsamen Oberfläche Marker Ausdruck . Aber wir vor kurzem gezeigt, dass Monozyten unabhängig von GVP und MDPs produziert werden, und konnten durch einzellige RNA Sequenzierung⁷m/s und cMoPs unterscheiden.

Wir vor kurzem verändert die Weissman "CMP" und "GMP" gating Strategie um 6 Unterfraktionen C57BL/6J Maus Knochenmark mit verschiedenen Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen Teilmengen zu identifizieren. Wir zunächst berichtet, dass für Ly6C und CD115 Färbung die Isolation der Oligopotent GVP und Granulozyten Stammväter (GPs) sowie Monocyte Stammväter (m/s und cMoPs, die wir derzeit nicht in der Lage erlaubt, zu trennen sind) aus dem "GMP" Teil² (LKS ^- CD34⁺ FcγR^Hallo Tor; ( Abbildung 1). Wir später gezeigt, dass MDPs überwiegend in der "CMP" Fraktion gefunden werden (CD34 LKS^{– +} FcγR^lo Tor), die enthält auch Flt3⁺ CD115^lo und Flt3^– Teilmengen⁷ (Abbildung 1 ). Die CMP-Flt3⁺ CD115^lo Bruchteil ergibt GVP und MDPs Adoptiv Übergabe. Die CMP-Flt3^– Teilmenge enthält Stammväter, die Vermittler zwischen CMP-Flt3⁺ CD115^lo Zellen und GVP zu sein scheinen. Im Gegensatz zu MDPs besitzen die CMP-Flt3⁺ CD115^lo und CMP-Flt3^– Fraktionen auch Megakaryocyte und potenzielle Erythrozyten.

Es ist wichtig, Beachten jedoch, dass es derzeit unklar ist, ob die "CMP" Fraktionen Vorfahren enthalten, die sind wirklich Oligopotent (z. B. einzelne Zellen innerhalb der CMP-Flt3⁺ CD115^lo Bruch, die Neutrophilen, besitzen Monocyte, DC Megakaryocyte und potenzielle Erythrozyten), oder alternativ eine Mischung aus Vorfahren mit engeren Linie Potenzial umfassen. Koloniebildenden Assays (Methylcellulose Kulturen) offenbart Zellen mit Granulozyten (Neutrophilen), Erythrozyten, Monocyte und potenzielle Megakaryocyte (GEMM Zellen) in der "CMP" CMP-Flt3⁺ CD115^lo und CMP-Flt3^– Fraktionen^{1 ,7}, aber nicht zulassen, dass die Bewertung des DC-Potentials. Im Gegensatz dazu koloniebildenden Assays zeigte die Existenz von Oligopotent GVP (Stammväter mit Neutrophilen und potenzielle Monocyte) im "GMP" Bruchteil^1,2, und dies wird unterstützt durch den letzten einzellige transkriptomischen Analyse⁸. Es ist nicht aktuell, aber bekannt, ob diese Oligopotent GVP auch andere Granulozyten (Eosinophile, Basophils und Mastzellen produzieren).

Basierend auf diesen Studien zeigen wir nun wie 7 Marker (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C und CD115) Oberfläche lässt sich identifizieren und isolieren diese 6 Teilmengen von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen. Das hier beschriebene Protokoll kann angewendet werden, für in-vitro- Kultur Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente bei Mäusen und molekulare Analyse (Bulk- und einzellige RNA-Sequenzierung, Western blotting, usw.).

Das Protokoll besteht aus 3 Phasen: (1) Vorbereitung einer einzelnen Zelle Suspension des Knochenmarks Zellen, (2) Bereicherung für hämatopoetische Vorläuferzellen (magnetisch aktivierte Zellsortierung), und (3) Identifizierung und Isolierung, falls gewünscht, der Stammvater Teilmengen von Flow zytometrie (mit einem Analysator oder einen Sorter je nach Bedarf). Der erste Schritt ist die Isolierung von Knochenmarkzellen aus dem Oberschenkelknochen und Schienbeine euthanasierten Mäuse und ist vergleichbar mit anderen zuvor beschriebenen Protokolle⁹. Als nächstes wird die Probe für die Stamm- und Vorläuferzellen Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern gegen Zelle oberflächenmarker der Erythrozyten, Neutrophilen, Monozyten, Lymphozyten usw. , die differenzierte Zellen zum Abbau bereichert. Dies ist nicht obligatorisch, aber dringend empfohlen, Erkennung der Stammvater Teilmengen zu optimieren und reduzieren die Menge der Stammvater Identifizierung benötigten Antikörper und der Zeitaufwand für Durchflusszytometrie. Die Linie Erschöpfung Protokoll unten beschreibt Magnetic-Activated Zelle Sortieren (MACS) mit einem Maus-Linie Zelle Erschöpfung-Kit (enthält biotinylierte Antikörper gegen CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, und Ter-119, plus Anti-Biotin Microbeads) und eine automatisierte Magnetabscheider. Der letzte Schritt ist die Identifizierung (und sortieren, wenn gewünscht) der Stammvater Teilmengen von Durchflusszytometrie. Die Antikörper-Panel unten beschrieben (siehe auch Tabelle 1) wurde entwickelt, um in einem Durchflusszytometer (Analysator oder Sortierer) mit 4 Laser verwendet werden (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Abbildung 1: Neutrophilen, Monocyte und DC Stammväter und Differenzierung Wege. Die kürzlich überarbeitete Modell der Myelopoiesis⁷ ist mit die Weissman Tore für "CMPs" (blau) und "GVP" (grün)¹ überlagert dargestellt. Diese Zahl wurde von Yáñez Et Al. 2017⁷geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Cedars-Sinai Medical Center genehmigt.

1. Isolation aus Maus Knochenmark und Vorbereitung einer einzelnen Zelle Suspension

1. Die Maus nach institutionellen Richtlinien einschläfern.
2. Platzieren Sie die euthanasierten Maus auf dem Rücken und Besprühen Sie sie mit 70 % igem Ethanol (EtOH). Machen Sie einen klein (3-5 mm) Schnitt in jeder Hind Gliedmaßen an den Knöchel mit einer scharfen, Spitzen Schere und hochziehen der Haut in Richtung des Körpers von den Beinen zu entfernen und setzen die Muskeln und Knochen.
3. Entfernen Sie die Muskeln (Quadrizeps, Beinbeuger, etc.) aus den Knochen, Zuschneiden mit einer Schere, nach der Richtung des Knochens. Achten Sie darauf, nicht die Knochen beschädigt.
4. Verrücken der Oberschenkelknochen aus den Hüftgelenken und schneiden Sie das Bindegewebe und die Muskulatur, lösen Sie die Beine, wobei Sie darauf achten, nicht in den Knochen geschnitten.
5. Entfernen Sie die Füße von den Knöcheln aus den Gebeinen disloziert, die Knochen in einem Rohr von sterilen PBS oder Medien zu platzieren und auf Eis in der Gewebekultur Raum zu transportieren.
   Hinweis: Für einige andere Anwendungen (z. B. Makrophagen aus insgesamt Knochenmarkzellen Ableitung) ist es möglich, die Knochen auf Eis für eine Weile zu verlassen, aber für Stammvater Isolierung ist es wichtig, so schnell wie möglich zu vermeiden Downregulation der vorzugehen wichtig oberflächenmarker (vor allem CD115).
6. Entfernen Sie in eine biologische Kabinett alle übrigen Weichteile aus den Knochen durch Reiben mit Seidenpapier.
   Hinweis: Das Protokoll sollte in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden, wenn eine sterile Probe für Zelle Kultur oder in Vivo Tests nach FACS Sortierung erforderlich ist. Wenn sterile Zellen nicht erforderlich sind, kann der gesamte Prozess auf dem Labortisch durchgeführt werden.
7. Kurz Tauchen die Knochen in 70 % EtOH zu Ihnen, und dann in sterile PBS zu waschen desinfizieren.
8. Trennen Sie der Oberschenkelknochen aus den Gebeinen und Fibeln durch Durchtrennung des Knies zu und entsorgen Sie die Fibeln.
9. Kürzen Sie die Enden aus den Knochen mit einer scharfen Schere.
10. Ernten Sie Knochenmark mit kalten sterilen PBS wie folgt, bis die Knochen weiß erscheinen:
    1. Jeder Knochen mit einer Pinzette greifen und Nadel 26G mit einer 10 mL Spritze mit kalten sterilen PBS in den knochenschaft an einem Ende verbunden.
    2. Halten Sie den Knochen über eine 50 mL Zentrifugenröhrchen und spülen Sie 2-5 mL PBS durch den Knochen, das Knochenmark zu ernten.
    3. Das Knochenmark aus allen 4 Knochen per Mausklick (2 Oberschenkelknochen und 2 Tibien) zu ernten.
11. Pipette vorsichtig nach oben und unten mit einer 1-mL-Pipette auf das Knochenmark bilden eine Zellsuspension disaggregieren.
12. Filtern Sie das Knochenmark Fahrwerk durch ein Stück 30 μm-Nylon-Mesh zu beseitigen Sie Knochen-Stücke und Zell-Aggregate, dadurch erzeugt eine einzelne Zellsuspension.
13. Zentrifuge die einzigen Zellsuspension bei 280 X g für 5 min und Aufschwemmen der Zelle Pellet in sterilen Färbung Puffer (PBS + 0,5 % FBS + 2 mM EDTA), Verwendung von 5 mL Puffer pro Maus (z. B. 10 mL für Zellen, die aus dem Oberschenkelknochen und Tibien 2 Mäuse gebündelt) Färbung.
14. 10 μL aliquoten der Probe zu nehmen, mischen Sie es mit 10 μL Trypan blau und Last 10 μL der daraus resultierenden Trypan blau-markierten Probe auf einem Hemocytometer. Zählen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop.
    Hinweis: Wenn die Zellen für die zuverlässige Zählung zu konzentrieren, verdünnen Sie die Probe vor dem Hinzufügen Trypan blau.

(2) Stammvater Bereicherung durch magnetische aktiviert Zelle Sortieren (MACS)

1. Zentrifugieren Sie die gesamte einzelne Zellsuspension (oder so viele Zellen als sind erforderlich, um den gewünschten Ertrag zu erhalten) 280 X g für 5 min bei 4° C und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 40 μl Puffer (PBS + 0,5 % FBS + 2 mM EDTA) pro 10⁷ Zellen Beflecken.
   Hinweis: Es ist auch möglich, MACS-Puffer von Linie Erschöpfung der Hersteller zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) als Alternative zu den befleckenden Puffer.
2. Führen Sie die Linie Erschöpfung nach den Anweisungen, die mit der Linie Erschöpfung Kit geliefert. Die folgenden Anweisungen gelten für das Kit in der Tabelle der Materialienzu sehen. Wenn eine andere Kit verwendet wird, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und dann fahren Sie mit Schritt 2.3.
   1. Fügen Sie 10 μL Biotin-Antikörper Cocktail pro 10⁷ Zellen hinzu, mischen Sie, indem Sie pipettieren und 10 min bei 4 ° c inkubieren
   2. Fügen Sie 30 μl Puffer/MACS Färbung Puffer pro 10⁷ Zellen und mischen.
   3. Fügen Sie 20 μl Anti-Biotin Microbeads pro 10⁷ Zellen. Gut mischen und eine weitere 15 min bei 4 ° c inkubieren
      Hinweis: Vortex Microbeads vor Aufnahme in die Zellen um sicherzustellen, dass sie völlig zerstreut sind.
   4. Fügen Sie 1 mL Puffer/MACS-Puffer pro 10⁷ Zellen Beflecken, Zentrifugieren der Zellen bei 280 X g für 5 min und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 μl Färbung Puffer/MACS-Puffer für bis zu 10⁸ Zellen. Für mehr als 10⁸ Zellen das Volumen der Färbung Puffer/MACS-Puffer entsprechend skalieren.
   5. Bereiten Sie die automatisierte Magnetabscheider gemäß den Anweisungen des Herstellers.
   6. Legen Sie die Röhrchen mit den markierten Zellen in den Separator und wählen Sie das negative Auslese-Programm.
   7. Sammeln Sie die negativen Fraktion, die die Stammvater angereicherte Abstammung-Negative (Lin^–) Zellen enthält. Entsorgen Sie die positive Fraktion, die magnetisch-markierten Linie-positiven Zellen enthält.
3. Lin^– Zellen bei 280 X g für 5 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL Puffer/MACS-Puffer pro Maus (z. B. 4 mL wenn Knochenmark aus 2 Mäuse gebündelt wurde) Färbung.
   Hinweis: Das Pellet sollte nun weiß statt rot, weil die Erythrozyten aufgebraucht haben.
4. 10 μL aliquoten Lin^– -Zellen nehmen, mischen Sie es mit 10 μL Trypan blau und Last 10 μL der daraus resultierenden Trypan blau-markierten Probe auf einem Hemocytometer. Zählen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop.
   Hinweis: Wenn die Zellen für die zuverlässige Zählung zu konzentrieren, verdünnen Sie die Probe vor dem Hinzufügen Trypan blau.

(3) myeloischen Vorläuferzellen Identifizierung und Isolierung von Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS)

1. Label-9 (1,5 oder 2 mL) Mikrozentrifugenröhrchen für: (1) ungefärbten Zellen, 2-8) einzelne Zellen befleckt mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern gegen FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C und CD115 für Auswahl und Farbe Spannungskompensation und 9) Sample-Zellen mit allen 7 Antikörper zum Stammvater Identifikation und Sortieren gefärbt werden.
2. Verteilen Sie 100.000 Zellen zu jedem kontrollröhrchen (Röhren 1-8), und die verbleibenden Zellen (oder weniger wenn gewünscht) an das Probenröhrchen (Rohr 9).
   Hinweis: Wenn das Probenvolumen größer als 1,5-2 mL ist, kann es sein erforderlich, verteilen Sie die Sample-Zellen in eine 15 mL-Tube, Zentrifugieren sie Aufschwemmen Pellet (Schritt 3.3 unten) und übertragen Sie dann die Zellen zu einem Microcentrifuge Schlauch für die nachfolgenden Färbung Schritte.
3. Die Zellen bei 1.500 x g für 5 min zentrifugieren und erneut die Kontrolle Rohr Pellets in 100 μl Puffer (PBS + 0,5 % FBS + 2 mM EDTA) und der Probe Tube Pellet in 100 μl Färbung Färbung Puffer pro 5 x 10⁶ Zellen (z. B. 200 μL für 1 x 10⁷ Zellen).
4. Die FcγR einzelner Fleck und die Probenrohr 2 μg/mL Anti-CD16/CD32-APC-Cy7 hinzufügen. Wirbel sanft zu mischen und 10 min bei 4 ° c inkubieren
   Hinweis: Es ist wichtig, die Sample-Zellen mit dem FcγR (CD16/32) Antikörper vor dem Hinzufügen der anderen Antikörper um Wettbewerb aufgrund unspezifischer Fc-vermittelten Antikörperbindung zu verhindern zu beflecken. Inkubieren Sie die Zellen nicht mit einer FcγR Reagenz zu blockieren.
5. Die entsprechenden einzelnen Fleck Röhren (1 Antikörper) und das Probenröhrchen (alle 6 Antikörper) die andere Antikörper hinzufügen: 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 und 4 μg/mL CD115-PE. Wirbel sanft, und 15 min bei 4 ° c inkubieren
6. Fügen Sie 900 μL Färbung Puffer um die kontrollröhrchen und Färbung Puffer 1 mL pro 10⁷ Zellen in das Probenröhrchen. Die Zellen bei 1.500 x g für 5 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet in der Färbung Puffer: 200 μL pro Steuerrohr und 500 μl pro 25 x 10⁶ Zellen in das Probenröhrchen. Übertragen Sie die resuspendierte Zellen auf 5 mL FACS Rohre.
   Hinweis: Wenn das Probenvolumen größer als 1,5-2 mL ist, möglicherweise es notwendig, die Zellen auf eine 15 mL Tube für Zentrifugation zu übertragen.
7. Bereiten Sie das Durchflusszytometer (Analysator oder Sortierer) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
8. Führen Sie die ungefärbten und einzelne Kontrollzellen durch das Durchflusszytometer Einrichten der Spannungen und Kompensationen Farbe gefärbt.
9. Führen Sie die Sample-Zellen, Tor der Stammvater Teilmengen wie unten beschrieben und in Abbildung 2zusammengefasst und auf Wunsch durchführen FACS sortieren, um die relevanten Stammvater Teilmengen zu isolieren.
   Hinweis: Es ist in der Regel notwendig, etwa 200.000 Zellen um mindestens 1.000 Veranstaltungen in jedem Stammvater Tor zu erhalten zu erwerben.
   1. Erstellen Sie einen Dot-Plot aller Zellen, Anzeige von FSC-A (x-Achse) und SSC-A (y-Achse), und Tor zum Ausschließen von Schmutz und abgestorbenen Zellen = > "live" Zellen.
   2. Erstellen Sie einen Dot-Plot von "lebenden" Zellen, Anzeige von FSC-H (x-Achse) und FSC-W (y-Achse), und um Dubletten auszuschließen gate = > Leben/Unterhemd (FSC) Tor.
   3. Erstellen Sie ein Dot Grundstück Leben/Singulett (FSC) Zellen, SSC-H (x-Achse) und SSC-W (y-Achse), anzeigen und Tor um Dubletten auszuschließen = > Leben/Unterhemd (FSC) / Unterhemd (SSC) Tor.
   4. Erstellen Sie einen Dot-Plot von Leben/Unterhemd (FSC) / Unterhemd (SSC) Zellen, Sca-1 (x-Achse) und c-Kit (y-Achse), anzeigen und Tor zur c-Kit⁺ Sca-1^– Zellen auswählen = > LKS^– Zellen.
   5. Erstellen Sie einen Dot-Plot LKS^– Zellen, Anzeigen von CD34 (x-Achse) und FcγR (y-Achse) und Tor CD34 auswählen,⁺ FcγR^lo Zellen = > "CMPs" und CD34⁺ FcγR^Hallo Zellen = > "GVP".
      Hinweis: Es ist wichtig, die "CMPs" und "GVP" so exakt wie möglich Tor. Es ist hilfreich, eine pseudofarben Dichte Handlung oder ein konturdiagramm für genaue Anspritzung verwenden.
   6. Erstellen einen Dot-Plot von "CMPs", CD115 anzeigen (x-Achse) und Flt3 (y-Achse) und Tor zum auswählen:
      Flt3⁺ CD115^lo Zellen = > CMP-Flt3⁺ CD115^lo Zellen,
      Flt3^– CD115^lo Zellen = > CMP-Flt3^– Zellen,
      Flt3⁺ CD115^Hallo Zellen = > MDPs.
   7. Erstellen einen Dot-Plot "GVP", Anzeige Ly6C (x-Achse) und FcγR (y-Achse) und Tor Ly6C auswählen,^–Zellen = > "GMP-Ly6C^– -Zellen" und Ly6C⁺ Zellen = > "GMP-Ly6C⁺ -Zellen".
   8. Erstellen einen Dot-Plot "GMP-Ly6C^– -Zellen", Anzeige CD115 (x-Achse) und Flt3 (y-Achse) und Tor zum auswählen:
      Flt3^– CD115^lo Zellen = > GVP.
   9. Erstellen einen Dot-Plot "GMP-Ly6C⁺ Zellen", Anzeige CD115 (x-Achse) und Flt3 (y-Achse) und Tor zum auswählen:
      Flt3^– CD115^lo Zellen = > GPs,
      Flt3^– CD115^Hallo Zellen = > m/s + cMoPs.

Results

Mit der oben beschriebenen Protokoll, ist es möglich, 100 Millionen Zellen (einschließlich der roten Blutkörperchen oder 50 Millionen kernhaltigen Zellen) von Oberschenkelknochen und Schienbeine (2 Beine) ein C57BL/6J Maus (6-8 Wochen alt, männlich oder weiblich) zu erhalten. 1-2 Millionen Lin^– Zellen können per Mausklick durch MACS Depletion von Lin⁺ Zellen isoliert werden.

Jedes der 6 myeloischen Vorläufe...

Discussion

Die Weissman Anspritzung Strategie für Maus myeloischen Vorläuferzellen Kennung¹ wurde der Goldstandard für Immunologen und Hämatologen seit fast 20 Jahren, aber es ist nun offensichtlich, dass die "CMP" und "GMP" Tore sehr heterogen und präziser sind Gating Strategien sind erforderlich. Das Protokoll, das wir hier beschrieben haben ermöglicht die Identifizierung der Oligopotent und Lineage-committed Teilmengen in den Mäusen C57BL/6J für genauere Quantifizierung der spezifischen myeloischen Vorläu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Maus: Wildtyp C57BL/6J (CD45.2)	The Jackson Laboratories	Cat#JAX:000664
Lineage Cell Depletion Kit, Maus	Miltenyi Biotec	Cat#130-090-858
Ratte Anti-Maus CD34 (Klon RAM34) FITC	BD Biosciences	Cat#553733
Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Fcγ R; Klon 93) APC-Cy7	BioLegend	Cat#101327
Ratte Anti-Maus Ly6A/E (Sca-1; Klon 108113) PE-Cy7	BioLegend	Cat#108114
Ratte Anti-Maus CD117 (c-Kit; Klon 2B8) Pacific Blue	BioLegend	Cat#105820
Ratte Anti-Maus Ly6C (Klon HK1.4) PerCP-Cy5.5	BioLegend	Cat#128012
Ratte Anti-Maus CD115 (Klon AFS98) PE	BioLegend	Cat#135506
Ratte Anti-Maus CD135 (Flt3; Klon A2F10.1) APC	BD Biosciences	Cat#560718
CountBright Absolute Counting Beads	Thermo Fisher Scientific	Cat#C36950
AutoMACS Separator	Miltenyi Biotec	N/A	Verwenden Sie das Programm "deplete"
BD LSRFortessa	BD Biosciences	N/A	5 Laser, 15 Farben
BD FACS Aria III Zellsortierer	BD Biosciences	N/A	5 Laser, 13 Farben
FlowJo	FlowJo, LLC	https://www.flowjo.com	Zur weiteren Analyse der .fcs-Dateien