Name: Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung myeloischer Vorläuferzellen aus Mäuseknochenmark mittels MACS- und FACS-Sortierung. Diese Methode ermöglicht präzise Identifikation von sechs Zellsubpopulationen für hämatologische und immunologische Forschung.

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Dieses Protokoll wurde entwickelt mit Mittel aus dem Vorstand der Gouverneure Regenerative Medizin Institut am Cedars-Sinai Medical Center (HSG), eine Karriere in der Immunologie Gemeinschaft von der American Association Immunologen (AY und HSG) und ein Scholar Award aus die American Society of Hematology (zu AY). Wir danken den Flow Cytometry Kern am Cedars-Sinai Medical Center für Hilfe mit FACS sortieren.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) des Cedars-Sinai Medical Center genehmigt.
1. Isolation aus Maus Knochenmark und Vorbereitung einer einzelnen Zelle Suspension
<ol><li>Die Maus nach institutionellen Richtlinien einschläfern.</li>
	<li>Platzieren Sie die euthanasierten Maus auf dem Rücken und Besprühen Sie sie mit 70 % igem Ethanol (EtOH). Machen Sie einen klein (3-5 mm) Schnitt in jeder Hind Gliedmaßen an den Knöchel mit einer scharfen, Spitzen Schere und hochziehen der Haut in Richtung des Körpers von den Beinen zu entfernen und setzen die Muskeln und Knochen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Muskeln (Quadrizeps, Beinbeuger, etc.) aus den Knochen, Zuschneiden mit einer Schere, nach der Richtung des Knochens. Achten Sie darauf, nicht die Knochen beschädigt.</li>
	<li>Verrücken der Oberschenkelknochen aus den Hüftgelenken und schneiden Sie das Bindegewebe und die Muskulatur, lösen Sie die Beine, wobei Sie darauf achten, nicht in den Knochen geschnitten.</li>
	<li>Entfernen Sie die Füße von den Knöcheln aus den Gebeinen disloziert, die Knochen in einem Rohr von sterilen PBS oder Medien zu platzieren und auf Eis in der Gewebekultur Raum zu transportieren. Hinweis: Für einige andere Anwendungen (z. B. Makrophagen aus insgesamt Knochenmarkzellen Ableitung) ist es möglich, die Knochen auf Eis für eine Weile zu verlassen, aber für Stammvater Isolierung ist es wichtig, so schnell wie möglich zu vermeiden Downregulation der vorzugehen wichtig oberflächenmarker (vor allem CD115).</li>
	<li>Entfernen Sie in eine biologische Kabinett alle übrigen Weichteile aus den Knochen durch Reiben mit Seidenpapier. Hinweis: Das Protokoll sollte in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden, wenn eine sterile Probe für Zelle Kultur oder in Vivo Tests nach FACS Sortierung erforderlich ist. Wenn sterile Zellen nicht erforderlich sind, kann der gesamte Prozess auf dem Labortisch durchgeführt werden.</li>
	<li>Kurz Tauchen die Knochen in 70 % EtOH zu Ihnen, und dann in sterile PBS zu waschen desinfizieren.</li>
	<li>Trennen Sie der Oberschenkelknochen aus den Gebeinen und Fibeln durch Durchtrennung des Knies zu und entsorgen Sie die Fibeln.</li>
	<li>Kürzen Sie die Enden aus den Knochen mit einer scharfen Schere.</li>
	<li>Ernten Sie Knochenmark mit kalten sterilen PBS wie folgt, bis die Knochen weiß erscheinen:<ol>
<li>Jeder Knochen mit einer Pinzette greifen und Nadel 26G mit einer 10 mL Spritze mit kalten sterilen PBS in den knochenschaft an einem Ende verbunden.</li>
		<li>Halten Sie den Knochen über eine 50 mL Zentrifugenröhrchen und spülen Sie 2-5 mL PBS durch den Knochen, das Knochenmark zu ernten.</li>
		<li>Das Knochenmark aus allen 4 Knochen per Mausklick (2 Oberschenkelknochen und 2 Tibien) zu ernten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipette vorsichtig nach oben und unten mit einer 1-mL-Pipette auf das Knochenmark bilden eine Zellsuspension disaggregieren.</li>
	<li>Filtern Sie das Knochenmark Fahrwerk durch ein Stück 30 μm-Nylon-Mesh zu beseitigen Sie Knochen-Stücke und Zell-Aggregate, dadurch erzeugt eine einzelne Zellsuspension.</li>
	<li>Zentrifuge die einzigen Zellsuspension bei 280 X g für 5 min und Aufschwemmen der Zelle Pellet in sterilen Färbung Puffer (PBS + 0,5 % FBS + 2 mM EDTA), Verwendung von 5 mL Puffer pro Maus (z. B. 10 mL für Zellen, die aus dem Oberschenkelknochen und Tibien 2 Mäuse gebündelt) Färbung.</li>
	<li>10 μL aliquoten der Probe zu nehmen, mischen Sie es mit 10 μL Trypan blau und Last 10 μL der daraus resultierenden Trypan blau-markierten Probe auf einem Hemocytometer. Zählen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop. Hinweis: Wenn die Zellen für die zuverlässige Zählung zu konzentrieren, verdünnen Sie die Probe vor dem Hinzufügen Trypan blau.</li>
</ol>(2) Stammvater Bereicherung durch magnetische aktiviert Zelle Sortieren (MACS)
<ol><li>Zentrifugieren Sie die gesamte einzelne Zellsuspension (oder so viele Zellen als sind erforderlich, um den gewünschten Ertrag zu erhalten) 280 X g für 5 min bei 4° C und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 40 μl Puffer (PBS + 0,5 % FBS + 2 mM EDTA) pro 107 Zellen Beflecken. Hinweis: Es ist auch möglich, MACS-Puffer von Linie Erschöpfung der Hersteller zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) als Alternative zu den befleckenden Puffer.</li>
	<li>Führen Sie die Linie Erschöpfung nach den Anweisungen, die mit der Linie Erschöpfung Kit geliefert. Die folgenden Anweisungen gelten für das Kit in der Tabelle der Materialienzu sehen. Wenn eine andere Kit verwendet wird, folgen Sie den Anweisungen des Herstellers und dann fahren Sie mit Schritt 2.3.<ol>
<li>Fügen Sie 10 μL Biotin-Antikörper Cocktail pro 107 Zellen hinzu, mischen Sie, indem Sie pipettieren und 10 min bei 4 ° c inkubieren</li>
		<li>Fügen Sie 30 μl Puffer/MACS Färbung Puffer pro 107 Zellen und mischen.</li>
		<li>Fügen Sie 20 μl Anti-Biotin Microbeads pro 107 Zellen. Gut mischen und eine weitere 15 min bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Vortex Microbeads vor Aufnahme in die Zellen um sicherzustellen, dass sie völlig zerstreut sind.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL Puffer/MACS-Puffer pro 107 Zellen Beflecken, Zentrifugieren der Zellen bei 280 X g für 5 min und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 μl Färbung Puffer/MACS-Puffer für bis zu 108 Zellen. Für mehr als 108 Zellen das Volumen der Färbung Puffer/MACS-Puffer entsprechend skalieren.</li>
		<li>Bereiten Sie die automatisierte Magnetabscheider gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
		<li>Legen Sie die Röhrchen mit den markierten Zellen in den Separator und wählen Sie das negative Auslese-Programm.</li>
		<li>Sammeln Sie die negativen Fraktion, die die Stammvater angereicherte Abstammung-Negative (Lin–) Zellen enthält. Entsorgen Sie die positive Fraktion, die magnetisch-markierten Linie-positiven Zellen enthält.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lin– Zellen bei 280 X g für 5 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL Puffer/MACS-Puffer pro Maus (z. B. 4 mL wenn Knochenmark aus 2 Mäuse gebündelt wurde) Färbung. Hinweis: Das Pellet sollte nun weiß statt rot, weil die Erythrozyten aufgebraucht haben.</li>
	<li>10 μL aliquoten Lin– -Zellen nehmen, mischen Sie es mit 10 μL Trypan blau und Last 10 μL der daraus resultierenden Trypan blau-markierten Probe auf einem Hemocytometer. Zählen Sie die Zellen mit einem Lichtmikroskop. Hinweis: Wenn die Zellen für die zuverlässige Zählung zu konzentrieren, verdünnen Sie die Probe vor dem Hinzufügen Trypan blau.</li>
</ol>(3) myeloischen Vorläuferzellen Identifizierung und Isolierung von Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS)
<ol><li>Label-9 (1,5 oder 2 mL) Mikrozentrifugenröhrchen für: (1) ungefärbten Zellen, 2-8) einzelne Zellen befleckt mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern gegen FcγR (CD16/32), c-Kit, Sca-1, CD34, Flt3 (CD135), Ly6C und CD115 für Auswahl und Farbe Spannungskompensation und 9) Sample-Zellen mit allen 7 Antikörper zum Stammvater Identifikation und Sortieren gefärbt werden.</li>
	<li>Verteilen Sie 100.000 Zellen zu jedem kontrollröhrchen (Röhren 1-8), und die verbleibenden Zellen (oder weniger wenn gewünscht) an das Probenröhrchen (Rohr 9). Hinweis: Wenn das Probenvolumen größer als 1,5-2 mL ist, kann es sein erforderlich, verteilen Sie die Sample-Zellen in eine 15 mL-Tube, Zentrifugieren sie Aufschwemmen Pellet (Schritt 3.3 unten) und übertragen Sie dann die Zellen zu einem Microcentrifuge Schlauch für die nachfolgenden Färbung Schritte.</li>
	<li>Die Zellen bei 1.500 x g für 5 min zentrifugieren und erneut die Kontrolle Rohr Pellets in 100 μl Puffer (PBS + 0,5 % FBS + 2 mM EDTA) und der Probe Tube Pellet in 100 μl Färbung Färbung Puffer pro 5 x 106 Zellen (z. B. 200 μL für 1 x 107 Zellen).</li>
	<li>Die FcγR einzelner Fleck und die Probenrohr 2 μg/mL Anti-CD16/CD32-APC-Cy7 hinzufügen. Wirbel sanft zu mischen und 10 min bei 4 ° c inkubieren Hinweis: Es ist wichtig, die Sample-Zellen mit dem FcγR (CD16/32) Antikörper vor dem Hinzufügen der anderen Antikörper um Wettbewerb aufgrund unspezifischer Fc-vermittelten Antikörperbindung zu verhindern zu beflecken. Inkubieren Sie die Zellen nicht mit einer FcγR Reagenz zu blockieren.</li>
	<li>Die entsprechenden einzelnen Fleck Röhren (1 Antikörper) und das Probenröhrchen (alle 6 Antikörper) die andere Antikörper hinzufügen: 10 μg/mL c-Kit-Pacific Blue, 2 μg/mL Sca-1-PE-Cy7 25 μg/mL CD34-FITC, 10 μg/mL Flt3-APC, 2 μg/mL Ly6C-PerCP-Cy5.5 und 4 μg/mL CD115-PE. Wirbel sanft, und 15 min bei 4 ° c inkubieren</li>
	<li>Fügen Sie 900 μL Färbung Puffer um die kontrollröhrchen und Färbung Puffer 1 mL pro 107 Zellen in das Probenröhrchen. Die Zellen bei 1.500 x g für 5 min zentrifugieren und Aufschwemmen der Zelle Pellet in der Färbung Puffer: 200 μL pro Steuerrohr und 500 μl pro 25 x 106 Zellen in das Probenröhrchen. Übertragen Sie die resuspendierte Zellen auf 5 mL FACS Rohre. Hinweis: Wenn das Probenvolumen größer als 1,5-2 mL ist, möglicherweise es notwendig, die Zellen auf eine 15 mL Tube für Zentrifugation zu übertragen.</li>
	<li>Bereiten Sie das Durchflusszytometer (Analysator oder Sortierer) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Führen Sie die ungefärbten und einzelne Kontrollzellen durch das Durchflusszytometer Einrichten der Spannungen und Kompensationen Farbe gefärbt.</li>
	<li>Führen Sie die Sample-Zellen, Tor der Stammvater Teilmengen wie unten beschrieben und in Abbildung 2zusammengefasst und auf Wunsch durchführen FACS sortieren, um die relevanten Stammvater Teilmengen zu isolieren. Hinweis: Es ist in der Regel notwendig, etwa 200.000 Zellen um mindestens 1.000 Veranstaltungen in jedem Stammvater Tor zu erhalten zu erwerben.<ol>
<li>Erstellen Sie einen Dot-Plot aller Zellen, Anzeige von FSC-A (x-Achse) und SSC-A (y-Achse), und Tor zum Ausschließen von Schmutz und abgestorbenen Zellen = > "live" Zellen.</li>
		<li>Erstellen Sie einen Dot-Plot von "lebenden" Zellen, Anzeige von FSC-H (x-Achse) und FSC-W (y-Achse), und um Dubletten auszuschließen gate = > Leben/Unterhemd (FSC) Tor.</li>
		<li>Erstellen Sie ein Dot Grundstück Leben/Singulett (FSC) Zellen, SSC-H (x-Achse) und SSC-W (y-Achse), anzeigen und Tor um Dubletten auszuschließen = > Leben/Unterhemd (FSC) / Unterhemd (SSC) Tor.</li>
		<li>Erstellen Sie einen Dot-Plot von Leben/Unterhemd (FSC) / Unterhemd (SSC) Zellen, Sca-1 (x-Achse) und c-Kit (y-Achse), anzeigen und Tor zur c-Kit+ Sca-1– Zellen auswählen = > LKS– Zellen.</li>
		<li>Erstellen Sie einen Dot-Plot LKS– Zellen, Anzeigen von CD34 (x-Achse) und FcγR (y-Achse) und Tor CD34 auswählen,+ FcγRlo Zellen = > "CMPs" und CD34+ FcγRHallo Zellen = > "GVP". Hinweis: Es ist wichtig, die "CMPs" und "GVP" so exakt wie möglich Tor. Es ist hilfreich, eine pseudofarben Dichte Handlung oder ein konturdiagramm für genaue Anspritzung verwenden.</li>
		<li>Erstellen einen Dot-Plot von "CMPs", CD115 anzeigen (x-Achse) und Flt3 (y-Achse) und Tor zum auswählen: Flt3+ CD115lo Zellen = > CMP-Flt3+ CD115lo Zellen, Flt3– CD115lo Zellen = > CMP-Flt3– Zellen, Flt3+ CD115Hallo Zellen = > MDPs.
</li>
		<li>Erstellen einen Dot-Plot "GVP", Anzeige Ly6C (x-Achse) und FcγR (y-Achse) und Tor Ly6C auswählen,–Zellen = > "GMP-Ly6C– -Zellen" und Ly6C+ Zellen = > "GMP-Ly6C+ -Zellen".</li>
		<li>Erstellen einen Dot-Plot "GMP-Ly6C– -Zellen", Anzeige CD115 (x-Achse) und Flt3 (y-Achse) und Tor zum auswählen: Flt3– CD115lo Zellen = > GVP.
</li>
		<li>Erstellen einen Dot-Plot "GMP-Ly6C+ Zellen", Anzeige CD115 (x-Achse) und Flt3 (y-Achse) und Tor zum auswählen: Flt3– CD115lo Zellen = > GPs, Flt3– CD115Hallo Zellen = > m/s + cMoPs.
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+common+myeloid+progenitor+that+gives+rise+to+all+myeloid+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages.</a> Nature. 404 (6774), 193-197 (2000).</li>
<li>Yáñez, A., Ng, M. Y., Hassanzadeh-Kiabi, N., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF8+acts+in+lineage-committed+rather+than+oligopotent+progenitors+to+control+neutrophil+vs+monocyte+production%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">IRF8 acts in lineage-committed rather than oligopotent progenitors to control neutrophil vs monocyte production.</a> Blood. 125 (9), 1452-1459 (2015).</li>
<li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CX3CR1%2B+CD115%2B+CD135%2B+common+macrophage%2FDC+precursors+and+the+role+of+CX3CR1+in+their+response+to+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).</li>
<li>Fogg, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonogenic+bone+marrow+progenitor+specific+for+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells.</a> Science. 311 (5757), 83-87 (2006).</li>
<li>Onai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+Flt3%2BM-CSFR%2B+plasmacytoid+and+conventional+dendritic+cell+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow.</a> Nature Immunology. 8 (11), 1207-1216 (2007).</li>
<li>Hettinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+monocytes+and+macrophages+in+a+committed+progenitor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor.</a> Nature Immunology. 14 (8), 821-830 (2013).</li>
<li>Yáñez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-monocyte+progenitors+and+monocyte-dendritic+cell+progenitors+independently+produce+functionally+distinct+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-monocyte progenitors and monocyte-dendritic cell progenitors independently produce functionally distinct monocytes.</a> Immunity. 47 (5), 890-902 (2017).</li>
<li>Olsson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+mixed-lineage+states+leading+to+a+binary+cell+fate+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of mixed-lineage states leading to a binary cell fate choice.</a> Nature. 537 (7622), 698-702 (2016).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Yáñez, A., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+8+and+the+regulation+of+neutrophil%2C+monocyte%2C+and+dendritic+cell+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 8 and the regulation of neutrophil, monocyte, and dendritic cell production.</a> Current Opinion in Hematology. 23 (1), 11-17 (2016).</li>
<li>Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+human+clonogenic+common+myeloid+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Weissman Anspritzung Strategie für Maus myeloischen Vorläuferzellen Kennung1 wurde der Goldstandard für Immunologen und Hämatologen seit fast 20 Jahren, aber es ist nun offensichtlich, dass die "CMP" und "GMP" Tore sehr heterogen und präziser sind Gating Strategien sind erforderlich. Das Protokoll, das wir hier beschrieben haben ermöglicht die Identifizierung der Oligopotent und Lineage-committed Teilmengen in den Mäusen C57BL/6J für genauere Quantifizierung der spezifischen myeloischen Vorläu...

Monozyten, Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) sind myeloische Zellen, die aus hämatopoetischen Vorläuferzellen im Knochenmark, in erster Linie durch einen Prozess namens Myelopoiesis entstehen. Gemeinsamen myeloische Vorläuferzellen (CMPs) haben das Potenzial, myeloische Zellen, als auch Megakaryozyten und Erythrozyten, aber nicht lymphoiden Zellen zu produzieren. Granulozyten-Monocyte Stammväter (GVP), die von CMPs abgeleitet sind, Granulozyten und Monozyten zu produzieren, aber Megakaryocyte und Erythrozyten mögliche verloren haben. Monozyten und klassische und plasmazytoide DCs (cDCs/pDCs) sind auch gedacht, um ergeben sich aus gemeinsamen Vorfahren bekannt als Monocyte-DC Stammväter (MDPs), die entstehen durch CMPs. schrittweise Einschränkung der Linie Potenzial letztlich zu Lineage-committed führt Vorfahren: Granulozyt Stammväter, Monocyte Stammväter und dendritischen Zellen Stammväter (Abbildung 1).
Weissman und Kollegen berichteten, dass CMPs im Lin– c-Kit+ Sca-1– (LKS–) CD34 gefunden werden+ FcγRlo Bruchteil der Maus Knochenmark, während GVP in der LKS– CD34 enthalten sind+ FcγR Hallo Bruchteil1. Jedoch sind diese "CMP" und "GMP" Fraktionen sehr heterogen. Beispielsweise enthält der "GMP" Bruch auch Lineage-committed Granulozyten Stammväter und Monocyte Stammväter1,2. MDPs wurden separat berichtet, dass CX3CR1+ Flt3+ CD115+ Vorfahren, die auch CD34 und FcγR3,4Ausdrücken. MDPs geben Anlass zu cDC/pDC-Herstellung von gemeinsamen DC Stammväter (CDPs), die untere Ebenen des c-Kit (CD117) Ausdrücken gemeldet wurden und sind nicht in den LKS– Teil5enthalten.
Zuvor war davon auszugehen, dass Monozyten über einen einzigen Weg (CMP-GMP-MDP-Monocyte) entstehen. Einklang mit diesem Modell, Monocyte begangen Stammväter, produziert von GVP (benannt Monocyte Stammväter, m/s)2 und MDPs (benannt gemeinsame Monocyte Vorfahren, cMoPs)6 scheinen die gleichen Zellen auf der Grundlage der gemeinsamen Oberfläche Marker Ausdruck . Aber wir vor kurzem gezeigt, dass Monozyten unabhängig von GVP und MDPs produziert werden, und konnten durch einzellige RNA Sequenzierung7m/s und cMoPs unterscheiden.
Wir vor kurzem verändert die Weissman "CMP" und "GMP" gating Strategie um 6 Unterfraktionen C57BL/6J Maus Knochenmark mit verschiedenen Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen Teilmengen zu identifizieren. Wir zunächst berichtet, dass für Ly6C und CD115 Färbung die Isolation der Oligopotent GVP und Granulozyten Stammväter (GPs) sowie Monocyte Stammväter (m/s und cMoPs, die wir derzeit nicht in der Lage erlaubt, zu trennen sind) aus dem "GMP" Teil2 (LKS - CD34+ FcγRHallo Tor; ( Abbildung 1). Wir später gezeigt, dass MDPs überwiegend in der "CMP" Fraktion gefunden werden (CD34 LKS– + FcγRlo Tor), die enthält auch Flt3+ CD115lo und Flt3– Teilmengen7 (Abbildung 1 ). Die CMP-Flt3+ CD115lo Bruchteil ergibt GVP und MDPs Adoptiv Übergabe. Die CMP-Flt3– Teilmenge enthält Stammväter, die Vermittler zwischen CMP-Flt3+ CD115lo Zellen und GVP zu sein scheinen. Im Gegensatz zu MDPs besitzen die CMP-Flt3+ CD115lo und CMP-Flt3– Fraktionen auch Megakaryocyte und potenzielle Erythrozyten.
Es ist wichtig, Beachten jedoch, dass es derzeit unklar ist, ob die "CMP" Fraktionen Vorfahren enthalten, die sind wirklich Oligopotent (z. B. einzelne Zellen innerhalb der CMP-Flt3+ CD115lo Bruch, die Neutrophilen, besitzen Monocyte, DC Megakaryocyte und potenzielle Erythrozyten), oder alternativ eine Mischung aus Vorfahren mit engeren Linie Potenzial umfassen. Koloniebildenden Assays (Methylcellulose Kulturen) offenbart Zellen mit Granulozyten (Neutrophilen), Erythrozyten, Monocyte und potenzielle Megakaryocyte (GEMM Zellen) in der "CMP" CMP-Flt3+ CD115lo und CMP-Flt3– Fraktionen1 ,7, aber nicht zulassen, dass die Bewertung des DC-Potentials. Im Gegensatz dazu koloniebildenden Assays zeigte die Existenz von Oligopotent GVP (Stammväter mit Neutrophilen und potenzielle Monocyte) im "GMP" Bruchteil1,2, und dies wird unterstützt durch den letzten einzellige transkriptomischen Analyse8. Es ist nicht aktuell, aber bekannt, ob diese Oligopotent GVP auch andere Granulozyten (Eosinophile, Basophils und Mastzellen produzieren).
Basierend auf diesen Studien zeigen wir nun wie 7 Marker (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C und CD115) Oberfläche lässt sich identifizieren und isolieren diese 6 Teilmengen von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen. Das hier beschriebene Protokoll kann angewendet werden, für in-vitro- Kultur Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente bei Mäusen und molekulare Analyse (Bulk- und einzellige RNA-Sequenzierung, Western blotting, usw.).
Das Protokoll besteht aus 3 Phasen: (1) Vorbereitung einer einzelnen Zelle Suspension des Knochenmarks Zellen, (2) Bereicherung für hämatopoetische Vorläuferzellen (magnetisch aktivierte Zellsortierung), und (3) Identifizierung und Isolierung, falls gewünscht, der Stammvater Teilmengen von Flow zytometrie (mit einem Analysator oder einen Sorter je nach Bedarf). Der erste Schritt ist die Isolierung von Knochenmarkzellen aus dem Oberschenkelknochen und Schienbeine euthanasierten Mäuse und ist vergleichbar mit anderen zuvor beschriebenen Protokolle9. Als nächstes wird die Probe für die Stamm- und Vorläuferzellen Zellen mit einem Cocktail von Antikörpern gegen Zelle oberflächenmarker der Erythrozyten, Neutrophilen, Monozyten, Lymphozyten usw. , die differenzierte Zellen zum Abbau bereichert. Dies ist nicht obligatorisch, aber dringend empfohlen, Erkennung der Stammvater Teilmengen zu optimieren und reduzieren die Menge der Stammvater Identifizierung benötigten Antikörper und der Zeitaufwand für Durchflusszytometrie. Die Linie Erschöpfung Protokoll unten beschreibt Magnetic-Activated Zelle Sortieren (MACS) mit einem Maus-Linie Zelle Erschöpfung-Kit (enthält biotinylierte Antikörper gegen CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4, und Ter-119, plus Anti-Biotin Microbeads) und eine automatisierte Magnetabscheider. Der letzte Schritt ist die Identifizierung (und sortieren, wenn gewünscht) der Stammvater Teilmengen von Durchflusszytometrie. Die Antikörper-Panel unten beschrieben (siehe auch Tabelle 1) wurde entwickelt, um in einem Durchflusszytometer (Analysator oder Sortierer) mit 4 Laser verwendet werden (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58061/58061fig1.jpg"> Abbildung 1: Neutrophilen, Monocyte und DC Stammväter und Differenzierung Wege. Die kürzlich überarbeitete Modell der Myelopoiesis7 ist mit die Weissman Tore für "CMPs" (blau) und "GVP" (grün)1 überlagert dargestellt. Diese Zahl wurde von Yáñez Et Al. 20177geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58061/58061fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table><tbody><tr><td>Maus: Wildtyp C57BL/6J (CD45.2)</td><td>The Jackson Laboratories</td><td>Cat#JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit, Maus</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Cat#130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD34 (Klon RAM34) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#553733</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD16/CD32 (Fc&gamma; R; Klon 93) APC-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Cat#101327</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus Ly6A/E (Sca-1; Klon 108113) PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>Cat#108114</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD117 (c-Kit; Klon 2B8) Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>Cat#105820</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus Ly6C (Klon HK1.4) PerCP-Cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>Cat#128012</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD115 (Klon AFS98) PE</td><td>BioLegend</td><td>Cat#135506</td><td></td></tr><tr><td>Ratte Anti-Maus CD135 (Flt3; Klon A2F10.1) APC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#560718</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Absolute Counting Beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat#C36950</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>N/A</td><td>Verwenden Sie das Programm "deplete"</td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 Laser, 15 Farben</td></tr><tr><td>BD FACS Aria III Zellsortierer</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>5 Laser, 13 Farben</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo, LLC</td><td>https://www.flowjo.com</td><td>Zur weiteren Analyse der .fcs-Dateien</td></tr></tbody></table>

identifizierung und isolierung von oligopotent und lineage-committed myeloischen vorläuferzellen aus maus knochenmark

Identification and Isolation of Oligopotent and Lineage-committed Myeloid Progenitors from Mouse Bone Marrow

Myeloische Vorläuferzellen, die Neutrophilen, Monozyten und dendritischen Zellen (DCs) ergeben können identifiziert und isoliert aus dem Knochenmark von Mäusen für hämatologischen und immunologischen Analysen. Beispielsweise können Studien über die zellulären und molekularen Eigenschaften der myeloischen Vorläuferzellen Bevölkerung enthüllen Mechanismen leukämischen Transformation oder zeigen, wie das Immunsystem reagiert auf Erreger Exposition. Zuvor beschriebenen Flow Cytometry Strategien zur myeloischen Vorläuferzellen Identifikation konnten erhebliche Fortschritte in vielen Bereichen, aber die Fraktionen, die sie identifizieren sind sehr heterogen. Die am häufigsten verwendeten gating Strategien definieren Knochenmark Brüche, die sind für die gewünschte Bevölkerung bereichert, sondern auch zahlreicher "verunreinigen" Vorfahren enthalten. Unsere jüngsten Studien haben viel von dieser Heterogenität gelöst und das Protokoll präsentieren wir hier erlaubt die Isolation der 6 Subpopulationen von Oligopotent und Lineage-committed myeloische Vorläuferzellen von 2 oben beschrieben Knochenmark Brüche. Das Protokoll beschreibt 3 Phasen: (1) Isolierung von Knochenmark Zellen, (2) Bereicherung für hämatopoetische Vorläuferzellen von magnetisch aktivierte Zellsortierung (Linie Abbau von MACS) und (3) Identifikation der myeloischen Vorläuferzellen Teilmengen von Durchflusszytometrie (einschließlich Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren, FACS, falls gewünscht). Dieser Ansatz ermöglicht Stammvater Quantifizierung und für eine Vielzahl von in Vitro und in Vivo Anwendungen isoliert und hat bereits neue Einblick in die Wege und Mechanismen der Neutrophilen, Monocyte und DC Differenzierung geführt.

Mit der oben beschriebenen Protokoll, ist es möglich, 100 Millionen Zellen (einschließlich der roten Blutkörperchen oder 50 Millionen kernhaltigen Zellen) von Oberschenkelknochen und Schienbeine (2 Beine) ein C57BL/6J Maus (6-8 Wochen alt, männlich oder weiblich) zu erhalten. 1-2 Millionen Lin– Zellen können per Mausklick durch MACS Depletion von Lin+ Zellen isoliert werden.
Jedes der 6 myeloischen Vorläufe...

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Myeloid progenitors that yield neutrophils, monocytes and dendritic cells (DCs) can be identified in and isolated from the bone marrow of mice for ...

Diese Methode könnte für Hämatologen und Immunologen hilfreich sein, die die Produktion und Funktion myeloischer Zellen, einschließlich Neutrophilen, Monozyten und dendritischer Zellen, untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genauere Identifizierung von myeloischen Vorläufergruppen ermöglicht als bisherige Strategien. Um Knochenmarkzellen für Vorläuferzellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) anzureichern, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 40 Mikrolitern MACS-Färbepuffer pro einmal 10 zu den sieben Knochenmarkzellen.Um die positiven Zellen der differenzierten Abstammungslinie zu dezimieren, geben Sie 10 Mikroliter Biotin-Antikörper-Cocktail pro mal 10 zu den sieben Zellen und mischen Sie sie durch Pipettieren für eine 10-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation werden 30 Mikroliter Färbepuffer pro mal 10 zu den sieben Zellen mit Mischen hinzugefügt, gefolgt von 20 Mikrolitern Anti-Biotin-Mikrokügelchen pro einmal 10 zu den sieben Zellen. Waschen Sie die Zellen nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit einem Milliliter Färbepuffer pro einmal 10 bis zu den sie

identification-isolation-oligopotent-lineage-committed-myeloid

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Eine durchflusszytometrische Methode zur Identifizierung und molekulare Analyse von Differenzierungs-Stadium-spezifische murine erythroiden Vorläuferzellen und Vorstufen, die direkt in frisch geernteten Maus Knochenmark, Milz oder fetale Leber. Der Test beruht auf der Zelloberfläche Marker CD71, TER119 und Zellgröße.

Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

Verfahren, um die Verteilung von Knochenmark hämatopoietischen Vorläuferzellen in Durchflusszytometrie sowie effizient zu isolieren hochgereinigten hämatopoetischen Stammzellen (HSC) Analyse beschrieben. Die Isolierung Verfahren im wesentlichen auf magnetische Anreicherung von c-Kit +-Zellen und Zell-Sortierung, um HSK für zelluläre und molekulare Studien zu reinigen bezogen.

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

Hier beschreiben wir ein optimiertes, hochreproduzierbares Protokoll zur Isolierung von mesodermalen Vorläuferzellen (MPCs) aus menschlichem Knochenmark (hBM). MPCs wurden mittels Durchflusszytometrie und Nestin-Expression charakterisiert. Sie zeigten die Fähigkeit, exponentiell wachsende MSC-ähnliche Zellkulturen hervorzubringen und gleichzeitig ihr angiogenes Potenzial zu erhalten.

Isolieren von Mesangiogenic Progenitorzellen (MPL) aus menschlichem Knochenmark

Während die Infiltrierung von Makrophagen kontinuierlich zu erwachsenen Geweben aus zirkulierenden Vorläufern rekrutiert wird, säen sich residente Makrophagen ihr Gewebe während der Entwicklung, wo sie ohne weitere Eingaben von Vorläufern aufrechterhalten werden. Die Vorläufer für Resident-Makrophagen wurden vor kurzem identifiziert. Hier stellen wir Methoden für die genetische Schicksalskartierung der residenten Makrophagen-Vorläufer vor.

Identifizierung von Erythromyeloid Progenitoren und deren Nachkommen in der Maus Embryo Durch Durchflusszytometrie

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

Hier werden ausführliche Protokolle für die Kultivierung der murinen myeloid Precursor-32D/G-CSF-R Zell-Linie, Durchführung Virusinfektionen und Durchführung von Proliferation und Differenzierung Assays vorgestellt. Diese Zelllinie eignet sich für das Studium myeloische Zellentwicklung und die Rolle der Gene des Interesses an myeloischer Zellwachstum und Neutrophile Differenzierung.

Proliferation und Differenzierung der murinen Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Zellen

Hier bieten wir eine Methode zum Identifizieren und isolieren große Zahlen von GM-CSF myeloische Zellen unter Verwendung von high-Speed Zellsortierung angetrieben. Fünf verschiedene Populationen (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen, Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen, Monozyten, Monocyte abgeleitet Makrophagen und Monocyte abgeleitet DCs) können identifiziert werden, basierend auf Ly6C und CD115 Ausdruck.

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Diese Methode beschreibt die durch Durchflusszytometrie gereinigte Reinigung von MEP und MKp von Mäuse femuren, Tibias und Beckenknochen.

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Hier beschreiben wir eine neuartige durchflusszytometrische Methode zur prospektiven Isolierung von Vorläuferzellen der frühen Burst-bildenden Einheit erythroid (BFU-e) und der koloniebildenden Einheit erythroid (CFU-e) direkt aus frischem Knochenmark und Milz der Maus. Dieses Protokoll, das auf der Grundlage von Einzelzell-Transkriptomdaten entwickelt wurde, ist das erste, das alle erythroiden Vorläuferzellen des Gewebes mit hoher Reinheit isoliert.

Identifizierung und Isolierung von Burst-bildenden Einheiten und koloniebildenden Einheiten erythroider Vorläuferzellen aus Mausgewebe mittels Durchflusszytometrie

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Charakterisierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen aus murinen Modellen myelodysplastischer Syndrome und akuter myeloischer Leukämie vorgestellt. Mit dieser Technik werden Veränderungen in der nicht-hämatopoetischen Knochenmarknische, einschließlich der endothelialen und mesenchymalen Stromazellen, mit Fortschreiten der Erkrankung identifiziert.

Identifizierung von Knochenmark-Mikroumgebungspopulationen beim myelodysplastischen Syndrom und der akuten myeloischen Leukämie

Erfahren Sie die Isolierung myeloischer Vorläuferzellen aus Mäuseknochenmark mittels MACS- und FACS-Sortierung. Diese Methode ermöglicht präzise Identifikation von sechs Zellsubpopulationen für hämatologische und immunologische Forschung.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

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