Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Diese Methode könnte für Hämatologen und Immunologen hilfreich sein, die die Produktion und Funktion myeloischer Zellen, einschließlich Neutrophilen, Monozyten und dendritischer Zellen, untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine genauere Identifizierung von myeloischen Vorläufergruppen ermöglicht als bisherige Strategien. Um Knochenmarkzellen für Vorläuferzellen durch magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) anzureichern, pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet in 40 Mikrolitern MACS-Färbepuffer pro einmal 10 zu den sieben Knochenmarkzellen.

Um die positiven Zellen der differenzierten Abstammungslinie zu dezimieren, geben Sie 10 Mikroliter Biotin-Antikörper-Cocktail pro mal 10 zu den sieben Zellen und mischen Sie sie durch Pipettieren für eine 10-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation werden 30 Mikroliter Färbepuffer pro mal 10 zu den sieben Zellen mit Mischen hinzugefügt, gefolgt von 20 Mikrolitern Anti-Biotin-Mikrokügelchen pro einmal 10 zu den sieben Zellen. Waschen Sie die Zellen nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius mit einem Milliliter Färbepuffer pro einmal 10 bis zu den sieben Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern frischem Färbepuffer für bis zu einem mal 10 bis zu den acht Zellen.

Richten Sie anschließend den automatisierten Magnetabscheider gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und legen Sie das Röhrchen mit den markierten Zellen in den Abscheider. Starten Sie das negative Selektionsprogramm, um die negative Fraktion zu sammeln, die die mit Vorläufern angereicherten negativen Zellen enthält. Pelletieren Sie die negativen Zellen durch Zentrifugation und resuspendieren Sie das Pellet, das jetzt weiß ist, in zwei Millilitern Färbepuffer pro Maus zum Zählen.

Um die myeloischen Vorläuferzellen durch FACS zu isolieren, fügen Sie eins mal 10 zu den fünften negativen Zellen der Abstammungslinie zu jedem der acht Kontroll-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, um die Spannungsauswahl und Farbkompensation zu erhalten, und geben Sie den Rest der Zellprobe in ein neuntes Mikrozentrifugenröhrchen, um mit allen sieben Oberflächenmarker-Antikörpern gefärbt zu werden, die für die Identifizierung und Sortierung der Vorläufer von Interesse sind. Die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und die Kontrollpellets in 100 Mikrolitern FACS-Färbepuffer und das experimentelle Probenpellet in 100 Mikroliter Färbepuffer pro fünfmal 10 auf die sechs Zellen resuspendiert. Geben Sie anschließend einen Anti-CD16/CD32-Antikörper in das Fc-Gamma-Rezeptor-Einzelfärberöhrchen und das Probenröhrchen.

Die Proben schonend vortexen und 10 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Am Ende der Inkubation geben Sie die anderen Antikörper in die entsprechenden Einzelfärberöhrchen und in das Probenröhrchen und inkubieren die Proben nach sanftem Vortexen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Am Ende der Inkubation geben Sie 900 Mikroliter Färbepuffer in die Kontrollröhrchen und einen Milliliter Färbepuffer pro einmal 10 der sieben Küvetten in das Probenröhrchen zur Zentrifugation.

Resuspendieren Sie die Kontrollpellets in 200 Mikrolitern frischem Färbepuffer pro Röhrchen und das experimentelle Pellet in 500 Mikrolitern pro 2,5 mal 10 in die sieben Zellen und überführen Sie die markierten Zellen in einzelne entsprechende Fünf-Milliliter-FACS-Röhrchen. Richten Sie dann das Durchflusszytometer gemäß den Standardprotokollen ein und verwenden Sie die ungefärbten und einfach gefärbten Regler, um die Spannungen und die Farbkompensationen einzustellen. Um die myeloischen Vorläuferzellen zu identifizieren und zu isolieren, laden Sie die experimentelle Zellprobe auf das Zytometer und erstellen Sie ein Diagramm der Vorwärtsstreufläche im Vergleich zum Seitenstreubereich, wobei das Gating so angeordnet ist, dass die Trümmer und toten Zellen ausgeschlossen werden.

Erstellen Sie ein Diagramm für die Vorwärts-Streuhöhe im Vergleich zur Vorwärts-Streubreite der aktiven Zellen und des Gates, um die Dubletten auszuschließen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einem Diagramm der Seitenstreuhöhe im Vergleich zur Seitenstreubreite der vorderen Streusinglinge und des Tors, um die Dubletten auszuschließen. Erstellen Sie ein Sca-1- versus c-Kit-Diagramm und -Gate, um die positiven Sca-1-negativen Vorläuferzellen von c-Kit auszuwählen.

Erstellen Sie dann ein CD-34- versus FC-Gamma-Rezeptor-Diagramm und -Gate, um die gemischten gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen und gemischten Granulozyten-Monozyten-Vorläuferpopulationen auszuwählen. Es ist wichtig, die gemischten gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen und die gemischten Granulozyten-Monozyten-Vorläuferpopulationen so genau wie möglich zu unterscheiden. Es kann hilfreich sein, ein Pseudofarbdichtediagramm oder ein Konturdiagramm zu verwenden, um ein genaueres Gating zu erzielen.

Verwenden Sie die Zellen im gemischten gemeinsamen myeloischen Vorläufergatter, um ein CD115-gegen-Flt3-Diagramm und -Gatter zu erstellen, um die gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen Flt3-positiven CD115-Tiefzellen, die gemeinsamen myeloischen Vorläuferzellen Flt3-negativen CD115-Zellen und die Flt3-positiven CD115-Vorläuferzellen mit hohem Monozytengehalt auszuwählen. Verwenden Sie die Zellen im gemischten Granulozyten-Monozyten-Vorläufergatter, um ein Ly6C- versus FC-Gamma-Rezeptor-Diagramm zu erstellen, und wählen Sie die Ly6C-negativen Zellen und die Ly6C-positiven Zellen aus. Erstellen Sie dann ein CD115-gegen-Flt3-Diagramm für jede gemischte Granulozyten-Monozyten-Vorläuferzell-Subpopulation und gattern Sie die Ly6C-negativen Flt3-negativen CD115-Monozyten-Vorläuferzellen mit niedrigen Granulozyten, die Ly6C-positiven Flt3-negativen CD115-Vorläuferzellen mit niedrigen Granulozyten und die Ly6C-positiven Flt3-negativen CD115-Vorläuferzellen mit hohen Monozyten.

Die Depletion der max. Abstammungslinie ist effizient bei der Depletion differenzierter Zellen und bei der Anreicherung für die c-Kit-positiven Vorläuferzellen. Die negative Fraktion der Abstammungslinie enthält immer noch einige c-Kit-negative Zellen, aber diese Zellen werden in nachfolgenden Schritten der Durchflusszytometrie eliminiert. Die Vorläuferausbeute nach der FACS-Sortierung kann je nach den verwendeten Sortiereinstellungen variieren, aber es sollte möglich sein, zwischen einem und viermal 10 bis vier Zellen pro Fraktion von jeder Maus mit einer Reinheit von mehr als 95 % nach der Sortierung für jede Fraktion zu erhalten.

Eine gute Färbung ist entscheidend für eine saubere Trennung der Populationen. Möglicherweise müssen Sie die Antikörper titrieren oder andere Fluorophore wählen, um eine optimale Trennung zu gewährleisten. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Vorläuferzellen zu identifizieren, Unterschiede in der Knochenmarkzusammensetzung zwischen Proben zu beurteilen, Vorläuferzellen für die molekulare Analyse zu isolieren oder ihre Fähigkeit zur Produktion myeloischer Zellen zu beurteilen.