Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

Summary

Myograph Leitertechnik dient zur vaskulären glatten Muskelzellen Funktionen und Bildschirm neue Drogen zu untersuchen. Wir berichten über ein detailliertes Protokoll zur Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie und für das screening von neuen Muskelrelaxantien von vaskulären glatten Muskelzellen.

Abstract

Myograph Leitertechnik dient zur Bewertung der Kontraktilität der vaskulären glatten Muskeln in Reaktion auf depolarization, GPCR-Agonisten/Inhibitoren und Drogen. Es ist in vielen Studien über die physiologischen Funktionen von vaskulären glatten Muskelzellen, die Pathogenese der vaskulären Erkrankungen wie Bluthochdruck und die Entwicklung der Glattmuskel Beruhigungsmittel Drogen verbreitet. Die Maus ist ein weit verbreitetes Modell Tier mit einem großen Pool von Krankheitsmodellen und gentechnisch veränderte Sorten. Wir haben diese Methode zur Messung der isometrischen Kontraktion der Maus mesenterialen Arterie im Detail eingeführt. Ein 1,4-mm-Segment der Maus mesenterialen Widerstand Arterie war isoliert und durch die Übergabe von zwei Drähten durch seine Lumen auf eine Myograph Kammer montiert. Nach Gleichgewichtherstellung und Normalisierung Schritten wurde das Schiff Segment durch eine High-K⁺ -Lösung zweimal vor der Kontraktion Assay potenzierte. Als ein Beispiel für die Anwendung dieser Methode in der Medikamentenentwicklung wir die entspannende Wirkung einer neuartigen natürlichen Substanz, Neoliensinine, isoliert aus ein chinesisches Kraut, Embryonen von Samen der Lotus (Nelumbo Nucifera Gaertn.) auf Maus mesenterialen gemessen. Arterien. Die Schiff-Segmente auf der Myograph Kammer montiert wurden mit einer High-K⁺ -Lösung stimuliert. Wenn die Kraft-Spannung eine stabile anhaltende Phase erreicht, wurden die Kammer kumulativen Dosen von Neoliensinine hinzugefügt. Wir fanden, dass Neoliensinine hatte eine dosisabhängige muskelrelaxierende Wirkung auf Kontraktion der glatten Muskulatur, hindeutet, dass es möglichen Aktivität gegen Bluthochdruck trägt. Darüber hinaus wie das Schiff-Segment kann mindestens 4 Stunden nach der Montage überleben und Kontraktilität induziert durch die High-K⁺ -Lösung für viele Male, wir empfehlen pflegen kann Myograph drahtsystem für die zeitraubende Drogen-Screening verwendet werden.

Introduction

Das kleine Schiff Myograph System hier verwendet wurde zur Messung die isometrische Kontraktion der kleinen Widerstand Schiffe mit Innendurchmesser von 100 bis 400 µm. isolierte kleine Schiffe (etwa 2 mm lang) durch zwei 40 µm Durchmesser Drähte eingefügt wurden und waren dann nacheinander montiert auf den Mikrometer und Wandler-Side backen. Diese Myograph Technik wurde erstmals im Jahr 1972¹ vorgeschlagen und dann in erster Linie durch Mulvany und seine Kollegen^2,3,4,5,6entwickelt. Es ist jetzt eine ausgereifte Technik mit Stalleinrichtungen, einfach Leistung und ein standard Normalisierung Verfahren^7,8,9. Wir nutzten diese Methode mit einigen Modifikationen für Messungen in der Maus mesenterialen Arterie.

Vaskulären glatten Muskelzellen Linien die Wände fast alle Blutgefäße. Ihre grundlegende Funktion ist es, Kräfte durch Kontraktion in Reaktion auf verschiedene Reize erzeugen. Die normalen Kontraktilität von vaskulären glatten Muskelzellen ist unerlässlich für die Blutdruckregulation und Ernährung zu ergänzen¹⁰. Abnorme Regulation des Blutdrucks führt zu einer Vielzahl von Erkrankungen wie Bluthochdruck, Herzinsuffizienz und Ischämie. Mehrere Studien haben vorgeschlagen, dass abnorme Blutdruck immer dysfunktionalen vaskulären glatten Muskelzellen Kontraktilität^7,11,12,13zugeordnet ist. Die Myograph-Methode erlaubt die Untersuchung von isometrischen Kontraktilität der Maus Schiffe durch verschiedene Reize wie vasokonstriktoren, Inhibitoren und Drogen induziert. Erfolgreiche Messungen der Kontraktion hilft uns zu verstehen, die Mechanismen der Blutdruck Wartung und die Pathogenese der vaskulären glatten Muskelzellen-assoziierten Erkrankungen und neue therapeutische Ansätze zu erkunden.

Viele chinesische Kräuter sind weit verbreitet für die klinische Behandlung von Gefäßerkrankungen benutzt worden; Ihre wirksamen Bestandteile sind jedoch in der Regel unbekannt. Somit, Isolierung und Identifizierung der wirksamen Komponenten ist sehr wichtig für die Entwicklung neuartiger Medikamente. Mehradrigen Myograph Technologie bietet eine einfache Methode für das screening von aktiver Komponenten in Kräutern. Wir haben mehrere Studien mit dem kleinen Schiff Myograph System um zu untersuchen, Maus mesenterialen Arterie Kontraktion berichtet und Naturstoffe mit Anti-Hypertonie Aktivität^12,13,14gekennzeichnet. Hier beschreiben wir das ausführliche Protokoll für die Myograph-Methode und die entspannende Wirkung der Neoliensinine isoliert von Embryonen von Lotus Samen (Nelumbo Nucifera Gaertn.) ¹⁴.

Protocol

Tierische Manipulationen stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) Modell Animal Research Center der Nanjing Universität.

1. Vorbereitung der Lösung

1. Bereiten Sie HEPES-Tyrode-Lösung (H-T) mit 137,0 mM NaCl, KCl 2,7 mM, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-Glukose und 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.
2. Bereiten Sie HEPES-Tyrode-Lösung ohne Calcium (Ca^{2 +}-freien H-T) mit 140,6 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-Glukose und 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.
3. Bereiten HEPES-Tyrode-Lösung mit 124 mM KCl (hohe K⁺) mit 15,7 mM NaCl, 124,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-Glucose und 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.

2. Experiment Vorbereitung

1. Heizen Sie H-T und High-K⁺ Lösungen mit Wasserbad 37 ° C vor.
2. Schalten Sie die Myograph System, Datenerfassungshardware und Computer.
3. Füllen Sie sorgfältig alle Myograph Kammern mit 5 mL H-T-Lösung.
4. Füllen Sie zwei Petrischalen mit 20 mL 4 ° C H-T und Ca^{2 +}-bzw. H-T Lösungen, frei, und speichern Sie auf dem Eis.
5. Ein 10 cm beschichtete Petrischale mit 20 mL H-T-Lösung füllen, und bei Raumtemperatur zu erhalten.

3. Maus mesenterialen Arterie Dissection

1. Eine 8-12 Wochen alten C57BL/6J weibliche oder männliche Maus durch zervikale Dislokation einschläfern. Fassen Sie die Maus mit ihren Bauch nach oben.
2. Befeuchten Sie den Bauch mit 70 % Ethanol. Dann schneiden Sie die Haut mit einer Schere entlang der ventralen Mittellinie von der Leiste, und stellen Sie Einschnitte von Anfang an den ersten Schnitt nach unten an den Beinen auf beiden Seiten. Ziehen Sie die Haut wieder auf beiden Seiten; Stellen Sie ähnliche Einschnitte, das Peritoneum zu öffnen.
3. Mit Schere, Schnitt der Speiseröhre, Dickdarm und andere Bindegewebe, den Magen-Darmtrakt mit der Fütterung Gefäßsystem aus dem Körper vollständig zu isolieren.
4. Bewegen Sie mit der Pinzette die isolierten Gruppe in die Schüssel mit der Kälte H-T in Schritt 2.4 vorbereitet und sanft spülen Sie das Gewebe in H-T-Lösung mehrmals das Blut abwaschen.
5. Übertragen Sie der isolierten Gruppe in der beschichteten Petrischale in Schritt 2.5 vorbereitet, und durchzuführen Sie mesenterialen Arterie Dissektion bei Raumtemperatur.
6. Glätten Sie den Magen, Jejunum, Ileum und Blinddarm im Uhrzeigersinn und Stift Magen und Blinddarm auf der linken und rechten Seite bzw..
7. Dehnen Sie die mesenterialen Gefäßsystem Bett und beheben Sie den Darm mit Stiften, die sezierten mesenterialen Arterien verfügbar zu machen.
   Hinweis: Unter diesen Bedingungen sind die Arterien auf die Venen.
8. Schalten Sie die Übertragung Lichtquelle eine stereoskopische Mikroskop und sezieren Sie Arterien unter dem Mikroskop zu. Stellen Sie sicher, dass das gesamte Gewebe in die Lösung eingetaucht ist.
9. Klemmen Sie das Fettgewebe um die Arterien mit Pinzette und isolieren Sie die Arterien durch das Abschneiden des Bindegewebes mit Dissektion Schere. Nicht zu verletzen, die Arterien.

4. arterielle Montage

1. Transfer und Tauchen den mesenterialen Arterie Baum in den kalten Ca^{2 +}-H-T-Lösung (in Schritt 2.4 vorbereitet) klemmend überschüssige Arterien mit der Pinzette frei.
2. Ein 1,4-mm-Teil der Arterie geschnitten Sie an Darmwand eines mesenterialen Arcade-proximalen ab, und verwenden Sie zwei Pinzetten, um beide Seiten von dieser Arterie Segment vorsichtig öffnen.
3. Bereiten Sie zwei Segmente aus rostfreiem Stahldraht 2,5 cm in der Länge, und legen Sie sie in das gleiche Gericht.
4. Klemmen Sie sanft ein Ende der Arterie mit Pinzette, und legen Sie zwei Drähte in das Lumen der Arterie eins nach dem anderen mit Hilfe von einem anderen Zange. Stellen Sie sicher, dass die Drähte gerade gehalten werden und Sie nicht das Endothel berühren.
5. Mit zwei Pinzetten, Klemmen Sie die beiden Stahldrähte außerhalb des Behälters Gewinde gleichzeitig und übertragen Sie sorgfältig das Schiff aus der Petrischale zu einer Myograph Kammer vorher gefüllt mit H-T-Lösung (Schritt 2.3).
6. Schrauben Sie die Backen auseinander um Platz für die Montage zu schaffen. Klemmen Sie beide Seiten eines der beiden eingelegten Leitungen mit zwei Pinzetten, und stellen Sie das Gefäß in der Kiefer-Lücke (Abbildung 1A).
7. Wickeln Sie beidseitig eingespannten Draht um Schrauben des Kiefers mit Mikrometer (Abbildung 1 b) verbunden.
8. Befestigen Sie die linke Schraube durch Drehen im Uhrzeigersinn. Den Draht mit rechten Pinzette zu begradigen, dann die rechten Schraube durch Drehen im Uhrzeigersinn (Abbildung 1) zu beheben. Stellen Sie sicher, dass das Schiff immer in der Kiefer-Lücke, aber berühren Sie nicht den Kiefer um Schäden zu vermeiden.
9. Schließen Sie die beiden Backen mit Mikrometer (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die beiden Backen nahe genug sind, sondern dass sie nicht berühren einander und, dass der fixierten Draht an der Oberseite der festen Draht.
10. Mit der rechten Pinzette, sorgfältig Falten Sie abgeschraubt Draht an der Ecke des Kiefers erzwingen Wandler angeschlossen, und wickeln Sie es im Uhrzeigersinn um die rechten Schraube (Abb. 1E). Befestigen Sie die Schraube. Wiederholen Sie diesen Schritt auf der linken Seite des Drahtes und der linken Schraube (Abb. 1F).
11. Verschieben Sie die Backen leicht auseinander, indem sorgfältig drehen Mikrometer (Abbildung 1). Dehnung des Schiffes zu vermeiden. Verwenden Sie Zange um den Draht seitlich Mikrometer auf der horizontalen Ebene des Drahtes an den Wandler-Seite verschieben. Drehen Sie vorsichtig das Mikrometer, so dass die Lücke zwischen den beiden Backen nur Platz für die zwei Drähte.
12. Wiederholen Sie die Schritte 4.2 – 4.11 um Arterien auf die anderen Kammern zu montieren. Alle Kammern an das Gerät anschließen, decken die Kammern, die Versorgung mit 100 % Sauerstoff und einem Temperaturfühler und beginnt Erwärmung auf 37 ° C. Öffnen Sie die charting-Software, und drücken Sie die Start -Taste auf das Diagramm Fenster zum Starten der Aufnahme.
13. Equilibrate für ca. 20 Minuten.

(5) Normalisierung

Hinweis: Um den Versuchsbedingungen zu standardisieren und zuverlässige physiologischen Reaktionsfähigkeit von Schiffen zu erhalten, ist eine Normalisierung Verfahren notwendigen¹⁵. Nach der Beziehung zwischen der aktive Kraft und inneren Umfang des Schiffes hat das drahtsystem Myograph ein standard Normalisierung-Programm, um den internen Umfang (IC) der montierten Schiff^{5,8zu bewerten, 9}. Kurz, IC (µm) zu berechnen, Lesen der Mikrometer und geben Sie den Wert als der X-Wert und der Wandler Kraft, d. h. ruht Wand Spannung (mN/mm), als der Y-Wert ausgegeben. Das Programm kehrt eine angepasste Kurve von (X, Y) und das IC entspricht einem Transmural Druck von 100 MmHg (IC₁₀₀) zu berechnen. Das Schiff soll den normalisierten interne Umfang (IC₁) Wenn die aktive Reaktionsfähigkeit ist maximal.

1. Kräfte auf NULL für alle Kanäle auf dem Gerät eingestellt, und equilibrate für weitere 1-2 Minuten.
2. Wählen Sie Einstellungen der Normalisierung von der "DMT-Menü, und richten Sie die Parameter wie folgt:
   Okular-Kalibrierung (mm/Div): 0,36; Druck (kPa) Ziel: 13,3; IC₁/IC₁₀₀: 0,9; Online-Mittelungszeit (Sekunden): 2; Verzögerung (Sekunden): 60. Klicken Sie auf "OK" , um die DMT Normalisierung Einstellungen -Fenster zu schließen.
3. Wählen Sie den Kanal von Interesse aus dem DMT-Menü , einem DMT-Normalisierung-Fenster für den entsprechenden Kanal zu öffnen. Geben Sie die Konstante Werte in das Fenster wie folgt: Gewebe Endpunkte a1: 0,1; Gewebe-Endpunkte a2: 4; Drahtdurchmesser (µm): 40. Das Fenster zeigt die berechneten Schiff Länge 1,40 mm.
4. Lesen Sie das Mikrometer der entsprechenden Gewebe Kammer. Geben Sie den Wert im Feld Mikrometer zu lesen , und klicken Sie auf Punkt hinzufügen . Dieser Wert ist der Anfangswert von X (X0). Nach 60 s Verzögerungszeit zeigt das Fenster die Kraft und der wirksame Druck (ERTP) entspricht dieser Wert der Mikrometer. Gleichzeitig wird die Mikrometer lesen Box aktiv.
5. Das Schiff wird durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn das Mikrometer normalisiert zu dehnen. Geben Sie den Mikrometer-Wert im Feld Mikrometer zu lesen , und klicken Sie auf Punkt hinzufügen . Warten Sie auf eine Verzögerungszeit von 60 s wieder.
6. Wiederholen Sie Schritt 5.5, weiterhin dehnen das Schiff, und Mikrometer Werte hinzufügen, bis das Fenster den Wert des "Mikrometer X₁", die die berechneten Mikrometer Einstellung erforderlich zeigt, um das Schiff auf der IC₁Strecken ist.
7. Festlegen der Mikrometer bis₁ Wert X.
   Hinweis: Die normalisierten Spannung ist in der Regel 1-2 mN.

(6) Arterie Kontraktion Aufnahme

Hinweis: Alle Lösungen, einschließlich H-T und High-K⁺ -Lösung, die in diesem Abschnitt verwendet wurden in Schritt 2.1 vorbereitet.

1. Nach der Normalisierung equilibrate das Schiff in die Kammer für 15-20 min.
   Hinweis: Dies ist keine Notwendigkeit, die Lösung in diesem Schritt ändern.
2. Fordern Sie das Gefäß mit High-K⁺ Lösung zweimal.
   1. Um das Schiff herauszufordern, ersetzen Sie H-T-Lösung mit 5 mL High-K⁺ Lösung für die Kontraktion für 10 min, gefolgt von 3 - 4 mal mit 5 mL H-T-Lösung Waschen zu induzieren.
      Hinweis: Typische Kontraktion hat eine maximale Kraft über 3 mN und eine Konstante anhaltende Kraft um 2,5 mN¹². Wenn die erste Herausforderung eine maximale Kraft unter 2,5 mN erzeugt oder die nachhaltige Kraft mit der Zeit sinkt die zweite Herausforderung eine viel geringere Kraft als die erstmalige Dosis erzeugt, das Schiff wird verworfen und nicht zur weiteren Untersuchung verwendet werden.
3. Fordern Sie das Schiff mit 5 mL High-K⁺ -Lösung um Kontraktion zu induzieren. Fügen Sie nach 5 min 0,5 µL der Stammlösung (10 mM in DMSO) Neoliensinine¹⁴ in die Kammer, das Schiff auf eine Endkonzentration von 1 µM Neoliensinine entspannen hinzu.
4. Wenn die Kraft stabil ist (Dies dauert in der Regel mehrere Minuten), fügen Sie ein weiteres 0,5 µL der Stammlösung Neoliensinine in die Kammer, die Konzentration auf 2 µM. Add 1 µL der Vorratslösung jedes Mal erhöhen, erhöhen Sie die Konzentration auf 4, 6, 8 und 10 µM, t zu generieren He-Dosis-Wirkungs-Kurve.
   Hinweis: Lager und arbeiten Konzentrationen schwanken unter Drogen.

Results

Wir die isometrische Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit einem mehradrigen Myograph System gemessen und bewertet die entspannende Wirkung der Neoliensinine gereinigt von Embryonen von Lotus Samen (Nelumbo Nucifera Gaertn.) ¹⁴. Maus mesenterialen Widerstand Arterie wurde isoliert, gereinigt von Bindegewebe und 1,4 mm Segmente geschnitten. Die Arterie-Segment wurde von zwei Drähten in Ca^{2 +}eingefügt-H-T-Lösung in einer Petrischale fr...

Discussion

Hypertonie ist eine weit verbreitete gesundheitspolitische Herausforderung aufgrund seiner schweren Komplikationen, einschließlich Herz-Kreislauf- und Nieren-Erkrankungen-¹⁶. Verständnis der Pathogenese der Hypertonie und mehr blutdrucksenkende Medikamenten zu erkunden ist eine dringende Aufgabe auf diesem Gebiet geworden. Blutdruck wird erstellt und gepflegt von peripheren Widerstand der Zirkulation. Nach dem Poiseuille Gesetz relativ kleinen Arterien erzeugen einen Großteil der Kreislauf Widerst...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mehrdraht-Myographensystem	DMT	610-M
Edelstahldraht	DMT	400447
Geuder Dissektionschere	DMT	400431
Dumont Pinzette	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Software	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2· 6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glukose	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650