Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

Unser Labor verwendet seit vielen Jahren die Drahtmyograph-Methode, um die Kontraktilität der glatten Gefäßmuskulatur zu messen. Wir verwenden diese Technik, um den Mechanismus der Kontraktion der glatten Muskulatur zu untersuchen. Wir nutzen diese Methode, um neuartige Medikamente für die Bluthochdrucktherapie zu erforschen.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Gefäßsegment mindestens vier Stunden nach dem Aufsteigen überlebt und die durch den hohen Kaliumgehalt induzierte Kontraktilität über ein Vielfaches beibehält. Das Mehrkanalsystem bietet die Möglichkeit für ein hohes Therapie-Screening neuer Medikamente. Stecken Sie den Körper der euthanasierten Maus mit dem Bauch nach oben fest und befeuchten Sie den Bauch mit 70 % Ethanol.

Nachdem Sie die Haut entlang der ventralen Mittellinie von der Leiste aus mit einer Schere geschnitten haben, schneiden Sie ab dem Beginn des ersten Schnitts an jedem Bein ein. Ziehen Sie die Haut auf beiden Seiten zurück und machen Sie dann ähnliche Schnitte, um das Bauchfell zu öffnen. Schneiden Sie anschließend mit einer Schere die Speiseröhre, den Dickdarm und anderes Bindegewebe ab, um den Magen-Darm-Trakt mit den zuführenden Gefäßen vollständig vom Körper zu isolieren.

Nach dem Spülen des Blutes aus dem Magen-Darm-Trakt mit HEPES-Tyrode oder H-T-Lösung wird das isolierte Segment in eine beschichtete Petrischale zur Dissektion der Mesenterialarterie bei Raumtemperatur überführt. Glätten Sie den Magen, das Jejunum, das Ileum und den Blinddarm im Uhrzeigersinn und stecken Sie den Magen und den Blinddarm auf die linke bzw. rechte Seite. Schalten Sie die Transmissionslichtquelle eines stereoskopischen Mikroskops ein und fixieren Sie den Darm mit Stiften, um die präparierten Mesenterialarterien freizulegen.

Klemmen Sie dann das Fettgewebe mit einer Pinzette um die Arterien und isolieren Sie die Arterien vorsichtig, indem Sie mit einer Präparierschere das gesamte Bindegewebe abschneiden. Fassen Sie eine überschüssige Arterie mit einer Pinzette und übertragen Sie den Mesenterialarterienbaum und tauchen Sie ihn in kalte Kalziumionen-freie H-T-Lösung. Schneiden Sie einen 1,4 Millimeter großen Teil der Arterie proximal zur Darmwand einer mesenterialen Arkade ab und öffnen Sie mit zwei Pinzetten vorsichtig beide Seiten dieses Arteriensegments.

Bereiten Sie zwei Segmente Edelstahldraht von 2,5 Zentimetern Länge vor und legen Sie sie in dieselbe Schale. Klemmen Sie mit einer Pinzette vorsichtig ein Ende der Arterie ein. Führen Sie dann mit einer weiteren Pinzette vorsichtig nacheinander zwei Drähte in das Lumen der Arterie ein.

Stellen Sie sicher, dass die Drähte gerade gehalten werden und das Endothel nicht berühren. Klemmen Sie mit zwei Pinzetten beide Drähte gleichzeitig außerhalb des Gewindegefäßes ein und überführen Sie das Gefäß vorsichtig aus der Petrischale in eine mit H-T-Lösung gefüllte Myographenkammer. Schrauben Sie die Backen der Kammer auseinander, um Platz für die Montage zu schaffen, fassen Sie dann mit zwei Pinzetten beide Seiten eines der beiden eingeführten Drähte und platzieren Sie das Gefäß in den Backenspalt.

Wickeln Sie beide Seiten des geklemmten Drahtes um die Schrauben der Backe, die mit dem Mikrometer verbunden sind. Befestigen Sie die linke Schraube, indem Sie sie im Uhrzeigersinn drehen. Verwenden Sie dann eine Pinzette, um den Draht zu begradigen.

Befestigen Sie anschließend die rechte Schraube, indem Sie sie im Uhrzeigersinn drehen. Stellen Sie sicher, dass sich das Gefäß immer innerhalb des Kieferspalts befindet, aber berühren Sie den Kiefer nicht, um Schäden zu vermeiden. Schließen Sie die beiden Backen mit dem Mikrometer.

Stellen Sie sicher, dass die beiden Backen nahe genug beieinander liegen, sich aber nicht berühren und dass der nicht fixierte Draht auf dem festen Draht liegt. Falten Sie mit der rechten Pinzette vorsichtig den abgeschraubten Draht an der Ecke des Kiefers, der mit dem Kraftaufnehmer verbunden ist, und wickeln Sie ihn im Uhrzeigersinn um die rechte Schraube. Befestigen Sie dann die Schraube.

Wiederholen Sie das Aufklappen und Umwickeln der linken Seite des Drahtes und befestigen Sie die Schraube auf der linken Seite. Bewegen Sie dann die Backen leicht auseinander, ohne das Gefäß zu dehnen, indem Sie das Mikrometer vorsichtig so drehen, dass der Spalt zwischen den beiden Backen gerade die beiden Drähte aufnehmen kann. Bewegen Sie dann den Draht auf der Mikrometerseite mit einer Pinzette auf die horizontale Ebene des Drahtes auf der Wandlerseite.

Nachdem Sie Arterien in den anderen Kammern montiert haben, schließen Sie alle Kammern an das Gerät an und decken Sie die Kammern ab. Befestigen Sie die 100%ige Sauerstoffversorgung und einen Temperaturfühler und beginnen Sie mit dem Heizen auf 37 Grad Celsius. Öffnen Sie die Charting-Software.

Drücken Sie die Start-Taste, um die Aufnahme zu starten. Wählen Sie den gewünschten Kanal aus dem DMT-Menü aus, um das DMT-Normalisierungsfenster für den entsprechenden Kanal zu öffnen. Geben Sie die folgenden konstanten Werte in das Fenster ein:Gewebe-Endpunkte a1, 0,1; Gewebe-Endpunkte a2, 4; Drahtdurchmesser, 40.

Das Fenster zeigt dann die berechnete Gefäßlänge mit 1,40 Millimetern an. Lesen Sie das Mikrometer der entsprechenden Gewebekammer ab. Geben Sie den Wert in das Feld für den Mikrometer-Messwert ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Punkt hinzufügen.

Dieser Wert ist der Anfangswert von X.Nach einer Verzögerung von 60 Sekunden zeigt das Fenster die Kraft und den effektiven Druck an, die diesem Mikrometerwert entsprechen. Gleichzeitig wird die Mikrometer-Ablesungsbox aktiv. Dehnen Sie das zu normalisierende Gefäß, indem Sie das Mikrometer gegen den Uhrzeigersinn drehen.

Geben Sie den Mikrometerwert in das Feld für die Messschraube ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Punkt hinzufügen. Warten Sie erneut auf eine Verzögerungszeit von 60 Sekunden. Fahren Sie fort, das Gefäß zu dehnen und Mikrometerwerte hinzuzufügen, bis im Fenster der Wert von Mikrometer X-eins angezeigt wird, d. h. die berechnete Mikrometereinstellung, die erforderlich ist, um das Gefäß auf seinen IC-eins zu dehnen.

Stellen Sie das Mikrometer auf den X-Eins-Wert ein. Nach der Normalisierung das Gefäß in der Kammer 15 bis 20 Minuten lang äquilibrieren. Nach dem Gleichgewicht fordern Sie das Gefäß mit einer Lösung mit hohem Kaliumgehalt heraus, indem Sie die HT-Lösung durch 5 Milliliter Lösung mit hohem Kaliumgehalt ersetzen, um eine Kontraktion für 10 Minuten zu induzieren.

Nach Wiederholung der 10-minütigen Inkubation in frischer kaliumreicher Lösung drei- bis viermal mit fünf Millilitern H-T-Lösung waschen. Fordern Sie das Gefäß erneut mit fünf Millilitern Lösung mit hohem Kaliumgehalt an, um eine Kontraktion zu induzieren. Geben Sie nach fünf Minuten 0,5 Mikroliter der Neoliensinin-Stammlösung in die Kammer, um das Gefäß bei einer Endkonzentration von einem Mikromolar Neoliensinin zu entspannen.

Wenn die Kraft nach einigen Minuten stabil ist, fügen Sie weitere 0,5 Mikroliter Neoliensinin-Stammlösung hinzu, um die Konzentration auf zwei Mikromolare zu erhöhen. Fügen Sie jedes Mal einen Mikroliter der Stammlösung hinzu, um die Konzentration auf vier, sechs, acht und 10 Mikromolare zu erhöhen und die Dosis-Wirkungs-Kurve zu erzeugen. Während des Normalisierungsverfahrens wurde das Gefäß mehrmals gedehnt, bis es den Wert von IC-100 erreichte, und jeder gedehnte Zyklus beinhaltete eine robuste Kontraktion, eine schnelle Entspannung und eine Krafterhaltung in 60 Sekunden.

Die Kontraktion der glatten Gefäßmuskulatur, die durch eine Lösung mit hohem Kaliumgehalt induziert wurde, zeigte in der Regel zwei Phasen, eine robuste Phase und eine anhaltende Phase. Wir haben eine Methode zur Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus-Mesenterialarterie mit Hilfe eines Mehrdraht-Myographensystems beschrieben. Diese Methode kann verwendet werden, um die Funktionen der glatten Gefäßmuskulatur zu beurteilen und Relaxantien der glatten Muskulatur zu screenen.

Der Hauptunterschied zwischen dieser Methode und anderen liegt in den Montageschritten. Dieser Schritt, der hier verwendet wird, ist einfach durchzuführen und beschädigt weder das Gewebe noch das Gerät. Nach diesem Verfahren können auch andere Stimulatoren wie EP und Angiotensin II verwendet werden, um die Kontraktion der glatten Muskulatur zu stimulieren, um einige neuartige Medikamente zu finden, die empfindlich auf diesen Agonisten reagieren.