Method Article

Ein High-Throughput, High-Content, Liquid-basierter C. Elegans Pathosystem

DOI:

10.3791/58068

⸱

July 1st, 2018

 ,  , 
1Department of Biosciences, Rice University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir eine Protokoll, die ist ein anpassungsfähiges, ganze Host, High-Content-Screening-Tool, das genutzt werden kann, um Wirt-Pathogen Interaktionen zu untersuchen und für die Wirkstoffforschung verwendet werden.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Zahl der neuen Medikamente identifiziert durch traditionelle, in-vitro- Bildschirme hat nachgelassen, den Erfolg dieses Ansatzes bei der Suche nach neuen Waffen gegen mehrere Resistenzen reduzieren. Dies führte zu dem Schluss, dass Forscher nicht nur Notwendigkeit, neue Medikamente zu finden, sondern auch neue Wege zu finden, sie zu entwickeln müssen. Methoden gehören des vielversprechendsten Kandidat ganzen Organismus, in Vivo Tests dieser Verwendung Hochdurchsatz-, phänotypische auslesen und beherbergt, die von Caenorhabditis Elegans , Danio Rerioreichen. Diese Hosts haben mehrere leistungsstarke Vorteile, einschließlich dramatische Kürzungen in falsche positive Treffer, wie Verbindungen, die giftig für die Host- und/oder Biounavailable sind in der Regel bis in das Einstiegsbild vor kostspieligen folgen gelöscht werden.

Hier zeigen wir, wie unser Test verwendet wurde, um Host-Variation in den gut dokumentierten C. Eleganszu verhören –Pseudomonas Aeruginosa flüssige Tötung Pathosystem. Wir zeigen auch mehrere Erweiterungen dieser gut ausgearbeitete Technik. Wir sind beispielsweise Hochdurchsatz-genetische Bildschirme mit RNAi in 24 oder 96-Well Plattenformate Abfrage Host Faktoren in diesem Wirt-Pathogen Interaktionen durchführen zu können. Mit Hilfe dieser Assay, können gesamte Genom-Bildschirme in nur wenigen Monaten abgeschlossen werden die drastisch vereinfachen kann die Aufgabe Drogeziele potentiell ohne mühsame biochemische Reinigung Ansätze zu ermitteln.

Außerdem berichten wir hier eine Variation unserer Methode, die der gram-positiven Bakterium Enterococcus Faecalis für gramnegative Erreger p. Aeruginosaersetzt. Ähnlich wie bei p. Aeruginosader Fall ist, ist die Tötung von E. Faecalis zeitabhängig. Im Gegensatz zu früheren C. Elegans—E. Faecalis -Assays, unsere Assay für E. Faecalis ohne Preinfection auskommt, Verbesserung seiner Sicherheitsprofil und reduzieren die Wahrscheinlichkeit von kontaminierenden Flüssigkeiten Handhabungsgeräte. Der Test ist sehr robust, ~ 95 % Sterbeziffern 96 h Post Infektion zeigen.

Introduction

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Die Identifikation und Entwicklung von wirksamen, Breitspektrum-Antibiotika, nun vor fast einem Jahrhundert führte zu einem Wendepunkt im Gesundheitswesen gab es eine weit verbreitete Überzeugung, dass infektiöse Krankheit wäre eine Geißel der Vergangenheit. Innerhalb von wenigen Jahrzehnten begann dieser Optimismus zu schwinden als Erreger nach Erreger Resistenzmechanismen entwickelt, die diese einmal wunderbaren Behandlungen begrenzt. Eine Zeitlang schien das Wettrüsten zwischen Drug Discovery Bemühungen und die Erreger ausgeglichen. Der Missbrauch von Antibiotika hat jedoch vor kurzem bei der Entstehung von Pan-resistente Stämme von Klebsiella Pneumoniae, Acinetobacter Baumanii, Serratia Marcescensund p. Aeruginosa1gipfelte, 2,3,4.

P. Aeruginosa ist ein opportunistisch, Gram negative, Multi-Host Erreger, eine schwere Bedrohung für Patienten mit schweren Verbrennungen, diejenigen, die sind immungeschwächte oder Mukoviszidose. Es wird auch zunehmend als ein Erreger in schweren Nosokomialinfektionen, vor allem durch die laufende Übernahme von Antibiotikaresistenzen identifiziert. Um zu beginnen, um dieser Bedrohung zu begegnen, haben wir den gut dokumentierten C. Elegans-p. Aeruginosa Infektion System5verwendet. Unser Labor hat genutzt, dieses System zu entwickeln eine Liquid-basierter, Hochdurchsatz-, High-Content Screening-Plattform um neue Verbindungen zu identifizieren, die die Fähigkeit des Erregers, die Host-6töten zu begrenzen. Faszinierend, scheinen diese Verbindungen mindestens drei allgemeine Kategorien, einschließlich Antibiotika7 und Virulenz Inhibitoren8anzugehören. Andere High-Content-Droge-Entdeckung-Assays in C. Elegans für Mycobacterium Tuberculosum, Chlamydia Trachomatis, Yersinia Pestis, Listeria Monocytogenes, Francisella Tularensis, Staphylococcus Aureus, Candida Albicans, gemeldet wurden und Enterococcus Faecalis, unter anderem9,10,11,12,13,14,15,16. Diese Arten von Tests haben mehrere allgemein anerkannten Vorteile, wie die Begrenzung falsche positive Treffer, die möglicherweise giftig für beide der Host und der Erreger, erhöhte Wahrscheinlichkeit der Bioverfügbarkeit im Vergleich zu einem chemischen Bildschirm und Hits jenseits zu identifizieren einfach die Begrenzung mikrobiellen Wachstums, wie Anti-Virulents, immun stimulierende Moleküle oder Verbindungen, die sonst das Gleichgewicht der Wirt-Pathogen Interaktionen zu Gunsten der ehemaligen kippen. Darüber hinaus sind die Verbindungen entdeckt in diesen Bildschirmen oft wirksam bei Säugetieren Gastgeber.

Es ist erwähnenswert, dass mindestens zwei anderen Assays17,18 sind zur Durchführung von Hochdurchsatz-Bildschirme in C. Elegans in Flüssigkeit. Jeder dieser Tests ist jedoch eine Änderung, die die prototypische intestinale Kolonisation Assay, bekannt als langsam-Tötung, in Flüssigkeit, durchgeführt werden kann Erhöhung des Durchsatzes und ermöglicht Verbindungen leichter untersucht werden. Achten Sie darauf, dass Charakterisierung schlüssig nachgewiesen, dass die Mechanismen der bakteriellen Virulenz dieser Assays und unsere Liquid-basierter Bildschirm7unterschiedlich sind. Da beide Arten von Virulenz bei Säugetieren Systemen beobachtet werden, ist es wichtig zu überlegen, welche Virulenz Determinante für den Experimentator Interessen vor Assay Auswahl am relevantesten ist.

Hier zeigen wir eine optimierte Version der Liquid-basierter C. Elegans-P. Aeruginosa Assay. Wir berichten auch die Anpassung der unsere Liquid-basierter Assay-Methode, um den grampositiven bakteriellen Erreger beherbergen Enterococcus Faecalis. Wie p. Aeruginosaist E. Faecalis zunehmend als schwere nosokomiale Bedrohung mit einer wachsenden Bewaffnung der Antibiotikaresistenz Wege1erkannt. Obwohl eine frühere Methode für Hochdurchsatz-Screening von E. Faecalis 14vorhanden ist, erfordert es Preinfection mit dem Erreger, die das Verfahren kompliziert und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Kontaminierung Ausrüstung wie die COPAS-FlowSort. Unser Protokoll überflüssig vor Infektion, das Sicherheitsprofil zu verbessern. Zu guter Letzt berichten wir über ein Mittel, mit denen entweder diese Assays kombiniert werden können, mit der Fütterung RNAi, so dass der Benutzer suchen für Host-Faktoren, die eine bei der Schaffung Rolle oder Widerstandskraft gegen Infektionen.

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Protocol

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Achtung: P. Aeruginosa und E. Faecalis sind Biosafety Level 2 Krankheitserreger und angemessene Sicherheitsvorkehrungen getroffen, um versehentliche Infektion zu verhindern und Verschmutzung von Oberflächen zu minimieren. Alle Medien und Materialien, die in Kontakt mit Krankheitserregern kommen müssen sterilisiert bzw. verworfen werden. Weitere Richtlinien sind bei der CDC Publikation Biosicherheit in Mikrobiologie und biomedizinischen Labors (BMBL), 5. Auflage erhältlich.

1. Vorbereitung und Wartung von p. aeruginosa

  1. Streak p. Aeruginosa aus einem gefrorenen bestand auf einer nährbodenplatte LB (Lysogeny Brühe). Inkubieren Sie 16 bis 24 h bei 37 ° C
    Hinweis: Führen Sie p. Aeruginosa Experimente innerhalb eines BSL-2 biologischen Sicherheitsschrank zu Sterilität zu gewährleisten. Verwenden Sie entsprechende Sicherheitsvorkehrungen um pathogenen Infektion oder Verunreinigung zu vermeiden.
  2. Übertragen Sie diese Platte auf 4 ° C. Diese Platte werden bei 4 ° C aufbewahrt und Kulturen bis zu einer Woche impfen verwendet. Nach einer Woche zu dekontaminieren Sie und verwerfen Sie die Platte und machen Sie eine neue LB-Streifen-Platte zu.
    Hinweis: P. Aeruginosa Virulenz verringert sich nach längerer Lagerung.
  3. Impfen Sie zwei Tage vor der Einrichtung Assay Platten, 3-5 mL sterile LB-Brühe mit einer einzigen Kolonie von p. Aeruginosa von der Platte in 1.1 gemacht. Inkubation bei 37 ° C für 12 bis 16 Uhr.
    Hinweis: Nicht länger als 16 h inkubieren. In reiche flüssige Kulturen beginnt p. Aeruginosa PA14 zu lösen.
  4. Sterile 10 cm Platten mit langsamen töten Medien vorbereiten (3 g NaCl, 3,5 g Pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL Phosphatpuffer (Menge pro Liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) und 868 mL KH2PO4 (1 M)) und 18 g Agar/L).
    Hinweis: Bereiten Sie Platten vor der Zeit. Sie können bis zu 3 Wochen in einem luftdichten Behälter bei 4 ° c aufbewahrt werden
  5. Säen Sie jede 10 cm langsam töten Platte (SK-Platte) mit 350 μL von p. Aeruginosa von frischen Nacht LB-Kultur. Mit einem sterilen bakterielle Spreader Bakterien gleichmäßig über die Oberfläche der Medien und in einer biologischen Sicherheitsschrank BSL-2 trocknen lassen.
  6. Inkubieren Sie Platten bei 37 ° C für 24 h.

2. Vorbereitung der RNAi-Bakterien

  1. Streifen, oder Pin-Transfer gewünschte Bakterienstämme RNAi-haltigen auf LB-Agar-Platten mit geeigneten Antibiotika (Carbenicillin bei 100 µg/mL) und Tetracyclin bei 15 µg/mL für Ahringer und Vidal-Bibliotheken aus einem gefrorenen bestand.
    Hinweis: Beim Arbeiten mit apathogen Bakterien verwenden entweder eine BSL-2 A / B biologische Sicherheitswerkbank oder Laminar-Flow ein BSL-1 Haube, Sterilität der Kulturen zu gewährleisten und die Möglichkeit einer Kreuzkontamination der Bibliothek zu minimieren.
  2. Inkubieren Sie Platten für 24 h bei 37 ° c
  3. Speichern Sie die Platten bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen.
    1. Nach zwei Wochen die Platten zu verwerfen und mit frisch zubereiteten Platten zu ersetzen.
  4. Testen Sie mehrere RNAi Stämme parallel durch einzeln impfen eine einzige Kolonie von jeder Klon in 4 mL LB Carbenicillin ergänzt, in einem einzigen gut von einer 24-Well Deep-Well-Platte oder in ein steriles Röhrchen.
    Hinweis: Tetracyclin wurde berichtet, um die Effizienz der RNAi zu reduzieren. Verwenden Sie es nicht in diesem Medium.
  5. 24-Brunnen Tiefbrunnen Platten in einem schütteln Inkubator für multiwell-Platten optimiert und Inkubation bei 37 ° C 16 h unter Schütteln bei 950 u/min.
    Hinweis: Es ist schwer, einheitliche Bakterienwachstum in multiwell-Platten mit einer konventionellen schütteln Inkubator zu erhalten. Der schüttelnde Inkubator muss schütteln bei mindestens 750 u/min in Reihenfolge für die Kulturen richtig wachsen zu können. In Abwesenheit von einem spezialisierten Shaker ist es möglich, jede Kultur in eine einzelne Röhre zu wachsen. Kulturen können in der 24-Well-Platte für Zentrifugation danach übertragen werden, falls gewünscht.
  6. Sammeln Sie Bakterien, indem Sie für 5 Minuten bei 2.000 x g zentrifugieren.
  7. Dekantieren Sie Überstand durch Umdrehen der Plattenrandes und kräftig schütteln. Aufschwemmen Sie RNAi Bakterien in 100 µL der basalen S (5,85 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4 in 1 Liter Reinstwasser aufgelöst und durch Autoklaven sterilisiert).
  8. Pipette resuspendierte Bakterien in eine entsprechende Anzahl von Brunnen einer multiwell NGM-Platte (Nematode Wachstumsmedien, 3 g NaCl, 2,5 g Pepton, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mL Phosphatpuffer (Menge pro Liter: 132 mL K2HPO4 (1 M) und 868 mL KH2PO4 (1 M)), und 18 g Agar pro Liter Wasser) mit IPTG (1 mM Endkonzentration) und Carbenicillin (100 μg/mL Endkonzentration) ergänzt.
    1. Verwenden Sie 3,5 mL NGM Medien pro Bohrloch 6-Well-Platte, 1 mL pro Bohrloch einer 24-Well-Platte oder 150 µL pro Bohrloch des 96-Well-Platte.
    2. Verwenden Sie 100 μl/Well von Bakterien, für 6-Well-Platte; 50 μL/gut für 24-Well; oder 20 μL/gut für 96-Well-Platte. Trocknen lassen.
      Hinweis: Trocknung wird normalerweise in einer sterilen Fluss Kapuze, schnelle und gleichmäßige Trocknung zu fördern durchgeführt. Gleichmäßige Trocknung ist sehr wichtig. Vermeiden Sie zu trocknen, Risse im Agar fördert Würmer wühlen. Dies führt zu Verlusten und mögliche Verstopfung der Liquid-Handling-Systeme Wurm.
  9. Die vorbereiteten Platten sofort verwenden oder sie bei 4 ° C für bis zu zwei Wochen für die spätere Verwendung speichern.
    Hinweis: Um Platten Austrocknen verhindert wird, sie können mit Kunststoff Paraffin Film versiegelt oder in einem dicht verschlossenen Behälter mit feuchten Papiertüchern.

3. Wartung und Vorbereitung von C. elegans

Hinweis: Vor dem Beginn der Experimente, erstellen Sie eine synchronisierte Bevölkerung von trächtigen, Erwachsene hermaphroditischen Würmer wie folgt.

  1. Waschen trächtigen Erwachsene (d. h. mit mehrere Embryonen in die Gonade sichtbar) von 4-6 10 cm NGM Platten in ein 15 mL konische Röhrchen durch Zugabe von 4 mL S basale Platte vorsichtig schwenken und dann in ein 15 mL konische Röhrchen Gießen.
  2. Pellet-Würmer durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 30 Sekunden.
  3. Aspirat überstand, kümmert sich nicht um den Wurm Pellet zu stören.
  4. Fügen Sie 3,5 mL Wurm Bleichmittel-Lösung (Endkonzentration 0,5 M NaOH, 1 % Natriumhypochlorit in sterilem Wasser), der Wurm Pellet und Mix durch Umkehrung für 1 Minute.
  5. Kurz Wirbel und Zentrifuge bei 1.000 x g für 30 Sekunden.
  6. Aspirieren oder dekantieren des Überstands, kümmert sich nicht um den Wurm Pellet zu stören.
  7. Das Wurm-Pellet 3,5 mL frische Wurm Bleichmittel-Lösung hinzufügen.
  8. Mischen Sie kräftig Würmer in Bleichmittel-Lösung. In regelmäßigen Abständen (ca. alle 10 Sekunden) Sichtprüfung Würmer unter dem sezierenden Mikroskop. Achten Sie auf Wurm Nagelhaut zu brechen, Freigabe Eier. Einmal wurden die meisten der erwachsenen Würmer gelösten (~ 95 %), verdünnen Sie Bleichmittel zu 15 mL mit basalen S, Verdauung zu stoppen.
    Hinweis: Eierschalen sind widerstandsfähiger als adulten Geweben zu bleichen, aber sie können bei längerer Einwirkung aufgelöst werden. Zur Vermeidung von Ei Auflösung setzen Sie Eier um Bleichmittel-Lösung für länger als 7 Minuten Wurm nicht aus. Eierschalen sind übermäßig beschädigt, werden die Embryonen sterben.
  9. Pellet-Embryonen bei 1.000 x g für 30 Sekunden und Aspirieren oder dekantieren des Überstands ohne Entfernen der Pellets von Embryonen.
  10. Aufschwemmen Sie Würmer in S zu einem Endvolumen von 15 mL basale verbleibenden Bleichmittel-Lösung verdünnen.
  11. Wiederholen Sie den waschen (3,9-3.10) drei weitere Male für eine Gesamtmenge von 4 aufeinander folgenden Waschungen.
  12. Aspirieren Sie nach der vierten Wäsche überstand und summieren Sie sich zu 5 oder 6 mL steril S Basal in der 15 mL konische Röhrchen. Ziel ist es, Embryonen zu einer Konzentration von ~ 50 Würmer pro Mikroliter aufzuwirbeln.
    Hinweis: Die Höhe der basalen S richtet sich nach der Größe des Pellet-Ei; Je größer das Pellet ist mehr S basale notwendig.
  13. Inkubieren Sie das konische Rohr über Nacht auf einer Tischplatte Rotator bei Raumtemperatur oder 48 h bei 15 ° c Larven schlüpfen, aber Larvalentwicklung wird in der Phase L1 (L1 Diapause) durch Nährstoff Entbehrung verhaften.
  14. Untersuchen Sie die Embryonen unter dem sezierenden Mikroskop um sicherzustellen, dass die meisten von ihnen haben geschlüpft und im L1 Stadium der Entwicklung verhaftet.
  15. Bestimmen Sie die Anzahl der Wurm 20 µL Wurm Prep und verdünnt es mit 80 µL der basalen S. Pipette 10 µL verdünnter Wurm Lösung direkt auf einen leeren Teller der NGM. Wiederholen Sie 2 weitere Male.
    1. Zählen Sie die Larven an jeder Stelle und bestimmen Sie die durchschnittliche Anzahl. Teilen Sie diesem Durchschnitt durch 2, um eine ungefähre Anzahl von Würmern pro Mikroliter in die Wurm-Prep zu erhalten. Wurm Preps können dann für Vermehrung Platten oder für Experimente verwendet werden.
      Hinweis: Nach 4-5 Tagen werden ausgehungerte Larven beginnen zu sterben; entsorgen Sie die Vorbereitung zu diesem Zeitpunkt.
  16. Für die Vermehrung der Sorte, eine angemessene Anzahl von L1 Würmer (5.000-6.000) auf 3-4 10 cm NGM Teller getupft mit, Pipette konzentrierte OP50 E. Coli – "Supernahrungsmittel" (E. Coli OP50 spotted bei 25 X-Konzentration (d.h. 1 L des über Nacht OP50 Kultur in LB gewachsen liefert 40 mL 25 X OP50 Supernahrungsmittel); 2 mL dieser konzentrierten Bakteriensuspension sind auf jede 10 cm NGM Platte gesichtet).
  17. Um Platten für Experimente vorzubereiten, führen Sie einen der folgenden (für "Basic" Verwendung 3.17.1 Protokolleinstellungen für die "RNAi-Bildschirm einrichten" Verwendung Schritte 3.17.2 - 3.17.4 je nach Bedarf):
    1. Pipette ~ 5.000 Würmer/10 cm Platte mit RNAi oder OP50 Supernahrungsmittel ausgesät.
    2. Pipette ~ 500 Würmer/Brunnen in einem 6-Well-Platte mit RNAi ausgesät.
    3. Pipette ~ 300 Würmer/Brunnen in einer 24-Well-Platte mit RNAi ausgesät.
    4. Pipette ~ 100 Würmer/Brunnen in einer 96-Well-Platte mit RNAi ausgesät.
      Hinweis: Anweisungen wie RNAi ausgesät wurde finden Sie Schritte 2,7-2,9 in Vorbereitung der RNAi-Bakterien.
  18. Wenn eine fruchtbare Sorte Würmer verwendet wird, brüten Sie Würmer bei 25 ° C ~ 44-48 h. Gebrauch diese Würmer so schnell wie möglich nach die Bevölkerung das entsprechende Alter erreicht hat. Dies minimiert die Auswirkungen von Ei schlüpfen innerhalb der Würmer während des Tests.
  19. Wenn die Belastung verwendet wird ist Temperatur-steril (z. B. fer-15(b26); FEM-1(HC17) oder glp-4(bn2)), brüten Würmer bei 15 ° C ~ 16 h und übertragen Sie dann auf 25 ° C für 44 h Entwicklung abzuschließen und verhindern Embryogenese.

4. Flüssigkeit töten Assay Setup (grundlegende Protokoll)

Hinweis: Dies ist ein Protokoll für ein Bakterienstamm und eine Quelle von Würmern.

  1. Mit einem Zelle Schaber, p. Aeruginosa aus ein SK-Platte entfernen und erneut ~ 5 mL S Basal. Scale-up bei Bedarf. Messung der optischen Dichte der Bakteriensuspension mit einem Spektralphotometer (OD600)
  2. 24 mL verdünnten bestand von p. Aeruginosa in basalen S bei OD600 ≈ 0,09 (3 X Endkonzentration) vorzubereiten. 4.6.2 für den endgültigen Inhalt pro Bohrloch zu sehen, und Volumen der bakteriellen Verdünnung entsprechend zu skalieren.
  3. Fügen Sie 21 mL flüssiger Medien langsam zu töten (3 g NaCl, 3,5 g Pepton/l ergänzt mit CaCl2 und MgSO4 , um eine Endkonzentration von 1 mM). Mit einer Mehrkanal-Pipette übertragen Sie 45 µL von Bakterien und Medien in jede Vertiefung ein 384-Well-Platte.
  4. Waschen Sie Würmer von ihrer Quelle (d.h.Schritt 3.17.1) in ein 50 mL konische Röhrchen und ermöglichen Sie Würmer sich unter Schwerkraft zu. Aspirieren Sie Überstand bis 5 mL. Aufschwemmen Sie in insgesamt 50 mL S basal.
  5. Wiederholen Sie 4.4 Schritt zweimal.
  6. Verwenden einen Wurm-Sorter, Sortieren Sie, ca. 22 Würmer in jede Vertiefung von 384-Well-Platte.
    Hinweis: Das Setup fällt jeder Wurm in ~1.1 µL Flüssigkeit. 22 Würmer belaufen sich auf 25 µL 70 µL/Well total Assay Volumen bringen.
    1. Die endgültige Zusammensetzung der einzelnen Brunnen besteht aus 70 µL. 45 µL dieses Bandes wird als bakterielle Medium hinzugefügt (0,03 OD600 Bakterien in 24 µL S basale und 21 µL SK ergänzt mit CaCl2 und MgSO4). Die anderen 25 µL ist mit den 22 Würmern hinzugefügt.
    2. Wenn der Sortierer verwendet hier nicht verfügbar ist (siehe Tabelle der Materialien), Würmer können verdünnt werden, um eine Endkonzentration von 1 Wurm/µL in S basale und pipettiert 25 µL/Well mit einer Mehrkanal-Pipette. Ergebnisse weisen jedoch erhöhte Variabilität. Alternativ ist es möglich, einen peristaltischen liquiden Dispenser zu verwenden, wie durch Leung und Kollegen19beschrieben.
  7. Nachdem die 384-Well-Platte Würmer einsortiert wurden, Dichtplatte mit einem gasdurchlässigen Film und inkubieren Sie Platten bei 25 ° C für 24-48 h.
  8. Zum gewünschten Zeitpunkt verwenden Sie einer Mikrotestplatte Unterlegscheibe, um die 384-Well-Platte mit basalen S waschen insgesamt 5 Mal.
    1. Nach der zweiten Wäsche Aspirieren Sie die meisten Medien, verlassen ~ 20 µL. kräftig schütteln Platten mit einer Mikrotestplatte Vortexer für mindestens 30 Sekunden um jeglichen Schmutz von der Unterseite der Brunnen zu lösen).
  9. Nachdem die letzte Wäsche, aspirat Überstand bis zu 20 µL. hinzufügen 50 µL 0.98 µM Nukleinsäure Fleck (siehe Tabelle der Materialien) / gut von 384-Well-Platte für eine Endkonzentration von 0,7 µM.
  10. Inkubation bei Raumtemperatur für 12-16 Uhr. Dieser Farbstoff färbt nur Tote Würmer. Nach der gewünschten Inkubationszeit Fleck waschen Platten mit Mikrotestplatte Unterlegscheibe um überschüssiges Öl zu entfernen (mindestens 3 Wäschen).
  11. Verwenden Sie für die Datenerfassung ein Spektralphotometer oder ein automatisiertes Mikroskop Durchlicht und Fluoreszenz (531 nm Anregung und 593 Emission) Bild.
    1. Verwenden Sie ein schwacher Vergrößerung Ziel damit ein Bild des ganzen gut erfasst werden.
    2. Alternativ können Sie Fluss Vermimetry. Diese Technik nutzt ein großes Objekt Durchflusszytometer als ein Wurm Fluorimeter, messen die Größe und die Fluoreszenz des Gesamtorganismus (d. h. C. Elegans) in einer Weise, die Durchflusszytometrie stark ähnelt.
  12. Verwenden Sie automatisierte Bildanalyse-Software (z. B. CellProfiler, ein Kostenloses Bild-Analyse-Studio basierend auf MatLab http://cellprofiler.org/), fluoreszierenden und totale Wurm Bereiche pro Bohrloch auf unvoreingenommene Weise zu berechnen.
    Hinweis: Die Quotient aus diesen Zahlen ist der Bruchteil Tod für jedes gut. Hätte man gut gebeizt 7 Würmer heraus von 20 gesamt, dann der Bruchteil Tod 0,35 oder 35 % umfasst.
    1. Vor dem ersten Gebrauch muss die automatische Bildverarbeitung-Pipeline durch manuelle scoring validiert werden. Dies geschieht durch den Vergleich der Ergebnisse aus der automatisierten Pipeline wird durch das visuell inspizieren Bilder Bruchteile von toten Würmer für jeden von ihnen die Note. Die Validierung stellt sicher, dass die Parameter für die automatisierte bildgebenden Verarbeitung korrekt sind und die Daten korrekt darstellen.

5. Anpassung für Screening mehrere C. Elegans Stämme oder Niederschlägen (RNAi Bildschirmmasken)

Hinweis: Dies ist ein RNAi-Bildschirm für einen 24-Well-Platte-Setup beschrieben.

  1. Fügen Sie 1 mL der basalen S pro Bohrloch einer 24-Well-Platte (siehe Schritt 3.17.3). Sanft schütteln Sie Würmer durch Schütteln der Plattenrandes, dann übertragen Sie Würmer auf eine leer, sterile 24 Deep-Well-Platte. Können Sie Würmer sich gravitativ (~ 5 Minuten).
  2. Aspirieren Sie überstand, so dass ca. 1 mL. 7 mL S Basal in jede Vertiefung hinzugeben.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.2 ein Minimum von 2 weitere Male. Nach dem letzten Waschen Aspirieren Sie überstand, verlassen ca. 400 µL.
  4. Mithilfe der Resampler-Funktion von dem Wurm Sorter sortiert 22 Würmer aus der 24-Well-Platte-Wurm-Suspension in jede Vertiefung ein 384-Well-Platte (jedes gut von einer 24-Well-Platte Erträge 8-12 Brunnen von 384-Well-Platte).
    1. Zur Vermeidung von Hunger pipette Bakterien vor der Sortierung in 384-Well-Platten (eine Sorte, die ausschließlich als Nahrung, wie OP50, dient oder einem pathogenen Stamm).
      Hinweis: Erreger können hinzugefügt werden, indem folgende Schritte 2,3-2,5 oder 6,4-6,5 und Nahrungsquelle Bakterien verdünnt und durch nach dem gleichen Schema wie bei p. Aeruginosahinzugefügt werden können.
  5. Nachdem die 384-Well-Platte Würmer einsortiert wurden, fügen Sie kleine Moleküle oder andere Experiment-spezifische Materialien hinzu.

6. Anpassung für E. faecalis

Hinweis: Es werden nur die Unterschiede von p. Aeruginosa Assay beschrieben.

  1. Bereiten Sie eine frische Quelle von E. Faecalis durch Schlieren Bakterien aus einem gefrorenen bestand auf einer Agarplatte BHI (Brain Heart Infusion) und Inkubation für 16 bis 24 h bei 37 ° C.
    Hinweis: Führen Sie E. Faecalis Experimente innerhalb eines BSL-2 biologischen Sicherheitsschrank zu Sterilität zu gewährleisten. Verwenden Sie entsprechende Sicherheitsvorkehrungen um pathogenen Infektion oder Verunreinigung zu vermeiden.
  2. Platten können bis zu eine Woche lang bei 4 ° C gelagert werden. Nach Ablauf dieser Frist zu ersetzen mit einem frischen Teller.
  3. Die Nacht vor dem Sortieren Würmer, impfen 3-5 mL sterile BHI mit einer einzigen Kolonie von E. Faecalis. Inkubieren Sie 12-16 h bei 37 ° C unter Rühren.
  4. Fügen Sie Bakterien in die Vertiefungen wie bei p. Aeruginosa (3 X Bakterien im basalen S OD600≈0.09).
    Hinweis: Für E. Faecalis, die endgültige Zusammensetzung gut ist: E. Faecalis (OD600≈0.03), BHI = 10 % V/V, mit dem restlichen Volumen bestehend aus S basal. Beachten Sie, dass 25 µL der basalen S wird mit Würmern geliefert werden.
    Hinweis: E. Faecalis produziert dicken Biofilme, die die fluoreszierenden Fleck aufsaugen was zu unscharfe Bildern. Umfangreiche waschen kann ausreichen, um diesen Biofilm zu entfernen. In diesem Fall können Würmer auf einen leeren Teller mit einer Mehrkanal-Pipette übertragen werden. Zur Erleichterung der Übertragung können Tween 20 S Basal, eine Endkonzentration von 0,1 % (V/V) Tween 20 in basalen S hinzugefügt werden. Dies hilft bei der Beseitigung der Würmer aus der Biofilm.

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Results

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Wichtige Parameter für die Testleistung

Ein richtiges Verständnis der zugrunde liegenden dieser Assay Biologie ist notwendig für die Problembehandlung und Optimierung der Assay. Zu diesem Zweck verweisen wir zunächst auf einige wichtige Papiere, die Aufklärung der Mechanismen der Pathogenese von p. Aeruginosa-vermittelte Tötung in liquid7,20. Unter der ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Assay (oder ähnliche Tests wo andere Krankheitserreger für p. Aeruginosa oder E. Faecalisersetzt werden) eignet sich für eine Vielzahl von Zwecken, einschließlich der Arzneimittelforschung. Es ist auch nützlich für grundlegende biologische Fragestellungen, z. B. Virulenzfaktoren, die Aufklärung der Host Verteidigung Bahnen, Identifizierung und Bestimmung der regulatorischen Maschinen der Wirt-Erreger-Interaktion beteiligt.

Obwohl p. Aeruginosa flüssige Tötung-...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Studie wurde von der Krebsprävention und Research Institute of Texas (CPRIT) Award RR150044, Welch Foundation Research Grant C-1930, und von den nationalen Instituten der Gesundheit K22 AI110552 verliehen an NVK unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
COPAS FP BioSorterUnion BiometricaGroßobjekt-Durchflusszytometer/Wurmsortierer
Cytation 5BioTek
EL406 WaschmaschinenspenderBioTek
Multitron ProInfors HT
24 Deep-Well RB BlockThermo Fisher ScientificCS15124
384-Well PlatteGreiner Bio-OneMPG-781091
Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)Menge pro Liter: 18 Gramm Agar, 3 Gramm NaCl, 2,5 Gramm Pepton, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml Phospatpuffer und 973 ml Milli-Q-Wasserplatten
mit langsamer Abtötung (SK)Menge pro Liter: 18 Gramm Agar, 3 Gramm NaCl, 3,5 Gramm Pepton, 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL Phospatpuffer und 973 mL Milli-Q Wasser
Slow Killing (SK) MediumMenge pro Liter:   3 Gramm NaCl, 3,5 Gramm Pepton, 1 ml CaCl2 (1 M), 1 ml MgSO4 (1 M), 25 ml Phosphatpuffer und 973 ml Milli-Q-Wasser
Lysogen-Bouillon (LB)USBiological Life SciencesL1520
Brian Heart Infusionsbrühe (BHI)Research Products International Corp50-488-526
WurmbleichlösungMenge pro 100 ml: 10 ml 5 M NaOH-Lösung, 20 ml 5%ige Natriumhypochloritlösung und 70 ml steriles Wasser
S Basalmengepro Liter: 5,85 Gramm NaCl, 6 Gramm KH2PO4, 1 Gramm K2HPO4, und 1 Liter Milli-Q Wasser
AgarUSBiological Life SciencesA0930
NaClUSBiological Life SciencesS5000
PeptonUSBiological Life SciencesP3300
CaCl2USBiological Life Sciences
MgSO4FisherScientific M63-500
Phospatpuffermengepro Liter: 132 mL K2HPO4 (1M) und 868 mL KH2PO4 (1M)
KH2PO4AcrosOrganics7778-77-0
K2HPO4USBiological Life SciencesP5100
5%ige NatriumhypochloritlösungBICCA7495.5-32
NaOH-LösungFisher ScientificSS255-1
Breathe-easyDiversified BiotechBEM-1
SYTOX Orange Nukleinsäure-FärbungFisher ScientificS11368
Bakterienstämme
P. aeruginosa (PA14)
< em>E. faecalis(OG1RF)
E. coli Superfood (OP50)
E. coli RNAi exprimierende Bakterien (HT115)
WormStämme
glp-4(bn2) (Beanan und Strome, 1992, PMID: 1289064)
PINK-1::GFP Reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)

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