Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

Zusammenfassung

Ein Protokoll, Antigen-spezifische T-Zell-Reaktionen in den Organen der Immunabwehr des Ifnar1^{- / -} Mausmodell für die Zika-Virusinfektion (ZIKV) zu bewerten ist beschrieben. Diese Methode ist von zentraler Bedeutung für die Untersuchung der zellulären Mechanismen des Schutzes und immunpathogenese ZIKV Impfstoffe und ist auch wertvoll für die Beurteilung der Wirksamkeit.

Zusammenfassung

Das Zika-Virus (ZIKV) kann Entzündungen im Immunabwehr Organe (z.B.Gehirn und Hoden), induzieren, führt zu das Guillain-Barré-Syndrom und die Hoden zu beschädigen. Während einer Infektion mit dem ZIKV nachweislich die Immunzellen in das Gewebe einzudringen. Die zellulären Mechanismen, die die Schutz- und/oder immunpathogenese diese Immunzellen während einer ZIKV Infektion zu definieren sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir Methoden, um die Virus-spezifischen T-Zell-Funktionalität in diesen Organen der Immunabwehr von ZIKV-infizierten Mäusen bewerten. Diese Methoden beinhalten ein) eine ZIKV Infektion und Impfstoff Impfung bei Ifnar1^{- / -} Mäusen; (b) Histopathologie, Immunfluoreszenz und Immunohistochemistry Assays, die Virus-Infektion und Entzündung im Gehirn, der Hoden und der Milz zu erkennen; (c) die Vorbereitung von einem Tetramer von ZIKV abgeleiteten T-Zell-Epitope; (d) die Erkennung des ZIKV-spezifischen T-Zellen in die Monozyten isoliert aus dem Gehirn, der Hoden und der Milz. Mit diesen Ansätzen ist es möglich, die Antigen-spezifische T-Zellen erkennen, die in der Immunabwehr Organe infiltriert haben und um die Funktionen dieser T-Zellen während der Infektion zu bewerten: potenzielle Immunschutz über Virus-Clearance und und/oder immunpathogenese die Entzündung noch verschlimmern. Diese Erkenntnisse können auch helfen, um den Beitrag der T-Zellen induziert durch die Impfung gegen ZIKV zu klären.

Einleitung

Die ZIKV ist ein Moskitos übertragene Flavivirus, die zuerst im Jahre 1947 in Uganda aus einem fieberhaften Rhesus-Makaken isoliert wurde. Vor kurzem hat die ZIKV eine gesundheitliche Notlage durch seine rasche Verbreitung in Nord-und Südamerika und die unerwartete Verbindung zur Mikrozephalie und Guillain-Barré-Syndrom^1,2,3geworden. Aus epidemiologischen Daten hat der ZIKV vermutet, die Ursache des Guillain-Barré-Syndrom in etwa 1 pro 4.000 Erwachsene⁴infiziert. Darüber hinaus wurde eine Korrelation zwischen der ZIKV und Hoden Infektion/Schaden im Mausmodell nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die ZIKV Infektion, unter bestimmten Umständen kann die Blut-Hoden-Schranke umgehen und schließlich zu Unfruchtbarkeit^{5 führen,} . Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Induktion von Schutz- oder pathologische Immunreaktionen während einer ZIKV Infektion vollständig zu verstehen.

Noch viel über die zelluläre Immunantworten auf der ZIKV gelernt werden. CD4⁺ und CD8⁺ T-Zell Reaktionen auf das Kapsid, Umschlag und Elementoptionen Protein 1 (NS1) eingehalten worden, im ZIKV-infizierten Affen und Menschen^6,7,-⁸. Bei Mäusen, mehrere Studien haben gezeigt, dass CD8⁺ T-Zellen spielen eine schützende Rolle bei der Kontrolle der ZIKV Replikation^9,10,11. Wichtig ist, Jurado Et Al. zeigten, dass eine ZIKV Infektion in den Zusammenbruch der Blut - Hirn-Schranke und perivaskuläre Infiltration von CD8 führt⁺ T-Effektorzellen in den Hoden von Ifnar1^{- / -} Mäusen. Darüber hinaus hat sie gezeigt, dass CD8⁺ T Zellen anstiften ZIKV verbundenen Lähmung und scheinen eine Rolle in der neonatalen Gehirn Immunpathologie zu spielen. In einer früheren Studie, wir die ZIKV-E-_294-302 -Tetramer vorbereitet und zeigte, dass ZIKV-spezifische CD8⁺ T Zellen in das Gehirn und Rückenmark von ZIKV infiziert Ifnar1^{- / -} Mäusen, die wichtige Implikationen für die Gestaltung haben können gibt es und Entwicklung des ZIKV Impfstoffe¹⁰.

In Reaktion auf die dringende Notwendigkeit der Impfung gegen ZIKV Infektion zu verhindern sind mehrere Impfstoffe in den präklinischen Stadien der Entwicklung, einschließlich der RNA-Impfstoffen, rekombinanten Vektor-basierte Impfstoffe und gereinigtes Protein Untereinheit Impfstoffe. Die Plasmid-DNA-Impfstoff ist in Phase 1 klinischen Studien¹². Die Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von ZIKV Impfstoffen ist daher wichtig. Ein Vorteil der Impfstoffe ist ihre Fähigkeit, spezifische T-Zell-Reaktionen hervorrufen, die wichtig für den Schutz gegen die ZIKV sein können. Mithilfe von ZIKV abgeleiteten T-Zell-Epitop-bezogene Tetramers der T-Zell-Immunoreactivity induziert durch ein Adenovirus-Vektor-basierte ZIKV Impfstoff immunisierten Mäusen nachgewiesen werden konnte, und M und E Glykoproteine erwiesen sich als robuste Antigen-spezifische CD8 induzieren⁺ T-Zell-Immunoreactivity-¹³.

Während einer Virusinfektion ist die Anerkennung der Peptid-Antigene, die durch große Histocompatibility complex (MHC) Moleküle an den T-Zell-Rezeptor (TCR) präsentiert einen wichtigen T-Zell-vermittelten Mechanismus für den Schutz der Host-¹⁴. Basierend auf dieser Theorie, ist Tetramer-Technologie ein einzigartiges Werkzeug, die Rollen, die Antigen-spezifische T-Zellen spielen bei der Regulation der Immunantwort¹⁵aufzuklären. Dieses Protokoll beschreibt die Einrichtung der Ifnar1^{- / -} Maus-Modell für ZIKV Infektionen und die Detektion von reaktiven T-Zellen in der Milz, Gehirn und Hoden der Mäuse mit Tetramer Technologie. Darüber hinaus haben wir die ZIKV-E-_294-302 -Tetramer erkennen und bewerten von T-Zell-Immunoreactivity durch ein ZIKV Impfstoff (AdC7-M/E) bei immunisierten Mäusen induziert. Diese Studie enthält Anleitungen für die Untersuchung von T-Zell-Reaktionen in den Organen der Immunabwehr und dient als Referenz für die Einsatzmöglichkeiten in der Plazenta oder fetalen Gehirns.

Protokoll

Tierversuche wurden von den institutionellen Animal Care und Verwendung Committee des National Institute für virale Disease Control and Prevention, CDC China genehmigt. Alle Experimente wurden durchgeführt, nach der institutionellen Animal Care und tierischen Protokolle Use Committee genehmigt.

(1) Virus-Infektion

1. Halten Sie Erwachsener (6 bis 8 Wochen alten) Ifnar1^{- / -} (50 % Männer und 50 % weiblich) Mäuse in standard Pathogen-freies (SPF) Sonderbedingungen, und lassen sie regelmäßig Zugang zu Nahrung und Wasser.
2. Die Ifnar1^{- / -} Mäuse mit der ZIKV über eine Retro-Orbital Inokulation von 100 µL der ZIKV in einem Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Puffer mit 1 x 10⁴ Schwerpunkt-bildenden Einheiten (FFUs) des Virus zu infizieren. Ebenso bieten Sie Kontroll-Mäusen mit einem gleichen Volumen von PBS.
   Achtung: Infizieren Sie die Mäuse unter ABSL2 Bedingungen zu und führen Sie diese Verfahren mit Viren infizierte Mäuse im Kabinett der Biosicherheit.
3. Überwachen Sie das Gewicht und die klinischen Symptome (Zittern, gestaffelte März, bilaterale schlaffen Hind Gliedmaßen) von den Mäusen täglich für 15 Tage.

2. Impfung mit dem Impfstoff ZIKV

1. Verwenden Sie Ifnar1^{- / -} (50 % Männer und 50 % weiblich) Mäuse zwischen 6 und 8 Wochen alt. Halten Sie die Mäuse in SPF Einheitsbedingungen 18 – 29 ° C und einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus mit Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser.
2. Die Ifnar1^{- / -} Mäuse mit dem ZIKV-Impfstoff zu impfen: injizieren 100 µL AdC7-M/E [4 x 10¹⁰ (Viruspartikel)] in PBS-Puffer über eine intramuskuläre Injektion (i.m.-Route) mit einer 1 mL Spritze mit einer 23-G-Nadel.
3. In ähnlicher Weise injizieren Sie Kontroll-Mäusen mit einem gleichen Volumen von PBS.

3. Isolation von Monozyten aus der Milz

Hinweis: Die Isolation von Monozyten aus der Milz wird beschrieben, wie bereits erwähnt,¹⁶.

1. Die immunisierten und ZIKV-infizierten Mäusen 7D nach Inokulation mit einer 5 % Isofluran Concentrationin 100 % Sauerstoff (mit einer Durchflussmenge von 1 L/min) zu betäuben. Die Mäuse durch zervikale Dislokation einschläfern. Dann Tauchen Sie sofort die gesamte Maus zu 75 % Ethanol.
   Achtung: von diesem Schritt vorwärts, sollten alle experimentelle Verfahren aseptisch in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden.
2. Befestigen Sie die Glieder der (euthanasierten, zuvor infiziert/geimpft) Mäuse mit Nadeln auf die Hartschaumplatte mit dem Bauch nach oben.
3. Schneiden Sie die Haut entlang der Abdominal-Mittellinie auf dem Thorax mit einem sterilen Skalpell, die Bauchmuskeln mit einer Schere schneiden, aussetzen der Bauchhöhle, und entfernen Sie vorsichtig die Leber.
   Hinweis: Die lange, dunkelroten Orgel auf der linken Seite des Magens ist die Milz.
4. Die Milz zu entfernen, spülen Sie ihn 3 X mit PBS-Puffer, kein Blut zu entfernen, und legen Sie sie in 1,5 mL eiskaltes Medium in Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Halten Sie die Milz auf Eis.
5. Um eine einzelne Zelle Suspension aus der Milz zu erzeugen, legen Sie die Disposition(en) auf eine sterile 40 µm-Zelle Sieb oben auf eine 50 mL-Tube und 2 mL eiskaltes RPMI Medium mit 10 % fetalen Rinderserum (FBS). Verwenden den Kolben der Spritze 5 mL, mechanisch zerdrücken Sie der Organe und fügen Sie Medium hinzu, bis die Orgel voll Boden durch das Gitter wurde.
6. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube und 600 X g für 5 min bei 4 ° c zentrifugiert Den überstand zu entfernen.
7. Aufschwemmen der Zellen mit 5 mL Erythrozyten (RBC) Lysis Puffer (NH₄Cl, Na₂EDTA und KHCO₃; siehe die Tabelle der Materialien) und die Lyse Reaktion bei Raumtemperatur für 5 – 6 min inkubieren.
8. Stoppen Sie die RBC-Lyse mit 10 mL eiskaltes RPMI/FBS Medium zu und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 600 X g für 5 min bei 4 ° C. Den überstand zu entfernen.
9. Aufschwemmen der Zellen mit 10 mL der kompletten RPMI Medium (RPMI mit 10 % Vol/Vol FBS und 100 U/mL Penicillin-Streptomycin). 10 µL Zellsuspension auf eine kleine Tube übertragen, mischen Sie es mit 10 µL 0,4 % wt/Vol Trypan blau und die Anzahl der Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer.

4. Isolierung von Monozyten aus dem Gehirn und Hoden

1. Die ZIKV-infizierten männlichen Mäusen 7D nach Inokulation mit 5 % Isofluranein 100 % Sauerstoff (mit einer Durchflussmenge von 1 L/min) zu betäuben. Die Mäuse durch zervikale Dislokation einschläfern. Dann Tauchen Sie sofort die gesamte Maus zu 75 % Ethanol.
   Achtung: Von diesem Schritt ab, müssen alle experimentelle Verfahren aseptisch in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden. Die Isolierung von Monozyten aus dem Gehirn und den Hoden wird beschrieben, wie bereits erwähnt,¹⁷.
2. (Euthanasierten, zuvor infizierte) männlichen Maus in Bauchlage auf ein Schneidebrett zu immobilisieren.
3. Sichern Sie die Kopfhaut mit einer geraden Zange 1 x 2 Zähne, und verwenden Sie Iris Schere, um eine Mittellinie Einschnitt auf der Kopfhaut, den Schädel aussetzen zu machen.
4. Klemmen Sie die beiden Seiten der Bahnen mit scharfen Pinzette und beheben Sie das Gehirn zu. Ein Tipp der scharfen Schere Iris in das Foramen Magnum und der Schädel seitlich einschneiden. Wiederholen Sie diesen Schritt für die andere Seite.
5. Verwenden Sie scharfe Iris Schere zu schneiden Sie vorsichtig aus dem gleichen Hohlraum auf der Mittellinie in Richtung der Nase. Versuchen Sie, das Ende der Schere so oberflächlich wie möglich zu vermeiden, das Gehirn zu verletzen.
6. Heben Sie das Gehirn mit der Pinzette und verwenden Sie scharfen Iris Schere, um die Hirnnerven Fasern sorgfältig zu sezieren. Entfernen Sie das Gehirn mit der Pinzette und legen Sie sie in einem 15 mL-Tube mit 5 mL eiskaltes RPMI/10% FBS Medium.
7. Greifen Sie die Bauchhaut mit Zange und mit scharfen Iris Schere machen einen längs-Schnitt durch das Integument und Bauchwand und setzen den untersten Teil des Bauches. Drücken Sie die Hoden bis zu den Schnitt. Sanft ziehen Sie die Fettschicht mit einer Pinzette und setzen Sie eine kugelige Hoden auf beiden Seiten.
8. Verwendung scharfer Iris Schere zum sorgfältig die Fettschicht und Nebenhoden sezieren. Legen Sie die Hoden in einer 15 mL Tube mit 5 mL eiskaltes RPMI/10% FBS Medium mit der Pinzette.
9. Um eine einzelne Zelle Suspension aus dem Gehirn oder Hoden zu erzeugen, legen Sie die Orgel auf einem sterilen Zelle Sieb mit einer Maschenweite 100 µm auf eine 50 mL-Tube und 2 mL eiskalte RPMI/10% FBS Medium. Mit den Kolben einer 5 mL Spritze, zerdrücken Sie die Orgel und fügen Sie Medium hinzu, bis das Organ vollständig durch die Maschen gemahlen ist.
10. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL-Tube und 600 X g für 5 min bei 4 ° c zentrifugiert Den überstand zu entfernen.
11. Aufschwemmen Sie die Zellen mit 5 mL 30 % Dichte Gradienten Medium und fügen sie dann sehr langsam, 2 mL 70 % Dichte Gradienten Medium in einer 15 mL Tube.
12. Schalten Sie die Bremse und Zentrifugieren Sie der Rohre bei 4 ° C bei 800 X g für 30 min. erhalten die Lymphozyten aus der Mittelschicht.
13. Übertragen Sie die Interphase zu einem frischen 15-mL-Tube, fügen Sie 10 mL kaltes RPMI/10% FBS Medium und Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g für 10 min bei 4 ° c Den überstand zu entfernen.
14. Aufschwemmen Sie die Zellen mit 10 mL eiskaltes RPMI/FBS Medium und Zentrifugieren sie 600 X g für 5 min bei 4 ° C. Den überstand zu entfernen.
15. Die Zellen mit 10 mL der kompletten RPMI Medium aufschwemmen und die Anzahl der Zellen wie in Schritt 3,9.

5. Tetramer Vorbereitung

1. Plasmide, die mit dem Ausdruck der extrazellulären Domänen des H-2D^b mit einem biotinylierte Website Tag auf dem C-Terminus des α3-Bereichs und β₂m mithilfe des pET28a-Vektors mit einem NdeI und XohI Einschränkung Seite¹⁸zu konstruieren.
2. Express und bereiten Einschlusskörperchen von H-2D^b und β₂m²⁰bereits beschrieben.
3. Renaturierung und Reinigen der MHC-Peptid Komplex H-2D^b-E_294-302.
   1. 200 mL einer refolding Lösung [100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM L-Arginin, 2 mM EDTA-Na, 5 mM GSG und 0,5 mM GSSG] vorzubereiten. Hinzufügen von Protease-Inhibitoren: 2 mL Phenylmethylsulphonyl Fluorid (PMSF, Lager 100 mM), 100 µL Pepstatin (Lager 2 mg/mL) und 100 µL Leupeptin (Lager 2 mg/mL). Kühlen Sie den Puffer bei 4 ° C für 30 min.
   2. H-2D-^b, β₂m und Peptid der refolding Projektmappe hinzufügen.
      1. Injizieren Sie 500 µL β₂m aufgelöst in einer Guanidin-Lösung (30 mg/mL Brühe) mit einer Spritze. Hierzu verwenden Sie eine 23 G-Nadel mit einer 5 mL Spritze und injizieren Sie β₂m in refolding Lösung tropfenweise. Halten Sie die Lösung langsam und ständig rühren bei 150 u/min bei 4 ° C.
      2. Nach β₂m in der refolding Lösung aufgelöst worden ist, lösen Sie 2 mg E_294-302 Peptid in 200 µL von DMSO und injizieren Sie schnell in die refolding Lösung mit einer Pipette zu. Rühren Sie die Lösung langsam bei 150 u/min bei 4 ° C für 15 Minuten.
      3. 1,5 mL H-2D^b aufgelöst in einer Guanidin-Lösung zu injizieren. Halten Sie die Stir Bar drehen bei 150 u/min für die umfaltung der H-2D^b bei 4 ° C für 8 – 10 h.
         Hinweis: Die Lösung wurde in einem geschlossenen Kasten in einem kalten Raum gelegt.
   3. Das schnittsicheren Protein in einer Druckkammer mit einer 10 kDa-Membran zu konzentrieren. Den Puffer [20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl] an die Kammer auszutauschen und zu einem Endvolumen von 30 – 50 mL zu konzentrieren.
   4. Die refolding Lösung auf einem Zentrifugenröhrchen übertragen und mit 2.500 X g für 15 min bei 4 ° c drehen
   5. Den überstand sorgfältig auf 10 kDa zentrifugale Filter übertragen und weiter zu einem Endvolumen von 500 µL bei 2.500 X g für 30 min zu konzentrieren.
   6. Den überstand auf eine frische Rohr übertragen und drehen es 12.000 x g für 15 min. reinigen das Protein mit S200 10/300 GL gel aktivem Chromatographie.
   7. Den MHC-Komplex-Gipfel zu sammeln und zu einem Endvolumen von 350 µL zu konzentrieren.
4. Um eine 500 µL Reaktionsvolumen für biotinylierungen zu erzeugen, fügen Sie die Regenten in folgender Reihenfolge: 100 µL der Lösung A [0.5M Bicine (pH 8,3)], 100 µL Lösung B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 µΜ Biotin), 100 µL zusätzliche d-Biotin (500 µΜ Biotin) , 20 µL BirA Enzym (60 µg), 0,5 µL Pepstatin (2 mg/mL) und 0,5 µL Leupeptin (2 mg/mL). Inkubieren Sie das Reaktionsgefäß über Nacht bei 4 ° c
   Achtung: Keine hinzu jede EDTA die Biotinylating Reaktion.
5. Reinigen der MHC mit einem S200 10/300 GL Gel Filtration Spalte, jede zusätzliche Biotin zu entfernen.
6. Bestimmen Sie die Biotinylating-Effizienz mit einem Streptavidin-Shift-Test¹⁸.
   1. Bereiten Sie drei Proben, A, B und C für 30 min auf Eis. Dann analysieren Sie die Ergebnisse durch eine 10 % SDS-PAGE. Probe A besteht aus 8 µL biotinylierte MHC-Moleküle und 2 µL Austausch Puffer, Probe B 8 µL biotinylierte MHC-Moleküle und 2 µL Streptavidin (20 mg/mL) und Probe C von 2 µL Streptavidin (20 mg/mL) und 8 µL-Austausch-Puffer.
      Vorsicht: Nicht kochen der Probenmaterials.
7. Multimere biotinylierte MHC-Moleküle zu bilden.
   1. Produzieren Sie Tetramer durch Mischen der biotinylierte E_294-302 Peptid-H₂D^b Komplex mit Phycoerythrin-Label Streptavidin bei einem mol-Verhältnis von 1:5 bis eine vollständige Bindung aller biotinylierte MHC-Moleküle zu gewährleisten.
   2. Berechnen Sie die Höhe der Streptavidin-Konjugat für Tetramerization benötigt.
      1. Die Maulwürfe der MHC-Peptid-komplexe entfallen die Proteinkonzentration und das molare Gewicht zu bestimmen (Beispiel: 1,8 mg Gesamt-Protein = 40 Nmol).
      2. Berechnen Sie die Maulwürfe Streptavidin-Konjugats benötigt durch die Molen des MHC/Peptids durch 5 dividiert (Beispiel: 40/5 = 8 Nmol Streptavidin-Konjugat).
      3. Berechnen Sie die Menge von Streptavidin (in µg) benötigt je nach Streptavidin-Konjugat (Beispiel: Streptavidin-PE [300.000 g/M] → 8 Nmol benötigt = 2.400 g).
   3. Unterteilen Sie in 10 Proben Streptavidin-Phycoerythrin. Ein Röhrchen mit der biotinylierte E_294-302 Peptid-H₂D^b Komplex, in einem Abstand von 20 min. Fügen Sie jede Probe hinzu. Nach dem Laden der letzten Probe, inkubieren Sie das Reaktionsgefäß bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln.
8. Gelten die Multimerized Reagenzien in ein Rohr 100 kDa Spin und durch Zentrifugation bei 2.000 X g bei 4 ° C auf ein Volumen von konzentrieren < 100 µL.
9. Die Probe in der Spin-Röhre bis 4 mL mit PBS (pH 8,0) verdünnen und erneut zu konzentrieren < 100 µL.
10. Wiederholen Sie die Buffer Tausch Schritt mit PBS-Puffer (pH 8,0) 4 X.
11. Füllen Sie das Gesamtvolumen wieder auf 500 µL PBS (pH 8,0) verwenden. Konzentration der Probe zu einer geschätzten Konzentration von 2-2,5 mg/mL bei 2.000 X g bei 4 ° c Speichern Sie das Sample im Dunkeln bei 4 ° C.

6. die Durchflusszytometrie

1. Inkubieren Sie die Zellsuspensionen (aus Schritt 3,9 und/oder Schritt 4.15) bei 4 ° C mit 0,1 µL Anti-Murine CD16/CD32 Fc-Rezeptor blockierende Reagenzien pro 20 µL (Verdünnung Faktor 1: 200) für 10 min, um unspezifische Bindung zu verhindern.
2. Zentrifugieren Sie das Tetramer Rohr auf 20.000 X g für mindestens 15 min bei 4 ° C.
3. Eine 96-Well-Platecontaining 1 x 10⁶ Zellen jeweils gut 20 µL Zellsuspension hinzufügen.
4. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen des E_294-302 Tetramer Mix, alle experimentellen Röhren zu beflecken. Bereiten Sie einen Überschuss von 15 % des Gesamtvolumens von dieser Mischung auf Konto für Pipettier Fehler. Die E-_294-302 -Tetramers (2 mg/mL, 1 µL/Test) in FACS Puffer verdünnen (PBS, 0,5 % FBS) so, dass jeder Test 20 µL des E-_294-302 -Tetramer-Mix hinzugefügt wird.
5. Die 96-Well-Platte 20 µL des E-_294-302 -Tetramer-Mix hinzufügen. Bis zum Ende dieses Schrittes sollte das Endvolumen in jedes gut 40 µL.Incubate die Platte im Dunkeln bei Raumtemperatur für 30 min sein.
6. Die Zellsuspension Primärantikörper (FITC konjugiert oder APC-konjugierten Anti-CD3 (0,2 mg/mL), PerCP-konjugierten Anti-CD8 (0,2 mg/mL)) 1 µL/Test hinzu, und inkubieren Sie es dann bei 4 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.
7. Waschen Sie die Zellen 2 X mit 2 mL FACS-Puffer und Zentrifuge bei 600 X g für 5 min. sorgfältig Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zellen mit 200 µL Puffer FACS.
8. Speichern Sie die Proben vorübergehend bei 4 ° C im Dunkeln, bis der durchflusszytometrischen Analyse.
9. Verwenden Sie die folgende gating Strategie für die durchflusszytometrischen Analyse.
   1. Erstellen Sie ein Tor auf diagonal gruppierten Unterhemden durch Auftragen einer forward Scatter (FSC) versus Seitenbereich Scatter (SSC).
   2. Dann, auf CD3 Tor⁺ Zellen durch Side Scatter (SSC) versus CD3; als nächstes Tor auf CD3⁺ CD8⁺ Zellen; zu guter Letzt skizzieren CD8^{+ +} Tetramer Zellen¹⁹.

7. die Histopathologie, Immunfluoreszenz und Immunohistochemistry Assay

1. Histopathologie assay
   1. Das Gehirn und Hoden Gewebe von der ZIKV-infizierten Ifnar1^{- / -} Mäusen 7D nach Inokulation zu sammeln und in 4 % Neutral gepufferte Formaldehyd zu beheben.
      Vorsicht: Paraformaldehyd ist giftig; tragen Sie geeignetsten persönliche Schutzausrüstung.
   2. Des Gewebes in Paraffin einbetten.
   3. Abschnitt des Gewebes bei 5 mm mit einer Vibratome.
   4. Färben Sie das Gewebe mit Hämatoxylin und Eosin (H & E).
2. Immunohistochemistry assay
   1. Deparaffinize, rehydrieren und Antigen-Abrufen des Gewebes Abschnitte, basierend auf Verfahren beschriebenen²¹.
   2. Behandeln Sie die Gewebeschnitte mit 3 % H₂O₂ mit PBS-Puffer (pH 7.6) für 10 min und mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) für 10 min zu blockieren.
   3. Inkubieren Sie die Gewebeschnitte mit Ratte-Anti-Maus-CD3-Antikörper (Verdünnung: 1/1.000) für 8 h bei Raumtemperatur und sie dann über Nacht bei 4 ° C inkubieren.
   4. Spülen Sie das Gewebe mit PBS und inkubieren sie dann, mit 3 Tropfen biotinylierte Sekundärantikörper (Verdünnung: 1/1.000) für 2 h bei Raumtemperatur, gefolgt von 3 Tropfen Avidin-Biotin-Peroxidase (Verdünnung: 1/200) bei Raumtemperatur für 30 Minuten.
   5. Binden, mit 3 Tropfen 30, 30-Diaminobenzidine-Tetrahydrochloride (Verdünnung: 1/1.000), wie zuvor beschrieben,²².
   6. Die Gewebeschnitte mit Mayers Hämatoxylin counterstain.
3. Immunfluoreszenz-assay
   1. Trocknen Sie die gefrorene Hoden Abschnitte (6 mm) für 10 min bei Raumtemperatur an der Luft.
   2. Mit eiskaltem Aceton für 10 min fixieren.
   3. In den Abschnitten mit PBS 3 X Waschen und mit einem blockierenden Puffer zu blockieren (1 % BSA, 0,3 % Triton, 1 X PBS) bei 37 ° C für 30 Minuten.
   4. Die Gewebeschnitte mit Primärantikörper (Z6) inkubieren (20 µg/mL) bei 4 ° C über Nacht.
   5. Spülen Sie das Gewebe mit PBS und Anwenden der Sekundärantikörper (Verdünnungsfaktor: 1/200) für 1 h bei 37 ° C.
   6. Die Gewebeschnitte mit PBS waschen und sie für Kerne mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) counterstain (Verdünnungsfaktor: 1/1.000), nach den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

Im Anschluss an diese Methoden entwickelten wir ein Mausmodell für ZIKV Infektionen. Ifnar1^{- / -} Mäusen im Alter von 6 – 8 Wochen wurden von der ZIKV durch Retroorbital Injektion mit 1 x 10⁴ Schwerpunkt-bildenden Einheiten (FFU) infiziert. Pathologische Symptome und Zeichen (Abb. 1A) sowie Gewichtsveränderungen (Abbildung 1B), wurden nach einer Infektion mit dem ZIKV in den Ifnar1^{- / -} Mäusen beobachtet. Die murinen Gehirn zeigte offensichtlich Ödem und Hyperämie (Abbildung 1C). Unterdessen die Hoden schrumpfte allmählich (Abbildung 1D). Darüber hinaus fanden sich pathologische Veränderungen und die Zerstörung von Gewebe im Gehirn und Hoden (Abb. 2A). Wir führten einen Immunfluoreszenz-Assay zur Erkennung der ZIKV in das Gehirn und Hoden (Abbildung 2B). Hohe Viruslast wurden von Immunostaining (Abbildung 2B) im Gehirn und Hoden festgestellt. Immunohistochemistry zeigte eine robuste Infiltration von CD3⁺ T-Zellen in das Gehirn von Mäusen nach der Infektion mit ZIKV (Abbildung 2C).

Um zu erkennen, und ZIKV-spezifischen T-Zell-Reaktionen zu bewerten, wir vorbereitet eine Maus MHC-ich H-2D^b-E_294-302 Tetramer. Das Peptid E_294-302 H-2D^b Renaturierung richtig helfen kann und liefern einen hohen Anteil an löslichen MHC-ich(Abbildung 3). In der Shift-Test konnte eine hohe Effizienz bei der biotinylierungen (Abb. 3B) beobachtet werden. Anschließend drei Streptavidin Fluoreszenz (APC, PE, und BV421) - markierten pMHC - ich Tetramers wurden hergestellt, um ZIKV-spezifischen T-Zellen (Abb. 3C) zu erkennen. Die PE-Label Tetramer hatte eine höhere Wirksamkeit der spezifischen CD8 erkennen⁺ T-Zellen im Vergleich zu der APC und BV421 beschriftet Tetramers, obwohl der Unterschied statistisch nicht signifikant war.

Mit der E-_294-302 -Tetramer, erkannt wir ZIKV-spezifische T-Lymphozyten in der Milz von infizierten Mäusen durch Durchflusszytometrie bei 7D nach Inokulation von ZIKV (3,49 ± 0,45 %). Auch, ähnlich wie in Abschnitt 3 dieses Protokolls, mit 4 Wochen Post-Immunisierung AdC7-M/E-Impfstoff beschriebene Methode, ZIKV-spezifische T-Lymphozyten in der Milz (6,89 ± 1.36 %) festgestellt (Abbildung 4).

Darüber hinaus erkannt wir die Lymphozyten infiltriert in die Immunabwehr Organe, wie Gehirn und Hoden, nach der ZIKV-Infektion. Die Tore wurden eingerichtet, um für CD3 wählen⁺CD8⁺ T-Zellen im gesamten Lymphozyten des Gehirns und der Hoden. Ein hohes Verhältnis von E_294-302 Tetramer-spezifischen T-Zellen im Gehirn nachgewiesen werden konnte (42,2 % in CD3⁺CD8⁺ T Zellen) und die Hoden (26,4 % CD3⁺CD8⁺ T Zellen) Lymphozyten (Abbildung 5).

Abbildung 1 : Charakterisierung der ZIKV Infektion in^{- / -} Mäusen Ifnar1. Ifnar1^{- / -} Mäusen im Alter von 6 – 8 Wochen von der ZIKV durch Retroorbital Injektion mit 10⁴ Schwerpunkt-bildenden Einheiten (FFU) infiziert wurden, und Mäuse injiziert mit PBS dienten als nicht infizierte Kontrollen. Die Morphologie (A) und (B) Gewichtsveränderungen von infizierten Ifnar1^{- / -} Mäusen wurden überwacht. Die roten Pfeile zeigen Ifnar1^{- / -} Mäusen nach der Infektion mit Myeloparalysis und motor Paraparese vorgestellt. (C) Gehirne bei 7D nach Inokulation und (D) Hoden bei 0, 7, 14 und 30 Tage nach Impfung wurden geerntet. Repräsentative Bilder des Gehirns und der Hoden von den Mäusen sind mit einem Lineal angezeigt, um die Größen anzugeben. Die Fehlerbalken repräsentieren den Mittelwert ± SEM n = 10 Mäuse pro Gruppe pro Versuch. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Erkennung von ZIKV und Lymphozyten in das Gehirn und Hoden von ZIKV infiziert Ifnar1^{- / -} Mäusen. (A) dieses Panel zeigt histopathologische Veränderungen im Gehirn und Hoden von ZIKV-infizierten Mäusen im Vergleich zu negativen Kontrollen bei 7D nach Impfung. Maßstabsleiste = 25 µm (links) und 50 µm (Rechte Abbildung). (B) eine Immunfluoreszenz-Assay wurde mit dem Anti-ZIKV Z6 Antikörper (grün) durchgeführt. Alle Gewebeproben wurden aus ZIKV-infizierten Mäusen bei 7D nach Inokulation gesammelt. Die Kerne wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Maßstabsleiste = 50 µm. (C) Immunohistochemistry zeigt eine robuste Infiltration von CD3⁺ T-Zellen in das Gehirn und Hoden. Maßstabsleiste = 25 µm (links) und 50 µm (Rechte Abbildung). Violett zeigt Hämatoxylin, braun stellt den CD3-Antikörper. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Vorbereitung des ZIKV-spezifischen pMHC-ich Tetramers. (A) die Bindung von E_294-302 , H-2D^b ist durch eine in-vitro- umfaltung aufgeklärt. Blau zeigt das H-2D-^b-E_294-302 -Protein. Orange steht für die negativ-Kontrolle ohne Peptid. (B) dieses Panel zeigt die H-2D-^b-E_294-302 Verschiebung Assay. (C) das Mock stellt eine PBS-Steuerelement dar. Drei Streptavidin-Fluoreszenz (APC, PE, und BV421) - markierten pMHC - ich Tetramers wurden verwendet, um ZIKV-spezifischen T-Zellen zu erkennen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4 : Flow durchflusszytometrischen Analyse des Virus-spezifischen CD8 ⁺ T-Zellen in der Milz von Mäusen, ZIKV infiziert und Impfstoff immunisiert. Ifnar1^{- / -} Mäusen im Alter von 6-8 Wochen wurden entweder mit 10⁴ Schwerpunkt-bildenden Einheiten (FFU) der ZIKV infiziert oder erhielt eine Einzeldosis von 4 x 10¹⁰ Viruspartikel AdC7-M/E oder PBS als Negativkontrolle. Nach 7 Tage nach der Infektion oder 4 Wochen nach der Impfung wurden Maus splenocyten geerntet und von Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten sind als Mittelwert ± SD statistische Analyse mit Hilfe einfache ANOVA durchgeführt wurde gezeigt (nicht signifikant: P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001; ***P < 0,0001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Abbildung 5 : Strategie und Vertreter Ergebnisse der Virus-spezifischen CD8 gating⁺ T Zellen im Gehirn und Hoden von ZIKV-infizierten Mäusen. Repräsentative Grundstücke sind für die infiltrierten Lymphozyten in (A) das Gehirn und (B) der Hoden gezeigt. Eine Reihe von Toren wird voraussichtlich lymphatischen-Streuung⁺ und CD3 wählen⁺ Veranstaltungen. Von diesen CD8⁺ Veranstaltungen werden für die Analyse von Epitop-spezifischen T-Zellen angespritzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. 

Diskussion

Immunogen T-Zell-Epitop spielt eine bedeutende Rolle in der zellulären Immunität gegen Krankheitserreger²³. So ist der Nachweis von ZIKV-spezifischen T-Zellen in den Organen der Immunabwehr eine wichtige Methodik, T-Zell-Reaktionen gegen die natürliche ZIKV-Infektion zu verstehen. T-Zell-Antwort-Erkennung ist inzwischen ein hervorragendes Werkzeug, um die Wirksamkeit der viralen Impfstoff zu untersuchen. Hier zeigen wir ein umfassendes Protokoll, die Experimente zu visualisieren, darunter die Isolation der Lymphozyten aus Milz, Gehirn und Hoden ZIKV-infizierte Mäuse, die Vorbereitung der immundominante Epitop E_294-302 Tetramer, und die Anerkennung des ZIKV-spezifischen CD8⁺ T-Zellen in Organen der Immunabwehr des ZIKV-infizierten Mäusen.

Eine frühere Studie ergab, dass ein live ZIKV oder seine RNA in der Samenflüssigkeit männlicher Patienten erkannt werden kann gibt an, dass der ZIKV kann die Blut-Hoden-Schranke zu umgehen und selbst in der reproduktiven System²⁴zu replizieren. Bisher haben wir gezeigt, dass die ZIKV Hoden schädigen und zu männlichen Unfruchtbarkeit bei Mäusen²⁵führen kann. ZIKV Infektion kann zu Virämie bei Rhesus-Affen führen, und die virale RNA kann in das zentrale Nervensystem (ZNS) sowie in der viszeralen Organe erkannt werden. Immunohistochemistry ergab, dass ZIKV-spezifische Antigene im ZNS und mehreren peripheren Organe²⁶vorgelegt wurden. Auch in murinen Modellen ZIKV Infektion kann eine robuste antivirale CD8 induzieren⁺ T-Zell-Antwort in der Milz und CNS-²⁶.

Im Vergleich zu früheren Arbeiten, diese Studie stellt systematische Methoden zur ZIKV-spezifische CD8 erkennen⁺ T-Zell Reaktionen im Gehirn und Hoden, die Immunabwehr sind. Es ist wichtig, die Funktionalität des Virus-spezifischen T-Zellen in den Organen der Immunabwehr der ZIKV-infizierte Mäuse zu bewerten. Die Nutzung des Tetramers ZIKV-spezifische CD8 erkennen⁺ T-Zell Reaktionen in Immunabwehr Organe würde unser Verständnis von ZIKV Infektionen und ihre Host-Immunantwort erheblich verbessern. Mit E-_294-302 -Tetramer, können Virus-spezifischen T-Zellen im Gehirn und Hoden durch Durchflusszytometrie, isoliert werden, um die zellulären Mechanismen zum Schutz und zur immunpathogenese während einer ZIKV Infektion zu untersuchen. Inzwischen ist es hilfreich für Forscher, die Funktionen der CD8 weiter zu untersuchen⁺ T-Zellen, die ZIKV zu kontrollieren oder um die immunpathogenese in diesen Organen während der ZIKV Infektion zu verbessern.

Die Antigen-spezifische murinen CD8 analysieren⁺ T-Zell Reaktionen in den Organen der Immunabwehr, wir H-2D^b-E_294-302 Tetramer vorbereitet und entdeckt die CD8⁺ T-Zellen durch Durchflusszytometrie. Tetramers sind ein mächtiges Werkzeug um antigenspezifischen T-Zellen zu erkennen. Hier wurden drei Arten von Fluorochrom konjugiert Streptavidin (APC, PE, und BV421) erzeugt. Zwar gibt es keine statistisch signifikanten Unterschiede in der APC - BV421- und PE-Label Tetramers zur Erkennung von antigenspezifischen T-Zellen, PE-mit der Bezeichnung pMHC-ich Tetramers ergab die besten Ergebnisse. Daher wurde die PE-Label Tetramer in dieser Studie verwendet. Interessanterweise erkannt basierend auf PE-mit der Bezeichnung H-2D^b-E_294-302 Tetramer, wir hohe Verhältnisse von antigenspezifischen T-Zellen im Gehirn und Hoden, die die Migration Fähigkeit der Virus-spezifischen T-Zellen aus dem Blut zu zeigen Organe der Immunabwehr.

Es gibt jedoch einige Einschränkungen des Protokolls. Die H-2D^b-E_294-302 Tetramer eignet sich nicht für menschliche T-Zell-Erkennung, da Tetramer Erkennung MHC Beschränkung abhängig ist. Das Screening von immundominante HLA eingeschränkt Peptide wird noch benötigt. Außerdem, Retro-Orbital-Infektion gilt für eine ZIKV-Infektion kann jedoch keine komfortable Bedienung für einige Forscher. Daher sind auch andere Wege der Infektion, einschließlich peritoneal, subkutane oder intravenöse, empfohlen.

In dem hier beschriebenen Protokoll ist ein entscheidender Schritt der Isolation von Monozyten aus Hirn und Hoden. Es ist wichtig, qualitativ hochwertige Lymphozyten zu erwerben; Daher ist es wichtig, auf, zum Beispiel die zentrifugale Geschwindigkeit, die Stärke der Schleifen Gewebe und die Zerlegung des Gehirn und Hoden Gewebes zu achten. Außerdem sind Protease-Inhibitoren (PMSF, Pepstatin, Leupeptin) Tetramer Vorbereitung hilfreich, wenn ein Protein schützt vor abgebaut. Daher ist es sinnvoll die refolding Puffer eine Protease-Inhibitor hinzufügen und Austauschen des Puffers während des Prozesses der Tetramer Vorbereitung.

Abschließend präsentieren wir die Methoden der Antigen-spezifischen T-Zell-Reaktionen in der Immunabwehr Organe des Ifnar1^{- / -} Maus-Modell für eine ZIKV-Infektion zu erkennen. Diese Plattform kann weit angewendet werden, um zu untersuchen, die Abwehrmechanismen der Schwellen- und neu auftauchende Viren, die die Barrieren zwischen dem Blut und die Organe der Immunabwehr umgehen können. Darüber hinaus kann dieser Studie ebnen den Weg für die zukünftige Entwicklung der Kandidat Impfstoffe und Immuntherapien.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Z6	unser Labor		Ma W, Li S, Ma S, et al. Das Zika-Virus verursacht Hodenschäden und führt bei Mäusen zu männlicher Unfruchtbarkeit. Zelle, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3	Santa Cruz	sc-1127; RRID: AB_631128
Fluorescein-konjuiertes affinireines Ziegen-Anti-Human-IgG(H+L)	ZSGB-BIO	ZF-0308
Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG, FITC-konjugiertes	CWBIO	CW0115
FITC-Anti-Maus-CD3	Biolegend	17A2
APC Anti-Maus-CD3	Biolegend	100236
PerCP Anti-Maus-CD8a	Biolegend	100732
Percoll	GE Healthcare	P8370
PMSF	Ameresco	0754-5G	Giftiges und ätzendes Reagenz. Mit Vorsicht behandeln
Streptadivin	BD	S4762-FZ	Ergibt eine klare Lösung bei 10 mg/ml in PBS und  gelagert bei -20 μg; C
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG	5 mg in 2,5 mL DMSO, Aliquots gelagert bei -20 º C
Leupeptin	Sigma	L8511	5 mg in 2,5 mL dH2O, Aliquots gelagert bei - 20 º C
Peptide	Scilight-Peptid		Muss in DMSO resuspendiert und bei -20 ° gelagert werden; C
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	Muss bei 4 Grad gelagert werden; C
DMSO	MP		Bei Raumtemperatur lagern.
APC-Streptadivin	BD	554067	Muss bei 4 &°C gelagert und aufbewahrt werden. Nicht einfrieren.
FITC-Streptadivin	BD	554060	Muss gelagert und gewartet werden bei 4 &°C. Nicht einfrieren.
PE-Streptadivin	BD	554061	Muss gelagert und aufbewahrt werden bei 4 &Grad;C. Nicht einfrieren.
BV421-Streptadivin	BD	563259	Muss gelagert und gepflegt werden bei 4 &°C. Nicht einfrieren.
PageRuler Ungefärbte Proteinleiter	Thermo Fisher Scientific	26614	Muss bei 4° gelagert werden;
C-Zell-Siebe	BF	BF10-5040	Bei Raumtemperatur lagern.
Amicon Ultra 100 kDa	Millipore	UFC510024	Bei Raumtemperatur lagern.
Ultrazentrifuge	Thermo Fisher Scientific
Das FACS Cantol			Durchflusszytometer muss Laser und Filter enthalten, die mit der verwendeten Färbeplatte kompatibel sind.
Superdex 200 Erhöhung 10/300 GL	GE healthcare	28990944
AKTA PURE	GE Healthcare
Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen	Solarbio	R1010	Bei 4 & Grad C lagern.