Luminophor Bildung in verschiedenen Konformationen von Rinderserumalbumin durch Bindung von Gold(III)

Summary

Die Protokolle für das Studium der Bindung von gold-Kationen (Au(III)) zu verschiedenen Konformationen der Rinderserumalbumin (BSA) wie auch für die Charakterisierung der Konformationsänderungen abhängigen einzigartige BSA-Au Fluoreszenz dargestellt werden.

Abstract

Die vorgestellten Protokolle soll den Prozess der Au(III) Bindung an die BSA, nachgiebig Konformation bedingte rote Fluoreszenz (λ_Em = 640 nm) der BSA-Au(III)-komplexe. Die Methode stellt den pH-Wert zu zeigen, dass die Entstehung der rote Fluoreszenz mit der pH-induzierte Gleichgewicht Übergänge von der BSA Konformationen korreliert ist. Rot fluoreszierende BSA-Au(III)-komplexe können nur mit einer Einstellung des pH-Wertes bei oder über 9,7, das entspricht der "A-Form" Konformation der BSA gebildet werden. Das Protokoll die BSA, Au Molverhältnis anpassen und den zeitlichen Verlauf des Prozesses der Au(III) Bindung zu überwachen ist beschrieben. Die minimale Anzahl von Au(III) pro BSA, der rote Fluoreszenz zu produzieren ist weniger als sieben. Wir beschreiben das Protokoll in Schritten, um das Vorhandensein von mehreren Au(III)-Bindungsstellen im BSA zu veranschaulichen. Erstens, durch Zugabe von Kupfer (Cu(II)) oder Nickel (Ni(II)) kationen gefolgt von Au(III), zeigt diese Methode eine Bindungsstelle für Au(III), die nicht das rote Fluorophor. Zweitens wird durch BSA von Thiol Deckelung Agenten ändern, ein anderes Nonfluorophore bilden Au(III) Bindungsstelle aufgedeckt. Drittens sind ändern die BSA-Konformation durch Spaltung und Begrenzung der Disulfid-Bindungen, die mögliche Au(III) Bindung Webseite(n) illustriert. Das Protokoll beschrieben, zur Steuerung der BSA Konformationen und Au(III) Bindung, kann in der Regel angewendet werden, um die Wechselwirkungen von anderen Proteinen und Metallkationen zu studieren.

Introduction

Eine BSA-Au-Verbindung Ausstellen einer Ultraviolett (UV)-leicht erregbaren rote Fluoreszenz, mit bemerkenswerten schürt Verschiebung, wurde ursprünglich von Xie Et al.synthetisiert worden. ¹. einzigartige und stabile rote Fluoreszenz finden Sie verschiedene Anwendungen in den Bereichen Fernerkundung,^2,3,4, bildgebenden^5,6,7oder Nanomedizin^{8 ,9,10,}

Protocol

(1) Synthese von BSA-Au(III) Komplex

1. 25 mg der BSA in 1 mL Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Grade Wasser in einer 5 mL Reaktion Phiole zu lösen.
   Hinweis: Die Lösung sollte klar angezeigt werden.
2. Gold (III) chlorid Trihydrate (chlorogoldsäure) zu einer Konzentration von 5 mM in HPLC Grade Wasser auflösen.
   Hinweis: Die Lösung sollte gelb angezeigt. Chloroauric Säure Lösung vorbereitet bei dieser Konzentration führt zu einem BSA in Au Verhältnis von 01:13.
   1. Alternativ bereiten Sie eine Lösung von chlorogoldsäure mit einer Konzentration von überall zwischen 0,38 mM (BSA:Au = 1:1) bis 20 mM (BSA:Au = 01:50) in HPLC Grad Wass....

Results

Aus der Fluoreszenz des BSA-Au(III) komplexes, es wurde beobachtet, dass die Umwandlung der inneren blauen Fluoreszenz der BSA (λ_Em = 400 nm), rote Fluoreszenz (λ_Em = 640 nm) tritt bei etwa pH 9,7 durch ein Gleichgewicht Übergang (Abbildung 1). EEM BSA-Au(III) bei verschiedenen BSA Au molare Verhältnis ist in Abbildung 2dargestellt, und diese Daten zeigt, wie die gleichen Emissionswellenlän.......

Discussion

Die BSA-Au(III) Verbindungen vorbereitet bei pH 12 weisen rote Fluoreszenz bei einer Emissionswellenlänge λ_Em= 640 nm bei Erregung mit ultravioletten (UV) Licht λ_ex= 365 nm (Abbildung 1A). Die Entstehung der rote Fluoreszenz ist ein langsamer Prozess und dauert ein paar Tage bei Raumtemperatur bis zu einer maximalen Intensität zu erhöhen. Läuft die Reaktion bei 37 ° C wird die optimale Ergebnisse liefern, obwohl höherer Temperatur verwendet werden kann, um die .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rinderserumalbumin (BSA), 96 %	Sigma-Aldrich	A5611
Gold (III)-chlorid-Trihydrat, 99,9 %	Sigma-Aldrich	520918
Kupfer (II)-chlorid-Dihydrat, 99,999 %	Sigma-Aldrich	459097
Nickel (II)-chlorid-Hexahydrat, 99,9 %	Sigma-Aldrich	654507
N-Ethylmaleimid (NEM), >99,0 %	Sigma-Aldrich	4259
Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP), >98,0 %	Sigma-Aldrich	C4706
Natriumhydroxid, >98,0 %	Sigma-Aldrich	S8045
Harnstoff, 99,5 %	Chem-Implex Int'l	30142
Phospat gepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Corning	MT21040CV
Ammoniumbicarbonat, 99.5%	Sigma-Aldrich	9830