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Quantifizierung der Efferocytosis durch einzellige Fluoreszenz-Mikroskopie

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DOI:

10.3791/58149

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18. August 2018

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1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Efferocytosis, die phagocytic Entfernung der Apoptotic Zellen ist erforderlich, um die Homöostase und wird erleichtert durch die Rezeptoren und Signalwege, die für die Anerkennung, Engulfment und Internalisierung der Apoptotic Zellen ermöglichen. Hier präsentieren wir ein Fluoreszenz-Mikroskopie-Protokoll für die Quantifizierung des Efferocytosis und die Aktivität der Efferocytic Signalwege.

Zusammenfassung

Studieren die Regulierung des Efferocytosis erfordert Methoden in der Lage sind, die Aufnahme von apoptotischen Zellen genau zu quantifizieren und die Signalisierung und zelluläre Prozesse zu untersuchen, die Efferocytosis zu steuern. Diese Quantifizierung kann schwierig sein, wie Apoptotic Zellen oft bruchstückhaft, Efferocytosed sind durchführen, so erfordern Methoden, die genau zwischen dem Efferocytosed Teil eines Ziels Apoptotic versus passives unengulfed Mobilfunk abgrenzen können Fragmente. Die hier beschriebenen Ansatz nutzt Dual-Kennzeichnung Ansätze, um die Dynamik des Efferocytosis und Efferocytic der Efferocytes wie z. B. Makrophagen genau zu quantifizieren. Das Zytosol der apoptotischen Zelle ist mit einem Handy-Tracking-Farbstoff zu ermöglichen eine Überwachung aller apoptotische Zelle abgeleitet Materialien, während Oberfläche biotinylierungen der apoptotischen Zelle ermöglicht eine Differenzierung zwischen verinnerlichten und nicht verinnerlicht beschriftet apoptotische Zelle Brüche. Die Efferocytic-Kapazität des Efferocytes richtet sich nach fluoreszierende Bilder live oder festen Zellen und die Menge des gebundenen versus internalisierten Ziele zu quantifizieren, wie durch Streptavidin Färbung unterschieden. Dieser Ansatz hat mehrere Vorteile gegenüber Methoden wie Durchflusszytometrie, nämlich die genaue Abgrenzung von nicht-Efferocytosed versus Efferocytosed Apoptotic Zelle Brüche, die Fähigkeit, Efferocytic Dynamik durch live-Cell-Mikroskopie, Messen und die Kapazität, Untersuchungen der zellulären Signalisierung in Zellen, die mit dem Ausdruck eindringmittel beschriftet Transgene durchzuführen. Kombiniert, dienen die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden als Grundlage für eine flexible experimentellen Ansatz, der verwendet werden kann, um Efferocytic Tätigkeit genau zu quantifizieren und zelluläre Signalwege während der Efferocytosis aktiv zu verhören.

Einleitung

Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein stark regulierten physiologischen Prozess, der tritt in den meisten vielzelligen Organismen und ist entscheidend für ihre Entwicklung und Homöostase1. Neben der normalen Zellerneuerung und embryonale Entwicklung beteiligt, Apoptose ermöglicht die Beseitigung der infizierten oder beschädigten Zellen aus den Geweben und in Reaktion auf die Infektion, Entzündung, Krebs, und auch durch medizinische Eingriffe ausgelöst werden kann z. B. Strahlentherapie oder Steroide1. Apoptotische Zellen aussetzen "Essen-mich" Signale auf ihrer Zelloberfläche die von Rezeptoren auf eine Reihe von professionellen und nichtprofessionellen Phagozyten erkannt werden zusammenfassend als "Efferocytes" bezeichnet. Engagement dieser Rezeptoren induziert die Aufnahme und den Abbau der apoptotischen Zelle durch die Efferocyte durch einen Prozeß bekannt als Efferocytosis2,3. Phosphatidylserin ist die beste charakterisierten essen-mir signalisieren treibende Efferocytosis. Es normalerweise beschränkt sich auf die innere Broschüre der Plasmamembran, mit Apoptose ein Lipid-Scramblase das stört diese Membran-Asymmetrie, damit aussetzen Phosphatidylserin auf der Zelle Oberfläche4aktivieren. Phosphatidylserin ist auf der extrazellulären Oberfläche von einigen nicht-apoptotische Zellen wie Reifen Makrophagen gefunden und Thrombozyten aktiviert. Diese Zellen sind jedoch nicht Efferocytosed aufgrund des Vorhandenseins von "ISS mich nicht" Signale, wie z. B. CD47, auf ihrer Zelle Oberfläche5,6,7. Exponierten Phosphatidylserin wird durch eine Reihe von Efferocytic Rezeptoren geäußerten Efferocytes erkannt. Bindung dieser Rezeptoren, Phosphatidylserin, aktiviert entweder direkt oder durch die Hilfe von Opsonins, Signalwege, die die Verwicklung der apoptotischen Zelle in eine Membrane-springen Vakuole bezeichnet die Efferosome8, zu fördern 9 , 10 , 11 , 12. das Efferosome Sicherungen sequenziell mit Endosomen und Lysosomen, die liefern die molekularen Maschinen notwendig, die Efferosome Ansäuern und verschlechtern die Apoptotic Zelle Ladung13,14. Einmal abgebaut, die Apoptotic Zelle abgeleitet Materialien sind Opfer von Menschenhandel zu recycling Endosom – ein Prozess, welche Grenzen Immunantworten auf apoptotische Zelle abgeleitet Antigene, und die können für die Verwertung von Nährstoffen aus der apoptotischen Zelle13, 15. Ein Fehler im Efferocytosis führt zu eingeschränkter Clearance von apoptotischen Zellen; diese ungeklärten Zellen durchlaufen schließlich sekundären Nekrose. Nekrotische Zellen release Pro-inflammatorischen cytosolischen Inhalt, Krankheitserreger und Autoantigene in das extrazelluläre Milieu, somit eine Reichweite von infektiösen, Entzündungs-und Autoimmunkrankheiten16,17. Zusammen, Apoptose und Efferocytosis erleichtern die Entfernung der sterbende und tote Zellen und für die Aufrechterhaltung der Homöostase Gewebe erlauben.

Untersuchung der molekularen Mechanismen, die Efferocytosis erfordert Methoden, die eine klare Quantifizierung der apoptotischen Zelle Aufnahme bereitstellen. Diese Quantifizierung wird durch die Tatsache erschwert, dass im Gegensatz zu anderen Aufnahme Mechanismen wie z. B. Endozytose und Phagozytose18,19, Efferocytosis nicht die Verwicklung von intakten Zielzelle, wodurch die schrittweise Aufnahme führen kann der apoptotischen Zelle durch die Efferocyte20. Die hierin beschriebene Protokoll beschreibt einen in-vitro- Efferocytosis Assay, die genaue Abgrenzung von den verinnerlichten bietet im Vergleich zu nicht verinnerlicht Teile der einzelnen Apoptotic Zellen und kombinierbar mit einer Vielzahl von festen-Zelle und Leben-Zelle Mikroskopie Ansätze. Traditionelle Phagozytose Assays hinzufügen Antikörper spezifisch auf die phagocytic Ziel am Ende des Experiments um Ziele nicht verinnerlicht, wo, wie unsere Methode beschriften unterscheidet sich durch Kennzeichnung der Apoptotic Ziel mit kovalent verknüpft Biotin21 , 22. während apoptotischer Zellen spezifische Antikörper in diesem Assay verwendet werden können, der biotinylierungen Ansatz ermöglicht für jedes Protein-Lager Ziel gekennzeichnet werden und vermeidet mögliche Probleme mit sekundären Antikörper Kreuzreaktivität Immunostaining erfolgt . Im einzelnen erläutern wir die Vorbereitung des apoptotischen Jurkat-Zellen, die mit einer Zelle Tracking Farbstoff und Biotin Dual befleckt gewesen. Die Zelle tracking Farbstoff ermöglicht apoptotische Zelle abgeleitet Materialien, während Efferocytosis verfolgt, während Oberfläche biotinylierungen ermöglicht die Unterscheidung von aus nicht verinnerlicht Teilen des Efferocytosed Apoptotic Zellen verinnerlicht. Wir beschreiben auch die Kultur und die Vorbereitung von J774.2 und THP-1-Zell-Linien für den Einsatz als murinen und menschlichen Efferocytes, M2-Makrophagen Monocyte abgeleitet als Beispiel der Primärzelle Efferocytosis und Jurkat-Zellen für den Einsatz als Efferocytic Ziele. Diese Methoden können leicht auch auf andere Zelllinien oder Primärzellen, Zielzellen durchläuft jede Form des Zelltods (z. B. Apoptose, Nekrose und Necroptosis) und Mikron mittelständische imitiert die Apoptotic Zellen durch Lipid-Beschichtungen zu simulieren oder Beschichtung mit Liganden spezifisch für eine Efferocytic-Rezeptor von Interesse.

In diesem Protokoll beschriebenen Methode hat mehrere Vorteile gegenüber der Flow Cytometry basierend üblichen Methoden im Feld23,24. Durch bildgebende direkt die Phagozyten-apoptotische Zelle Interaktion, kombiniert mit klaren Kennzeichnung von beiden insgesamt und nicht verinnerlicht Apoptotic Zellmaterial können quantitative Maßnahmen des Efferocytosis vorgenommen werden. Darüber hinaus schränkt die Verwendung von pH-unempfindliche Fluorophore Störfaktoren wie die Unterdrückung der FITC und GFP Fluoreszenz bei lysosomalen pH, die einige alternative Methoden25verwirrt. Schließlich, während nicht im Detail beschrieben, diese Methoden eingesetzt werden mit Efferocytes mit dem Ausdruck eindringmittel beschriftet transgene oder mit Post-Fixierung Immunostaining, Quantifizierung der Signalisierung Molekül Aktivität und Überwachung ermöglicht die zelluläre Prozesse während der Efferocytosis.

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Protokoll

Ansammlung von Blut von gesunden Probanden nahm Health Science Research Ethics Board von der University of Western Ontario. Venenpunktion wurde gemäß den Richtlinien der Tri-Rat Grundsatzerklärung zur Forschung am Menschen durchgeführt.

1. Kultur und Vorbereitung der Zelllinie THP-1 Monocyte

  1. Kultur THP-1 Monozyten als einer SUSPENSIONSKULTUR in T25 Fläschchen bei 37 ° C + 5 % CO2. Zellen sollten in Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10 % 5 mL fetalen Bovine Serum (FBS) angebaut werden.
  2. Jeden Tag anhalten Zellen gleichmäßig über die Wachstumsmedien durch sanft schütteln die Flasche dann zählen sofort Zellen mit einem Hemocytometer. Zellen sollten passagiert werden, sobald Zelldichte 1 x 106 Zellen/mL erreicht:
    1. Vorwärmen RPMI 1640 + 10 % FBS in einem 37 ° C-Wasserbad.
    2. 2 x 105 Zellen in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch oder ein 15 mL konische Rohr, und Pellet durch Zentrifugieren bei 500 X g bei Raumtemperatur für 5 min zu übertragen.
    3. Entfernen Sie den überstand zu, ohne die Zelle Pellet zu stören und Aufschwemmen Sie das Pellet in 1 mL (1,5 mL Microcentrifuge Schlauch) oder 5 mL (15 mL konische Rohr) von Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
    4. Zentrifuge das Rohr auf 500 X g bei Raumtemperatur für 5 min. Entfernen der PBS ohne zu stören die Zelle Pellet.
    5. Aufschwemmen Pellet in 1 mL frisches RPMI 1640 + 10 % FBS.
    6. In einen neuen T25 Kolben Platz 4 mL erwärmten Medien, und dazu die resuspendierte Zellen hinzufügen von 1.2.5. Kultur in einem 37 ° C + 5 % CO2 Inkubator, bis die Zellen benötigen passagierung (in der Regel 3 Tage) oder Zellen für ein Experiment benötigt werden.
  3. Entfernen Sie für ein Experiment mit THP-1-derived Makrophagen die erforderliche Anzahl von Zellen aus der Kanne und Teller vor passagierung:
    1. Legen Sie die erforderliche Anzahl von 18 mm Runde Glasdeckgläser (#1.5 Dicke) in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte – in der Regel 1 Deckglas pro Zustand und/oder Timepoint. In jedem gut aliquoten 5 x 104 THP-1 Monozyten. Die Anzahl der Zellen hinzugefügt zu jedem Bohrloch verändert werden kann, falls erforderlich.
    2. Bringen Sie das Gesamtvolumen der einzelnen Zelle-haltigen gut zu 1 mL mit RPMI + 10 % FBS auf 37 ° c erwärmt
    3. Geben Sie 100 nM Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) in jeder Kunst und Kultur für 3 Tage, Differenzierung der THP-1 Monozyten zu Makrophagen-wie Zellen induzieren.

(2) Kultur und Vorbereitung der J774.2 Makrophagen-Zelllinie

  1. Kultur J774.2 Zellen in T25 Fläschchen bei 37 ° C + 5 % CO2. Zellen sollten in 5 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) + 10 % gewachsen FBS und passagiert sobald die Kultur 80-90 % Konfluenz erreicht. Durchgang-Zellen:
    1. Entfernen Sie alle Medien aus der Flasche und einmal mit 5 mL PBS.
    2. PBS aus der Flasche zu entfernen und ersetzen Sie mit 5 mL frischem DMEM + 10 % FBS.
    3. Mit einem Zelle Schaber, kratzen Sie die Unterseite des Kolbens, die Zellen in den Medien auszusetzen. Kräftig die Zellen pipette mehrmals Zelle Aggregate aufzubrechen.
    4. Verdünnen Sie Zellen 1:5, 4 mL Zellsuspension aus der Flasche entfernen und ersetzen es mit 4 mL frische Medien. Die restlichen Zellsuspension kann verworfen, verwendet, um eine neue Zellkultur in einem frischen T25 Kolben zu starten oder für ein Experiment verwendet.
  2. Für einen Efferocytosis-Test unter Verwendung von J774.2 Zellen eingerichtet:
    1. Suspendieren Sie einen Tag vor Beginn des Experiments, J774.2 Zellen in 5 mL frische Medien gemäß Schritte 2.1.1–2.1.3. Zählen von Zellen mit einem Hemocytometer und bereiten Sie das benötigte Volumen von Zellen in einer Konzentration von 5 x 104 Zellen/mL.
    2. Legen Sie die erforderliche Anzahl von 18 mm Runde Glasdeckgläser (#1.5 Dicke) in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte. In jedem gut aliquoten 1 mL 5 x 104 Zellen/mL Zellsuspension.
    3. Kultur über Nacht in die Zellen zur Einhaltung der Deckglas und erholen sich von passagierung ermöglichen.

3. Kultur der primären menschlichen M2-Makrophagen

  1. Sammeln Sie 10 mL heparinisierten Menschenblut für jeden 12-Well-Platte von M2-Makrophagen erforderlich.
  2. In einem 15 mL Zentrifugenröhrchen Schicht 5 mL des menschlichen Blutes auf 5 mL vorgewärmten Lympholyte-Poly Zelle Trennmedium. Bereiten Sie mehrere Röhren, wenn Verarbeitung > 5 mL Blut, anstatt größere Volumen Rohre zu verwenden.
  3. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 35 min, mit mittlerer Beschleunigung und keine Pause.
  4. Entfernen Sie vorsichtig die obere mononukleären Zellen reiche Band mit einem Kunststoff-Pipette und Transfer in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Wenn mehrere Röhren in Schritt 3.2 erstellt wurden, können die Bänder in einem einzigen 50 mL-Tube gebündelt. Volumen des Schlauches zu bringen bis zu 50 mL mit PBS.
  5. 300 X g für 8 min zentrifugieren und den überstand zu entfernen. Legen Sie bei diesem Schritt autoklaviert 18 mm Durchmesser kreisförmige Deckgläsern (#1.5 Dicke) in jede Vertiefung eine 12-Well-Platte.
  6. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 300 µL serumfreien RPMI 1640 pro gewünschten Anzahl von Brunnen; z. B. wenn 10 mL Blut verarbeitet wurde, um eine vollständige 12-well-Platte vorzubereiten auszusetzen Zelle Pellet in 3,6 mL Medien.
  7. Fügen Sie hinzu, dass 300 µL Zellsuspension Deckglas-jeweils auch in der 12-Well-Platte. Inkubation für 1 h bei 37 ° C + 5 % CO2.
  8. Vorsichtig waschen Deckglas 3 X mit 1 mL erwärmten PBS, nicht-anhaftende Zellen zu entfernen.
  9. Fügen Sie 1 mL RPMI 1640 + 10 % FBS + 10 ng/mL rekombinanten menschlichen M-CSF + Zelle Kultur Antibiotikum/antimykotikums. 5 Tage bei 37 ° C + 5 % CO2 inkubieren.
  10. Ersetzen Sie Medien mit RPMI 1640 + 10 % FBS + 10 ng/mL rekombinanten menschlichen M-CSF + 10 ng/mL rekombinanten menschlichen IL-4 + Zelle Kultur Antibiotikum/antimykotikums. Inkubation bei 37 ° C + 5 % CO2 für 2 Tage M2 Polarisation.
  11. Polarisierte Makrophagen sollte innerhalb der nächsten 3 Tage verwendet werden.

4. Vorbereitung der Apoptotic Jurkat-Zellen

  1. Kultur Jurkat Zellen in 5 mL RPMI 1640 + 10 % FBS bei 37 ° C + 5 % CO2. Jurkats sind eine Aussetzung-Zell-Linie und durch passagierung 1:5 in frischen, vorgewärmten Medien alle 3 – 5 Tage beibehalten werden kann.
  2. Zur Vorbereitung der Apoptotic Zellen ermöglichen Sie Jurkat-Kultur zu hoher Dichte (4 – 5 Tage nach passagierung) wachsen. Aliquoten 1,5 mL in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min.
  3. Überstand verwerfen und neu Zelle Pellet in 1 mL serumfreien RPMI 1640-haltigem Medium 1 µM Staurosporine auszusetzen.
  4. Inkubieren Sie 16 h bei 37 ° C + 5 % CO2 Apoptotic Zellen zu rendern.
  5. Falls gewünscht, bestätigen Sie Induktion der Apoptose durch Färbung mit Annexin V:
    1. Aliquoten 100 µL der Staurosporine behandelt Jurkat Zellkultur zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min, überstand verwerfen und neu Zelle Pellet in 100 µL serumfreien RPMI 1640 Medium aussetzen.
    2. Fügen Sie 1 µL Fluorescein erfolgt (FITC)-konjugiert Annexin V und 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.
    3. Fügen Sie 900 µL PBS und übertragen Sie das gesamte Volumen zu einem einzigen Brunnen von einer 12-Well-Platte mit einem 18 mm runden Glas Deckglas (#1.5 Dicke) zu. Spin-down in einer Zentrifuge, ausgestattet mit einem Adapter Platte 200 X g für 1 min, Zellen zu zwingen, das Deckglas einzuhalten. Alternativ können Zellen in einer gekammerten Folie für die Bildgebung platziert werden.
    4. Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop.

(5) Quantifizierung der Efferocytic Aufnahme und Dynamik mit einem festen Zelle Efferocytosis Assay und Inside-Out-Färbung

  1. Bereiten Sie THP-1, J774.2 oder M2 menschliche Makrophagen vor, wie in den Abschnitten 1 bis 3, beschrieben.
  2. Bereiten Sie am Abend vor dem Start des Experiments Apoptotic Jurkat Zellen wie in Abschnitt 4beschrieben.
  3. Unmittelbar vor dem Experiment zählen Sie Apoptotic Zellen unter Verwendung einer Hemocytometer. Ausreichende Zahl von apoptotischen Zellen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen – wir fügen in der Regel 5 x 105 Zellen/Brunnen, ein Ziel: Efferocyte Verhältnis 10:1.
  4. Pellet-Jurkat Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min und in 500 μl PBS aufzuwirbeln.
  5. Während der Zentrifugation aliquoten 10 µL von DMSO zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Eine minimale Menge von N-Hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotin) in die DMSO auflösen. 5-10 Kristalle (~0.005 mg) ist ausreichend.
  6. Übertragen Sie die 500 μL apoptotische Zelle/PBS-Aufhängung auf die DMSO/NHS-Biotin mit Rohr. Verdünnen Sie dann eine tracking-Farbstoff, vom Hersteller empfohlenen Konzentration in der Zellsuspension apoptotische Zelle. Stellen Sie sicher, wählen eine Zelle, die tracking-Farbstoff, der nicht Spektral mit FITC-Streptavidin (z. B. rot oder dunkelrote Zelle tracking-Farbstoff) überlappt.
  7. Inkubieren Sie Aufhängung für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Fügen Sie ein gleiches Volumen von RPMI 1640 + 10 % FBS und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln nicht umgesetztes Farbstoff zu stillen.
  8. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min, überstand verwerfen und erneut aussetzen der gefärbten Apoptotic Zellen in 100 µL RPMI 1640 + 10 % FBS pro Bohrloch von Makrophagen.
  9. Fügen Sie 100 µL Zellsuspension gefärbten Apoptotic tropfenweise in jede Vertiefung von Makrophagen. Zentrifugieren Sie 200 X g für 1 min in einer Zentrifuge mit einer Platte-Adapter ausgestattet, um die Kontaktkraft zwischen Makrophagen und Apoptotic Zellen.
  10. Inkubieren Sie Platte für den gewünschten Zeitraum bei 37 ° C + 5 % CO2 in einer Gewebekultur Inkubator. Für Makrophagen, Efferocytosed Material ist in der Regel zuerst nachweisbar nach 20-30 min und nach 120-180 min abgeschlossen ist.
  11. Zum gewünschten Zeitpunkt entfernen Punkt(e) Zellen aus dem Inkubator. Waschen Sie Zellen zweimal mit 1 mL der Raumtemperatur PBS zu stoppen Efferocytosis und nicht Efferocytosed Apoptotic Zellen zu entfernen.
  12. FITC konjugiert Streptavidin bei einem 1:1,000 Verdünnung in jede Vertiefung hinzufügen und 20 Minuten im Dunkeln inkubieren. Dies wird die exponierten Biotin nicht Efferocytosed Apoptotic Zelle Material beschriften.
    Hinweis: Falls gewünscht, Zellkerne können auch gebeizt während dieses Schrittes durch Zugabe von 1: 20.000 Verdünnung von Hoechst 33342 oder 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI).
  13. Waschen Sie Zellen 3 Mal mit 1 mL PBS, sanft schütteln oder schaukeln die Proben 5 min pro Spülgang. Befestigen Sie Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS für 20 min bei Raumtemperatur. Spülen Sie Zellen einmal mit PBS, überschüssige PFA zu entfernen.
  14. Mount Deckgläsern auf einer Folie für Bildgebung und Transfer zu einem Fluoreszenzmikroskop. Z-Stapel eine ausreichende Anzahl von Zellen für die genaue Quantifizierung zu erfassen – in der Regel 10-30 Zellen pro Zustand. Nicht verinnerlicht Apoptotic Zellmaterial wird als Zelle tracking Farbstoff mit der Bezeichnung Material umhüllt von FITC-Streptavidin Färbung, während Efferocytosed Material diskrete Zelle tracking Dye Puncta frei von jeder Streptavidin bildet in das resultierende Bild ersichtlich sein Färbung.
  15. Efferocytosis in die entstandenen Bilder über eine Vielzahl von Maßnahmen zu quantifizieren:
    1. Berechnen Sie den Efferocytic Index pro Makrophagen durch Bestimmung der durchschnittlichen Anzahl der diskreten Efferosomes (Zelle tracking Dye+/streptavidin– Puncta). Nur die Makrophagen an eine apoptotische Zelle gebunden sind oder diese enthalten ≥1 sichtbaren Efferosomes zu quantifizieren. Rekord Makrophagen gebunden, eine apoptotische Zelle, aber fehlende diskreten Efferosomes, als mit einem Efferocytic-Index von 0.
    2. Berechnen Sie Efferocytic Effizienz durch die Messung der Bruchteil von Makrophagen, die ≥1 Efferosome enthalten.
    3. Berechnen Sie die Rate des Efferocytosis durch bildgebende Zellen fixiert und gefärbt zu mehreren Zeitpunkten. Nur Bild Makrophagen an apoptotischen Zellen gebunden, oder mit sichtbaren Efferosomes mit Z-Stapel der einzelnen Zellen erfasst. Sobald ein Image erstellt, bestimmen Sie die Rate der Efferocytosis:
      1. Verwenden die Streptavidin Färbung, wie eine Anleitung und das Freihand oder Polygon-Auswahl-Werkzeug in Fidschi/ImageJ26 (oder andere Bild-Analyse-Software-Paket), aller der Zelle tracking Dye+/streptavidin– (z.B. verinnerlicht) Kreis Material in einer Ebene im Z-Stapel. Messen Sie der integrierte Intensität der Verfolgung Farbstoff Zelle dieser Region. Einzelmaßnahmen für jede Efferosome (z. B. Durchmesser, Positionierung im Vergleich zu der Zellenrahmen oder Kern usw.)15,27 können leicht gleichzeitig mit diesen Messungen stark erworben werden Erhöhung der Daten während der Analyse gesammelt.
      2. Auf dem gleichen Z-Abschnitt, mit der Färbung als Richtschnur und dem Auswahl-Werkzeug Freihand oder Polygon Streptavidin Kreise alle tracking Dye+/streptavidin+ (z.B. nicht verinnerlicht) Zelle Material in einer Ebene des Stapels Z . Schließen Sie nur die Färbung von apoptotischen Zellen in Kontakt mit der Phagozyten. Messen Sie die integrierte Intensität dieser Region.
      3. Wiederholen Sie die Schritte 4.2.3.1 zu 4.2.3.2 für die restlichen Z-Abschnitte des Bildes. Addieren Sie die integrierte Intensität der Efferocytosed (ΣEff) und nicht-Efferocytosed (ΣNe) Materialien. Der Anteil der apoptotischen Zelle Efferocytosed wurde kann für die Zelle als berechnet werden:
        figure-protocol-1
      4. Die Bruch-Efferocytosed für alle Zellen zu allen Zeitpunkten zu quantifizieren. Beachten Sie, dass die fluoreszente Intensität der Apoptotic Zellen/Efferosomes zwischen den Bildern aufgrund von Schwankungen bei der Aufnahme der Zelle tracking Farbstoffe durch individuelle Apoptotic Zellen und aufgrund von Veränderungen im Bild Aufnahmeparameter wie Belichtungszeit variieren kann. Als solche nur vergleichen normalisierte Werte wie Bruchteil Efferocytosed oder Intensität-unabhängige Werte wie Efferocytic Index und Efferocytic Effizienz, zwischen Bildern, zwischen experimentellen Bedingungen und zwischen wiederholen Experimente.
    4. Um sicherzustellen, dass die daraus resultierende Datensatz entspricht genau die Variation in Efferocytosis zwischen den Zellen, Analysen Sie diese auf die maximale Anzahl der Zellen in jedem Experiment möglich.
      Hinweis: Efferocytic Effizienz und Efferocytic Index schnell errechnet werden (ein paar Sekunden/Zelle) und in der Regel wollen wir mindestens 100 Zellen pro Versuch, analysieren jedes Experiment mindestens 3 Mal wiederholen. Berechnung den Anteil der Efferocytosed Material und Efferosome-spezifische Maßnahmen sind aufwendiger, in der Regel unter 2 – 3 min./Zelle "" für einen erfahrenen Analytiker. Für diese Berechnungen beziffern wir mindestens 15 Zellen pro Zustand, pro Versuch.
    5. Rekord Efferocytic Index, Bruchteil Efferocytosed und individuellen Efferosome Daten auf einer Basis pro Zelle.
      Hinweis: Dies ermöglicht Datenanalyse mit einzelligen Ansätzen, so dass Inter Zelle Variationen quantifiziert werden. Populationsebene Analysen können noch auf diese Datensätze durch Mittelung einzellige Daten in einzelnen Experimente durchgeführt werden. Efferosome-spezifische Messungen analysiert werden können, an die Bevölkerung, einzellige Stufe, sowie Ensembles (z.B. als Populationen von Efferosomes unabhängig von den Zellen, die sie enthalten)15.

6. Leben Sie Zelle Efferocytosis Assay mit Apoptotic Zellen

  1. Bereiten Sie THP-1, J774.2 oder M2-Makrophagen, wie in den Schritten 1-3, beschrieben. Bei Bedarf sollten die Zellen mit Transgene transfiziert werden oder anderen genetischen Konstrukte mindestens 18 Stunden vor der Durchführung keine Experimente.
  2. Bereiten Sie am Abend vor dem Start des Experiments, Apoptotic Jurkat Zellen wie beschrieben in den Abschnitten 4 und 5 mit folgenden Änderungen:
    1. Verdünnen Sie Zellen zu und induzieren Sie Apoptose gemäß 4.1-4.3, und sammeln Sie die erforderliche Anzahl von apoptotischen Zellen gemäß 5.3 – 5,4.
    2. Hinzufügen einer Zelle tracking Farbstoff bei dem Hersteller empfohlenen Konzentration an die Apoptotic Zellsuspension. Inkubieren Sie Aufhängung für 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Fügen Sie ein gleiches Volumen von RPMI 1640 + 10 % FBS und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln nicht umgesetztes Farbstoff zu stillen. Fügen Sie keine NHS-Biotin für diese Experimente.
    3. Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 500 X g für 5 min, überstand verwerfen und erneut aussetzen gefärbten Apoptotic Zellen in 100 µL RPMI 1640 + 10 % FBS pro Bohrloch von Makrophagen.
  3. Bei Bedarf hinzugefügt Label, die Makrophagen Nährmedien aus jedem Bohrloch entfernen und Hinzufügen von 500 µL PBS mit den Herstellern empfohlenen Verdünnung einer Zelle tracking-Farbstoff, der mit der Zelle tracking-Farbstoff nicht Spektral überlappt an der Apoptotic Zellen oder fluoreszierende transgene ausgedrückt durch die Makrophagen. 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren, dann fügen Sie ein gleiches Volumen DMEM + 10 % FBS und inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur im Dunkeln nicht umgesetztes Farbstoff zu stillen.
  4. Übertragen Sie die Makrophagen-haltigen Deckglas zu einer Kammer, Leiden. Fügen Sie 400 µL DMEM + 10 % FBS, gefolgt von 100 µL der beschrifteten Apoptotic Zellsuspension. Mischen Sie, indem Sie sanft pipettieren Medien 2 – 3 Mal.
  5. Übertragen die Leiden-Kammer auf eine beheizte und CO2-PERFUNDIERTEN Kammer eines live Zelle fluoreszierende Mikroskops.
    Hinweis: Für Mikroskop-Setups, die CO2 Perfusion Fähigkeiten fehlen, verwenden Gewebe Nährmedium gepuffert mit 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) anstatt Natriumbicarbonat zu physiologischen pH-Wert während der Kultur ist Luft ausgesetzt.
  6. Ein Time-Lapse-Serie enthält ein weißes Licht (Phasenkontrast oder DIC) Bild und Bilder von allen Fluoreszenzmarkierungen zu erfassen:
    1. Verwenden Sie ein 100 X Objektiv für Experimente, wo feine Details zu lösen ist (z.B. Membran Dynamik der Phagozyten-apoptotische Zelle Interaktionen) erforderlich. Unterdessen mehr allgemeine Maßnahmen (Rate der apoptotischen Zelle Aufnahme, Interaktion abwechselnd in Makrophagen und Apoptotic Zellen, etc.) werden am besten mit einem 60 X oder 63 X Objektiv abgebildet.
    2. Falls vorhanden, verwenden Sie Punkt-Besuch während einer einzigen Akquisition, wodurch sich die Anzahl der Efferocytic Ereignisse erfasst in einem einzigen Experiment mehrere Felder-of-View Image
    3. Da Efferocytes oft kleine Fragmente der Apoptotic Zellen, sondern als intakte Zellen verschlingen, empfiehlt es sich, Z-Stapel zu erfassen. Zur Minimierung von Phototoxizität Z-Profile durch die Fokustiefe Ihre Mikroskope Ziel getrennt zu erfassen (in der Regel 0,5-1,0 µm), durch die Dicke der Zelle (in der Regel 8 bis 10 µm für Makrophagen, z. B. 8 – 20 Scheiben/Zelle). Dies stellt sicher, dass alle Engulfment und Menschenhandel Veranstaltungen in mindestens einer Z-Ebene sichtbar ist. Alternativ verwenden Sie große (1 – 5 µm Durchmesser) apoptotische Zelle Mimik oder Apoptotic Zellen, die minimale Fragmentierung während Efferocytosis zu unterziehen (z. B. Wärme schockiert neutrophile) stattdessen ohne Z-stapeln. Wir haben die Vorbereitung der Mimik und Apoptotic Neutrophils beschrieben bisher28.
    4. Immunofluoreszenz zu minimieren, verwenden Sie helle Fluorophore und Capture Bilder mit Übernahme-Einstellungen, die Immunofluoreszenz minimieren – z. B. geringer Intensität Anregung kombiniert mit hohen Kameraverstärkung und kurze Belichtungszeiten Mal29. Wir empfehlen dringend, unter Verwendung eines Mikroskops, ausgestattet mit einer hochempfindlichen elektromagnetische – Coupled Ladegerät (EM-CCD) Kamera oder Spinning-Disk konfokale und ein High-Speed-piezoelektrische Kreuztisch für diese Form der Bildgebung.
  7. Die Anzahl der möglichen Analysemethoden, die diesen Time-Lapse Videos angewendet werden können, ist umfangreich und über unsere Fähigkeit, hier zu überprüfen. Als einige Beispiele verwenden Sie manuelle oder automatisierte tracking-Software verfolgen die Fusion, Spaltung und Bewegung des Efferosomes innerhalb von Zellen15, Efferosome Fusion Dynamik mit Endolysosomes durch ns1 Analyse in Makrophagen, die mit dem Ausdruck zu quantifizieren Fach-spezifischen fluoreszierenden transgene13, Monitor Aufnahme Prozesse wie Sondierung und WM Formation30, bestimmen die Rekrutierung Dynamik der Signal- und Proteine, die Efferosome13, Menschenhandel und/oder quantifizieren Sie die abbauende Aktivität des Efferosomes mit Apoptotic Zellen mit pH-Sensitive, Oxidationsmittel-Sensitive oder Protease-aktivierten Fluorophore31beschriftet.

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Ergebnisse

Über Nacht Kultur Jurkat Zellen mit 1 µM Staurosporine Ergebnisse bei der Apoptose von > 95 % der Zellen, die mit Annexin V Färbung (Abbildung 1) bestätigt werden kann. Andere Zelltypen können für diese Experimente verwendet werden, obwohl die Konzentration der Staurosporine und die Dauer der Staurosporine Behandlung für jede Zelllinie optimiert werden müssen. Für die zuverlässige Erkennung und Quantifizierung von Efferocytosis > 80 % der Zellen sollte ...

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Diskussion

Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ermöglichen die Bildgebung und Quantifizierung des dynamischen Efferocytic-Prozesses mit fest-Zelle und live-Cell Ansätzen. Diese Ansätze bieten mehrere Vorteile gegenüber den verwendeten Flow Cytometry-basierte Methoden23,24. Die Verwendung der Inside-Out-Färbung mit festen Proben bietet eine robuste und präzise Quantifizierung der Rate und das Ausmaß der Efferocytosis — in der Tat viele Flow Cytometry-basierte Meth...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.

Danksagungen

Diese Studie wurde von kanadischen Institute Health Research (CIHR) Betrieb Grant MOP-123419, Naturwissenschaften und Engineering Forschung Rat von Kanada Discovery Grant 418194, Ontario Ministerium für Forschung und Innovation frühen Forschungspreis für BH finanziert. DGW trugen einige der Bilder präsentiert, um die Optimierung der Protokolle und das Schreiben des Manuskripts; Er wurde durch eine selbstansaugende Pumpe von der University of Liverpool finanziert. CY wird von einem Vanier Graduate Stipendium und CIHR MD/PhD Zugehörigkeit finanziert. Förderinstitutionen hatte keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RPMI 1640 MediaWisent3500-000-EL
DMEM MediaWisent319-005-CL
Fötales Rinderserum (FBS)Wisent080-150
PBSWisent311-010-CL
18 mm kreisförmige Glasdeckgläser #1,5 DickeElektronenmikroskopie Wissenschaften72290-08Größe und Form des Deckglases sind unkritisch, aber 18 mm passen in die Vertiefungen einer Standard-12-Well-Platte, was die Zellkultur vereinfacht
StaurosporinCayman Chemical81590Auflösen in DMSO bei 1 mM (1.000x Stammlösung)
Annexin V-Alexa 488ThermoFisherR37174
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217In einem Exsikkator aufbewahren. Bereiten Sie keine Stammlösung vor.
DMSOSigma-AldrichD2650
CellTrace FarRedThermoFisherC34572
CellTrace OrangeThermoFisherC34851
Hoescht 33342ThermoFisher62249
FITC-StreptavadinThermoFisherSA1001
Lympholyt-Polyzell-TrennmediumCedarlane LabsCL5071
Rekombinante humane M-CSFPeprotech200-04
Rekombinante humane IL-4Peprotech300-25
J774.2 Makrophagen-ZelllinieSigma-Aldrich85011428-1VL
THP-1 humane Monozyten-ZelllinieATCCTIB-202
Jurkat T-ZelllinieATCCTIB-152

Referenzen

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Quantifizierung der EfferozytoseAufnahme apoptotischer ZellenDual Labeling AnsatzZelltracking FarbstoffOberfl chenbiotinylierungStreptavidin F rbungLive Cell Mikroskopiefluoreszierende ReportergeneZ Stapel Analyse

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