Methodenartikel

Eine Silber Nanopartikel-Methode für bessernde biliären Atresie-Syndrom bei Mäusen

DOI:

10.3791/58158

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13. Oktober 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1First Affiliated Hospital of Jinan University, 2Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Women & Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt ausführlich eine Methode basierend auf Silber-Nanopartikel für bessernde biliären Atresie-Syndrom in einem Mausmodell der experimentellen biliären Atresie. Ein solides Verständnis der Vorbereitungsprozess Reagenz und die Neugeborenen Maus Injektionstechnik hilft Forschern mit der Methode in Studien an Neugeborenen Mäusen Modell vertraut zu machen.

Zusammenfassung

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Biliären Atresie (BA) ist eine schwere Form der Cholangitis mit einer hohen Mortalität bei Kindern, von denen die Ätiologie noch nicht vollständig verstanden wird. Virale Infektionen können eine mögliche Ursache sein. Die typische Tiermodell verwendet für das Studium BA wird von einer Neugeborenen Maus mit einem Rhesus-Rotaviren impfen gegründet. Silber-Nanopartikel sind gezeigt worden, um antibakterielle und antivirale Wirkung auszuüben; Ihre Funktion in der BA-Maus-Modell wird in dieser Studie ausgewertet. Derzeit im Tierversuch BA die Methoden verwendet, um die Symptome von BA Mäusen zu verbessern in der Regel symptomatische Behandlungen über Lebensmittel oder andere Medikamente gegeben. Das Ziel dieser Studie ist eine neue Methode zur bessernde BA-Syndrom bei Mäusen durch die intraperitoneale Injektion von Silber-Nanopartikeln zu demonstrieren und detaillierte Verfahren zur Herstellung von Silber-Nanopartikel Gel-Formulierung zur Verfügung zu stellen. Diese Methode ist einfach und vielseitig einsetzbar und kann verwendet werden, um den Mechanismus der BA sowie in klinischen Behandlungen zu erforschen. Basierend auf der BA-Maus-Modell, wenn die Mäuse Gelbsucht aufweisen, wird das vorbereitete Silber Nanopartikel Gel intraperitoneal an die Oberfläche der unteren Leber gespritzt. Der Überlebens-Status wird beobachtet, und biochemische Indikatoren und Leber Histopathologie geprüft. Diese Methode ermöglicht ein intuitiveres Verständnis für die Einrichtung das BA-Modell und die neue BA-Behandlungen.

Einleitung

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BA ist eine Form der Cholestase gekennzeichnet durch anhaltende Gelbsucht und hat hohe Sterblichkeitsrate in Ermangelung einer Lebertransplantation. Virale Infektionen sind eng verbunden mit der Pathogenese der BA. Das Zytomegalievirus wirtseigenen und Rotaviren sind alle als Krankheitserreger in BA1,2,3vorgeschlagen worden. In der Neugeborenenperiode ergibt sich die Antwort des unreifen Immunsystems auf eine virale Infektion immun Dysregulation gegen extra- und intrahepatischen Gallenwege, führt zur biliären Epithelzelle Apoptose, entzündliche Zelle eindringen in das portal Bereich, intrahepatischen und extrahepatische Gallenwege Obstruktion, und zu guter Letzt Leberfibrose4,5,6.

Die häufigsten verwendete Tiermodell für BA Studium beinhaltet die Impfung von Neugeborenen Maus mit Rhesus-Rotaviren (RRV). Die Maus entwickelt in der Regel Gelbsucht nach 5-6 Tagen zeigt ein niedriges Körpergewicht und acholic Hocker. Die Rolle der Immunantwort im Krankheitsprozess ist kritisch, vor allem für natürliche killer (NK)-Zellen; der Abbau dieser Zellen mit Anti-NKG2D Antikörper reduziert BA-induzierten Schäden7. Darüber hinaus andere Zellen, einschließlich CD4+ T-Zellen, CD8+ T Zellen, Dendritische Zellen und regulatorische T-Zellen wurden alle Rollen in der Krankheit8,9,10,11spielen gezeigt. Alle Daten deuten darauf hin das unverzichtbare Natur des Immunsystems im Zuge der BA.

Silber-Nanopartikel (AgNPs) wurden nachgewiesen, um wohltuende Wirkung gegen einige Infektionskrankheiten, einschließlich bakterieller Infektionen12 und Virusinfektionen13,14,15zu haben. Jedoch haben außer dermatologischen Nutzung nur wenige Studien AgNPs in eine klinische Behandlung, vor allem wegen ihrer potenziellen Toxizität verwendet. Im Tierversuch untersuchten Forscher in der Regel die Wirksamkeit von AgNPs verwaltet über mündliche16 oder intravenöse Methoden17. Jedoch haben keine andere Forscher untersuchten die Wirksamkeit der AgNPs verwaltet über eine intraperitoneale (i.p.) Injektion bei Neugeborenen Maus experimentiert, die eine einfache und schnelle Methode um eine direktere Wirkung auf die Leber und Gallenwege während führt reduziert die Toxizität zu anderen Systemen, wie das Immunsystem. AgNPs haben gezeigt, dass NK Zelle Aktivität18beeinflussen; Daher haben wir die therapeutische Wirkung von AgNPs verwaltet über i.p.-Injektion in den BA-Maus-Modell getestet.

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Protokoll

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Alle tierischen experimentelle Protokolle wurden von der institutionellen Animal Care und Nutzung von Sun Yat-Sen University Laboratory Animal Center (#IACUC-DB-16-0602) genehmigt.

1. Festlegung der biliären Atresie-Maus-Modell

  1. Pflegen Sie schwanger BALB/c Mäuse in einem bestimmten Pathogen-freies Umfeld unter einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus bei 25 ° C, mit Zugang zum autoklaviert Chow Ad Libitum.
  2. Um die RRV Belastung MMU 18006 vorzubereiten, verstärken Sie das Virus in den Zellen MA104 und Messen Sie die virale Titer eine Plaque-Assay-19.
    Hinweis: MA104 Zellen sind in Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in einem Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO2kultiviert. Die Verstärkung Schritte werden nachfolgend kurz beschrieben.
    1. MA104 Zellen infizieren (1,5 x 107) in einem 150 cm2 Kultur Kolben mit Trypsin aktiviert RRV [1.5 x 106 Plaque-bildenden Einheiten (PFU)] in 30 mL serumfreien Medium. 3 Tage in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2inkubieren Sie infizierten Zellen.
    2. Lösen Sie die infizierten Zellen in der Kultur-Kolben von drei Gefrier-tau-Zyklen mit 20 min in einem-80 ° C Gefrierschrank für jede Phase Einfrieren und wieder Auftauen der Zellen auf Raumtemperatur; die Zelle-assoziierten Viruspartikel werden in der Überstand freigeben. Dann sammeln Sie und übertragen Sie die Zelle lysate und Kultur überstand in ein 15 mL konische Röhrchen.
    3. Entfernen Sie große zelltrümmer aus der lysate von Lowspeed Zentrifugation (300 X g bei 4 ° C für 3 min). Übertragen Sie anschließend des Überstands mit dem Virus (ca. 6 mL) in ein neues 15 mL konische Röhrchen für Tierversuche.
      Hinweis: Die RRV ist dann bereit, hochinfizierende, regelmäñig, und für weitere Runden der Verstärkung verwendet oder gelagert werden. Langfristiger Exposition gegenüber Raumtemperatur kann die Virusinfektion Kapazität herabsetzen; Das Virus sollte auf Eis gelegt und bei-80 ° C oder in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
  3. Last die RRV in einem kleinvolumigen (1 mL) Insulin Spritze mit einer 29-G-Nadel für die Neugeborenen Maus-Injektion.
    Hinweis: Die dicken Nadeln der volumetrischen Spritzen führen leicht zum Medikament auslaufen.
  4. Innerhalb von 24 Stunden nach der Geburt um jedes Neugeborene 20 µL 1,2 x 105 PFU/mL RRV über die i.p.-Route zu verwalten; Verwenden Sie die gleiche Menge an Kochsalzlösung als Kontrolle.
    Hinweis: Die Spritze verwendet in diesem Experiment ist eine 1 mL Spritze mit Insulin. Infizierte Mäuse, die von ihren Müttern starben innerhalb der ersten 2 Tage aus anderen Gründen nicht gefüttert wurden, wurden nicht in die Analyse einbezogen.
  5. Alle Neugeborene Mäusen genau beobachten und sie täglich zu wiegen. In der Regel am sechsten Tag nach der Inokulation RRV, Gelbsucht auf die Ohren und nackter Haut erscheint der Hocker wird Ton gefärbte und das Fell wird ölig, was auf die Einrichtung des Modells BA; Überprüfen Sie für diese Symptome.
    Hinweis: BA kann durch eine Lebergewebe Abschnitt Untersuchung mit H & E und immunhistochemische Angabe bestätigt werden. Die BA-Mäuse sind dann bereit für die Behandlung der Psychopharmakologie.
    Achtung: Das Protokoll dargestellt ist für den Einsatz mit zeitgenössischen tierische und menschliche RV Stämmen, die unter Biosafety Level 2 (BSL-2) Bedingungen behandelt werden muss.

2. Silber-Nanopartikel-Synthese

  1. Bereiten Sie vor und zu charakterisieren Sie, die AgNPs wie zuvor beschrieben12,20.
    Hinweis: Die Details der Vorbereitung und Charakterisierung der AgNPs wurden in Publikationen von C. M. Che Team am Department of Chemistry, der University of Hong Kong12,20beschrieben. Die Endkonzentration der Lösung betrug 1 mM. Der mittlere Durchmesser der AgNPs war 10 nm (zwischen 5 bis 15 nm) und bestätigt durch Elektronenmikroskopie.

3. Vorbereitung der Silber-Nanopartikel-Kollagen-Mischung

Hinweis: Die Psychopharmakologie Kollagen Mischung vorbereitet und geprägt wie zuvor21 beschrieben und bei 4 ° c gelagert Alle Verfahren müssen auf Eis durchgeführt werden.

  1. Fügen Sie zunächst für die Kollagen-Vorbereitung, 490 µL Typ I Kollagen (4 mg/mL), ein 1,5 mL-Tube und legen Sie es auf dem Eis.
  2. Das Kollagen 100 µL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, 10 X) hinzu und mischen Sie es mit einer Pipette.
    1. Um 1 L 10 X PBS-Puffer vorzubereiten, zu kombinieren, 80 g NaCl, KCl, 2G-und 35,8 g Na2HPO4. 12H2O bis 2,4 g KH2PO4 und Laden der Puffer bei Raumtemperatur.
  3. Fügen Sie 10 µL NaOH (0,2 M) an die oben genannte Lösung.
    1. Um 0,2 M NaOH vorzubereiten, fügen Sie 8 g NaOH Pulver zu 1 L destilliertes Wasser hinzu.
  4. Zu guter Letzt das Kollagen 400 µL des AgNPs (1 mM) hinzu und mischen Sie sie mit einer Pipette.
    Hinweis: Fügen Sie die AgNPs zuletzt für eine sogar mischen. Die Psychopharmakologie Kollagen Mischung sollte bei 4 ° C gelagert werden; Ansonsten, erstarrt es leicht bei Raumtemperatur.

(4) Maus-Injektionsverfahren

  1. Verwalten Sie die infizierten Neugeborenen Mäuse in der behandelten Gruppe RRV mit einer i.p.-Injektion von 50 µL der Psychopharmakologie Kollagen Mischung nach dem Auftreten der Gelbsucht; durchführen Sie eine zweite Injektion 3 d später.
    Hinweis: Die Mäuse in der Kontrollgruppe RRV (infizierte Control) sind die gleiche Menge an Kochsalzlösung gegeben, und die Mäuse in der normalen Kontrollgruppe werden nicht behandelt.
  2. Drücken Sie zu Beginn der Injektion die Maus Bein mit dem Ringfinger schräg über den rechten Oberschenkel und einführen der Nadel langsam in einem Winkel von 15° (Abbildung 1). Injizieren Sie nach dem Erreichen der Oberfläche des unteren Randes der Leber (Abbildung 2), ca. 0,5 cm in die Psychopharmakologie Kollagen Mischung; dann die Nadel langsam zurückziehen.
    Hinweis: Achten Sie darauf, keine Luft in die Spritze als einführen, dann die Neugeborene Maus getötet werden kann. Bei Neugeborenen Mäusen den Magen und Milz sind in der linken Bauch und der Bauch ist voll Milch. Wenn von dieser Seite die Injektion verabreicht wird, kann die Nadel leicht entweder den Magen Milch fließen in die Bauchhöhle oder die Milz verursacht Blutungen verursacht eingeben.
    Achtung: Achten Sie auf die Nadel zu jeder Fingerverletzungen zu vermeiden, und achten Sie darauf, die nadelschutzkappe ersetzen, entfernen die Nadel und legen Sie sie in ein Scharfbehälter.
  3. Halten Sie nach den Injektionen die Mäuse aus ihren Käfigen für 10 min um die Psychopharmakologie Kollagen Mischung zu Gelieren und verhindern, dass die Mutter lecken der Injektionsstelle zu ermöglichen. Kehren Sie die Mäuse in ihren Käfigen.
  4. Beobachten Sie und notieren Sie die physikalische Erscheinungen von allen Mäusen täglich, einschließlich Gelbsucht und Körpergewicht sowie die Überlebensrate.

5. Blut Probe Sammlung

Hinweis: Blutproben von ca. 120 µL werden gesammelt, durch die Nadel ins Herz. Nach Zentrifugation ist das Serum gesammelt (ca. 70 µL) für die Prüfung der Funktion der Leber. Die Blut-Sammlung-Methode ist wie folgt.

  1. Die Mäuse am 9. und 12. Tag nach der RRV Inokulation (das ist 3 Tage nach der Behandlung der Psychopharmakologie) zu betäuben mit 0,5-2,5 % Sevofluran.
  2. Immobilisieren Sie die Gliedmaßen der Maus zu und Sterilisieren Sie die oberen und unteren Bauch mit 75 % Alkohol.
  3. Setzen Sie die Membran durch die Maus Haut, Muskel und Bauchfell entlang der Mittellinie auf dem Xiphoid mit einer Schere zu schneiden; den Magen-Darmtrakt, die das Zwerchfell vollständig aussetzen entfernen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen.
  4. Stechen Sie die Nadel (mit einer 1 mL Spritze entladen Insulin) in den linken Ventrikel des Herzens und zurückziehen Sie langsam des Spritzenkolbens um die maximale Blutvolumen zu erhalten. Übertragen Sie anschließend das Blut auf eine 1,5 mL-Tube.
  5. Lassen Sie den Schlauch für 30 min bei Raumtemperatur stehen und für 5 min bei 400 X gZentrifugieren. Dann mit einer transferpipette, sammeln Sie und speichern Sie das Serum für die weitere Verwendung.
    Hinweis: Nicht zu beschädigen das Zwerchfell als Membran, die Mängel leicht zu Pneumothorax, Tod und Blutgerinnung und verhindert somit die Blutentnahme Probe führen.

(6) biochemische Parameter Erkennung

  1. Verwenden Sie das Serum in Schritt 5.5 für eine biochemische Parameter Erkennung gesammelt.
  2. Verwenden Sie einen automatischen biochemischen Analysator um folgende biochemische Parameter erkennen: Alanin-Aminotransferase (ALT), Aspartat-Aminotransferase (AST), alkalische Phosphatase (ALP), Gesamt-Protein (TP), Albumin (ALB), Globulin (GLO), Gesamt-Bilirubin (TBIL), Direktes Bilirubin (DBIL), indirekte Bilirubin (IBIL) und total Gallensäuren (TBA).

(7) extrahepatische Cholangiographie, extrahepatische Gallenwege Durchgängigkeit zu beobachten

Hinweis: Führen Sie den gesamten Prozess unter dem Mikroskop Dissektion.

  1. Vollständig aussetzen der Leber, Gallenblase und extrahepatische Gallengänge mit einem Wattestäbchen.
  2. Beobachten Sie und fotografieren Sie das Erscheinungsbild der Leber und der Gallenwege unter dem Mikroskop Dissektion.
  3. Verwenden Sie ophthalmologische Zange sanft die Unterseite der Gallenblase zu halten.
  4. Laden Sie eine 1 mL Spritze mit Methylenblau-Lösung (0,05 wt.% in H2O). Fügen Sie langsam die Spritzennadel in den Hohlraum der Gallenblase; dann fassen Sie die Nadel mit der ophthalmologischen Zange und ziehen Sie langsam 10 – 20 µL Methylenblau.
  5. Unter dem Mikroskop zu beobachten Sie, ob die blaue Farbe der extrahepatische Gallenwege, das Jejunum durchläuft und fotografieren.

(8) Sammlung von Frische Leber Proben für Hämatoxylin und Eosin Färbung

  1. Befestigen Sie die frischen Maus Leber Gewebe über Nacht 10 % Formalin.
  2. Dann die feste Leber Gewebe in Paraffin einbetten und sie Abschnitt.
  3. Wachsentfernung Abschnitte, rehydrieren sie mit einer Ethanol-Serie (z. B. 95 %, 100 %, 80 % und 70 % Ethanol in destilliertem Wasser, jeweils für 5 min), färben die Gewebeschnitte mit Hämatoxylin, zu einer 1 % Salzsäure-Alkohol-Differenzierung zu unterwerfen und schließlich Fleck der Abschnitte mit Eosin.
  4. Zu guter Letzt beobachten Sie die Histopathologie der Leber unter dem 40 X Mikroskop.

9. immunhistochemische Färbung Hämatoxylin und Eosin-gefärbten Gewebeschnitten

  1. Führen Sie nach entwachsen und dehydriert in den Abschnitten ein Antigen-Retrieval durch Eintauchen in den Abschnitten Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris-Base, 1 mM EDTA Lösung, pH 9,0) und Heizen sie in der Mikrowelle für 10 min bei 95 ° C.
  2. Entfernen Sie endogene Peroxidase, indem man die Gewebeschnitte für 10 min in einer 3 % Wasserstoffperoxid-Lösung.
  3. Behandeln Sie die Abschnitte mit 5 % ziegenserum, unspezifische Bindung zu blockieren.
  4. Fügen Sie Primärantikörper Kaninchen-Maus NKG2D (1: 100) zu den Abschnitten und inkubieren sie über Nacht bei 4 ° C.
  5. Inkubieren Sie die Abschnitte mit den entsprechenden Sekundärantikörper (HRP-mit der Bezeichnung Polymer-Anti-Kaninchen-System) für 30 min bei Raumtemperatur.
  6. Die immunhistochemische Färbung mit 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB) als Chromogen zu visualisieren.
  7. Die Abschnitte unter dem 40 X Mikroskop beobachten, Bilder und gehen Sie sie wie gewünscht zu analysieren.

10. durchflusszytometrischen Analyse

  1. Schonend Zerkleinern das Lebergewebe, ein 70 µm Zelle Sieb passieren und Zentrifugieren Sie es 2 X 270 X g bei 4 ° C für 4 Minuten.
  2. Aufschwemmen der Zelle Pellet in RPMI 1640 Medium und analysieren, indem Sie zwei-Farben-Immunfluoreszenz mit monoklonalen Antikörpern.
  3. Führen Sie zellulare Phänotypisierung mit spezifischen Zelloberfläche Markern, einschließlich Fluorescein erfolgt und Phycoerythrin-konjugierten Anti-NKp46 (NK Lymphozyten; 1:1, 000) und Anti-CD4 (T-Zell-Subtyp; 1:1, 000), mit einem Durchflusszytometer und Analysieren der Daten mit Flow Cytometry Datenanalyse-Software.
  4. Wählen Sie Zell-Populationen nach vorwärts/Side Scatter, Tor nach Isotype Kontrollen entfallen auf jede Hintergrundfluoreszenz, und die Daten eine Sekundäranalyse anhand der Fluoreszenz-Signale von individuellen Antikörper.

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Ergebnisse

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Basierend auf den etablierten BA-Maus-Modell, die infizierten Neugeborenen Mäusen verabreicht wurden eine i.p.-Injektion von vorbereitete Psychopharmakologie Kollagen Mischung 2 X nach Ausstellung Gelbsucht. Maus überleben wurde für den täglichen überprüft, und Leberfunktion Tests, Leber Pathologie und Durchflusszytometrie wurden durchgeführt. Im Vergleich zu den unbehandelten Kontrolle BA Mäusen, Psychopharmakologie-behandelten Mäusen zeigte reduzierte Gelbsucht und gepflegt ihr normales...

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Diskussion

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AgNPs zeigen starke Breitspektrum antibakterielle Eigenschaften und eine starke Durchlässigkeit22; Darüber hinaus dienen sie verschiedenste antibakterielle medizinische Produkte23zu produzieren. Jedoch kann AgNPs dauern eine lange Zeit zu löschen, sobald sie reichern sich in den Organen, und diese Beharrlichkeit zu toxischen Wirkungen24,25führen kann. Eine frühere Studie untersuchte die akute Toxizität und Genotoxiz...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die hier verwendeten AgNPs waren ein Geschenk von C. M. Che im Department of Chemistry, University of Hong Kong. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81600399) und der Wissenschaft und Technologie-Projekt von Guangzhou (No.201707010014) finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BALB/c MausGuangdong Medical Experimental Animal CenterSYXK2017-0174Tierversuch
Rhesus-Rotavirus (RRV)ATCCATCC  VR-1739Etablierung des Gallengangsatresie-Mausmodells
MA104 ZellenATCCATCC  CRL-2378.1Nur für Laborzwecke
DMEMThermo Fisher10569010Säugetierzellkultur
Fötales RinderserumThermo Fisher10099141Säugetierzellkulturkollagen
Typ ICORNING354236Nur für Forschungszwecke
PBS-PufferOXOIDBR0014GZum Waschen
von NaOHSigma1310-73-2Passen Sie den PH-Wert
AgNP Antibacterial
Hinweis: Das AgNps war ein Geschenk von Prof. CM Che am Department of Chemistry, der University of Hong Kong.
Insulinspritze mit integrierter NadelBD9161635SFür medizinische Zwecke
15 mL ZentrifugenröhrchenCorning430791Nur für Laborzwecke
1,5 mL MikrozentrifugenröhrchenGEBCT0200-B-NNur für Laborzwecke
MikroskopNikonECLIPSE-CiFür Laborzwecke
Präparier-/IntravitalmikroskopNikonSMZ 1000Für Laborzwecke
Anti-Maus NKp46 FITCeBioscience11-3351Nur für Forschungszwecke
Anti-Maus CD4 PE-Cyanin5eBioscience15-0041Nur für Forschungszwecke
Monoklonale Maus Anti-Human-CD4DAKO20001673Nur für Forschungszwecke
Anti-NKG2DRDMAB1547Nur für Forschungszwecke
BD FACSCanto DurchflusszytometerBD BiosciencesFACS Canto PlusNur für den Laborgebrauch

Referenzen

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Biliary AtresiaSilver NanoparticlesNeonatal Mouse ModelRhesus RotavirusIntraperitoneal InjectionSilver Nanoparticle GelExtrahepatic CholangiographyHematoxylin and Eosin StainingFlow CytometryLiver Histopathology

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