Methodenartikel

Koffein-Extraktion, enzymatische Aktivität und Genexpression von Koffein-Synthase aus Anlage Zellsuspensionen

DOI:

10.3791/58166

⸱

2. Oktober 2018

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1Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Centro de Investigación Científica de Yucatán, 2CONACYT, Facultad de Ingeniería Química, Campus de Ciencias Exactas e Ingeniería, Universidad Autónoma de Yucatán

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode für die Extraktion und Quantifizierung des Koffeins in Zellsuspensionen von C. Arabica L. und einer experimentellen Verfahren für die Bewertung der enzymatischen Aktivität von Koffein-Synthase mit dem Ausdruck Das Gen, das dieses Enzym kodiert.

Zusammenfassung

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Koffein (1,3,7-Trimethylxanthine) ist ein Purin-Alkaloid in beliebte Getränke wie Kaffee und Tee vorhanden. Diese sekundären Metaboliten gilt als eine chemische Verteidigung, denn es antimikrobielle Wirkung hat und ein natürliches Insektizid als gilt. Koffein kann auch negative Allelopathische Effekte produzieren, die das Wachstum der umliegenden Pflanzen zu verhindern. Darüber hinaus verbrauchen die Menschen auf der ganzen Welt Koffein für seine schmerzlindernde und stimulierende Wirkung. Aufgrund des Interesses in der technologischen Anwendungen von Koffein ist Forschung auf der biosynthetische Bahn dieser Verbindung gewachsen. Diese Studien konzentrierten sich in erster Linie auf das Verständnis der biochemischen und molekularen Mechanismen, die die Biosynthese von Koffein zu regulieren. In-vitro- Gewebekultur ist ein nützliches System für das Studium dieser biosynthetische Bahn geworden. In diesem Artikel wird Schritt für Schritt-Protokoll für die Quantifizierung von Koffein und Messung der Transkription des Gens (CCS1) Codierung Koffein-Synthase (CS) in Zellsuspensionen von C. Arabica L. sowie seine Tätigkeit beschreiben.

Einleitung

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Koffein ist eine sekundäre Metaboliten, die Biosynthesized von Pflanzen der Gattung Coffea1ist. Dieses Alkaloid gehört zur Familie methylxanthin und gilt als eine Chemiefabrik Verteidigung, weil es gegen die schädlichen Wirkungen von Krankheitserregern und Pflanzenfresser2,3handeln kann. Dieser Metabolit ist darüber hinaus verantwortlich für die stimulierenden Eigenschaften von Kaffee trinken, die häufig konsumierte weltweit4,5. Aufgrund seiner Eigenschaften interessieren mehrere Forschergruppen Studium die biosynthetis....

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Protokoll

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1. Koffein Extraktion in Zellsuspensionen von C. Arabica L.

  1. Verwenden Sie C. Arabica Zelle Suspensionen9. Pflegen Sie die Suspensionen von zweiwöchentlich Subkulturen in Murashige und Skoog Medium bei pH 4,3 mit konstant 100 u/min schütteln bei 25 ° C unter Dauerlicht (8,3 W/m2).
  2. Ernten Sie die Zellen unter Vakuumfiltration mit 11 µm Pore Filterpapier und einen Büchner-Trichter.
  3. Registrieren das Frischgewicht der gesammelten Zellen mit Hilfe einer Skala, in Alufolie wickeln und Einfrieren in flüssigem Stickstoff aufbewahren bei-80 ° C bis zur Analyse.
  4. Lyophilize das gefrorene ....

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Ergebnisse

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Koffein-Extrakte erhalten über das hier vorgestellte Verfahren analysiert wurden von TLC-Densitometrie durch die Proben um Chromatographie nach dem Schema in Abbildung 1gezeigte Platte zu unterwerfen. Verwendet, um die Ebenen von Koffein in zellextrakte, eine Kurve mit verschiedenen Konzentrationen von kommerziellen Standard zu quantifizieren, denn diese Verbindung war (Abbildung 2A). Das Muster der Absorption für Koffein wurde a.......

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Diskussion

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Wir stellen Ihnen hier die optimalen Bedingungen für die Bewertung der Koffein Inhalt, CS Aktivität und Transkript Ebenen in ein in-vitro- Pflanzen Gewebekultur, z. B. Zellsuspensionen von C. Arabica. Frühere Berichten haben bestätigt, dass die Zellen unter Lichteinstrahlung und in Anwesenheit von Theobromin in das Kulturmedium geeignete Parameter für die Erhöhung von Koffein, die es ermöglichen, die Koffein-Trennverfahren bewerten umgekehrt-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) verw.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Arbeit unseres Labors wurde finanziert durch einen Zuschuss aus dem Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) an SMTHS. Diese Forschung wurde auch durch ein Stipendium gewährte CONACyT und Sistema Nacional de Investigadores (4422), RJPK (Nr. 37938) unterstützt. Die Autoren danken CIATEJ für die Nutzung der Anlagen während des Schreibens dieses Manuskriptes. Besonderer Dank sind für alle Empfehlungen im Bereich Molekularbiologie und Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM für die Einrichtungen zu Dr. Víctor Manuel González Mendoza verlängert, während der Dreharbeiten zu diesem Artikel.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Murashige & Skoog BasalsalzmischungPhytoTechnology LaboratoriesM524Packungsgröße: 50 L
Reagenz (mg/L)
Ammoniumnitrat (1650)
Borsäure (6,2)
Calciumchlorid, wasserfrei (322,2)
Kobaltchlorid• H2O (0,025)
Kupfersulfat• 5H2O (0,025)
Na2EDTA• 2H2O (37.26)
Eisensulfat• 7H2O (27,8)
Magnesiumsulfat, wasserfrei (180,7)
Mangansulfat• H2O (16.9)
Molybdinsäure (Natriumsalz)• 2H2O (0,25)
Kaliumiodid (0,83)
Kaliumnitrat (1900)
Kaliumphosphat, einbasig (170)
Zinksulfat• 7H2O (8,6)
Ergänzt mit
Myo-Inositol (100)
Thiamin (10)
Cystein (25)
Saccharose (30000)
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (3)
6-Benzylamin-Purin (1)
KoffeinSIGMAC0750-5GSTANDARD-5g
TheobrominSIGMAT450020 g
CAMAG TLC Scanner-4CAMAG27.62
WinCATS Planar Chromatography Manager SoftwareCAMAG1.4.10Software
Isoamylalkohol (24:1)SIGMAC-0549500 mL
CyclohexanJALMEXC4375-131 L
AcetonJ.T. BAKER4 L
MethanolJ.T. BAKER9093-034 L
ChloroformJALMEXC-4425-153,5 L
DC-Kieselgel 60 F254Merck1.05554.0001
DC-Platteβ-MercaptoethanolM6250SIGMA100 mL
(+)-Natrium L-AscorbatA4034SIGMA100 g
Trizma-BaseSIGMAT60661 Kg
Salzsäure 36,5-38%J.T. Baker9535-052,5 L
Pierce BCA Protein Assay KitThermo scientific232227Kit
Methyl [3H]-S-adenosylmethioninPerkin ElmerNET155Spezifische Aktivität von 15 Ci/mmol
FlüssigszintillationsfläschchenSIGMAZ253081
Thermostatisches Bad/ZirkulatorCole Parmer60714
MikrozentrifugenröhrchenEppendorfRöhrchen mit 1,5 mL
Kryo-FläschchenHeathrow ScientificHS23202A2 mL
Zentrifuge 5804Eppendorf5804 000925
VortexThermolyneLR 5947
PorzellanmörtelFisherbrandFB961B
FilterpapierWhatmanZ274844Porosität
MediumPicofugeStratagene4005502000 x g
AnalysenwaageUNDHR-120Modell HR-120
SzintillationszählerBeckman Coulter6500
Gel FotodokumentationssystemBio-RadChemic XRSModell Chemic XRS
Compact UV-LampeUVP95002112UVGL-25
Scienceware HDPE Buchner TrichterSIGMA2419907Typ 37600 Mischer
TRIzol ReagenzThermo scientific15596-018200 mL
ReverdAid Reverse TranskriptaseThermo scientific#EP044110000 U
Oligo (dT)18 PrimerThermo scientific#S0131100 µ M
DNase I, RNase-freiThermo scientific#EN05251000 U
MagnesiumchloridThermo scientificEN05251,25 mL
EthylendiamintetraessigsäureThermo scientificEN05251 mL
dNTP MixThermo scientificR0191R0191 SYBR
Green qPCR Master Mix (2X)Thermo scientificK0251Für 200 Reaktionen von 25 & Mikro; L
PikoRealThermo scientific2.2Software
Phenol, pH 8,0, äquilibriert, Molekularbiologie, hochreinUSBJ75829100 mL
IsopropylalkoholKaral20401 L
EthylalkoholSIGMA641751 L
DiethylpyrocarbonatSIGMAD5758100 mL
LaborrotatorLW ScientificMod. LW210
900643

Referenzen

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  1. Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
  2. Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
  3. Sled....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Caffeine ExtractionEnzymatic ActivityGene ExpressionCaffeine SynthasePlant Cell SuspensionsTLC DensitometryRNA IsolationReal Time PCRScintillation CounterProtein Assay

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