Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

Zusammenfassung

Wir beschreiben drei experimentelle Methoden zur Bewertung der Hypopigmentation Aktivität von Chemikalien, die in-vitro-: Quantifizierung der 1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Messung von Melanin durch zelluläre Melanin Färbung und Bildanalyse.

Zusammenfassung

Diese Studie stellt Labormethoden für die Quantifizierung von Hypopigmentierung Aktivität in vitro. Melanin, das große Pigment in Melanozyten, wird als Reaktion auf mehrere zelluläre und umweltbedingten Faktoren synthetisiert. Melanin schützt die Hautzellen vor UV-Schäden, aber auch biophysikalische und biochemische Funktionen hat. Übermäßige Produktion oder Ansammlung von Melanin in den Melanozyten kann dazu führen, dass dermatologische Problemen, wie z. B. Muttermale, Sommersprossen, Pigmentflecken und Melasma. Daher ist die Kontrolle der Melanogenese mit Hypopigmentierung Agenten wichtig bei Patienten mit klinischen oder kosmetische Bedürfnisse. Melanin wird in erster Linie in den Melanosomen Melanozyten in einen komplexen biochemischen Prozess namens Melanogenese, welche von der Erwartungshaltung extrinsischen und intrinsischen Faktoren wie Hormone, Entzündungen, Alter und UV-Licht Exposition synthetisiert. Wir beschreiben drei Methoden zur Bestimmung der Hypopigmentation Aktivität von chemischen oder natürlichen Substanzen in Melanozyten: Messung von (1) zellulären Tyrosinase-Aktivität und Melanin (2) Inhalt und (3) Färbung und Quantifizierung zellulären Melanin mit Bild Analyse.

In Melanogenese katalysiert Tyrosinase die Bandbreitenbegrenzung Schritt, der L-Tyrosin in 3,4-Dihydroxyphenylalanine (l-Dopa) und dann in Dopaquinone umwandelt. Daher ist die Hemmung der Tyrosinase eine primäre Hypopigmentierung Mechanismus. In kultivierten Melanozyten kann Tyrosinase-Aktivität durch Hinzufügen von l-Dopa als Substrat und Messung Dopaquinone Produktion durch Spektralphotometrie quantifiziert werden. Melanogenese kann auch durch Quantifizierung des Melanin Inhalts gemessen werden. Der Melanin-haltigen zelluläre Anteil wird mit NaOH extrahiert und Melanin wird spektrophotometrisch quantifiziert. Zu guter Letzt kann der Melanin Inhalt durch die Bildanalyse nach Fontana-Masson Färbung von Melanin quantifiziert werden. Obwohl die Ergebnisse dieser in-vitro-Untersuchungen nicht immer in der menschlichen Haut reproduziert werden können, sind diese Methoden vor allem als erster Schritt um potenzielle Hypopigmentierung Aktivitäten zu erkennen in der Melanogenese Forschung, verbreitet. Diese Methoden können auch zur Aktivität der Melanozyten, Wachstum und Differenzierung zu bewerten. Die Gültigkeit der Effekte gewährleisten konsistente Ergebnisse mit drei verschiedenen Methoden.

Einleitung

Melanin spielt eine entscheidende Rolle in der Physiologie, Pathologie und Toxikologie mehrere Organe einschließlich der Haut, Augen und Gehirn¹. Hauptfunktionen von Melanin sind Foto-Screening und biochemischen Wirkungen. Melanin absorbiert Nah-Infrarot- und sichtbares Licht sowie Ultraviolett (UV) Strahlung, mit erhöhten Absorptionsraten bei kürzeren Wellenlängen des Lichts; Melanin schützt somit vor Schäden durch sichtbares Licht oder UV Strahlung²Gewebe. Melanin ist ein Antioxidans und hat eine Affinität für Metalle und andere giftigen Chemikalien; Daher kann es Gewebe vor oxidativen und chemischen Stress

Protokoll

1. Vorbereitung von Mediums, Verbindungen und Reagenzien

1. B16F10 komplette Wachstumsmedium vorzubereiten. Ergänzung Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin (PEST).
   1. Um 500 mL des kompletten Medium zu machen, mischen Sie 445 mL Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) mit 50 mL der FBS und 5 mL von PEST in eine sterilisierte Glasflasche 1 L. Nach dem Mischen sanft, Filtern Sie das Medium durch einen 0,2 µm Flaschenverschluss Filter, um eine neue sterilisierte Glasflasche und dann speichern bei 4 ° C.
      Achtung: Alle Kulturtechniken der Zelle sollte in mikrobiologischen Sicherheitssch....

Ergebnisse

Repräsentative Ergebnisse für die Hypopigmentation Aktivität von Arbutin, ein Anti-Melanogenic compound in B16F10 Melanozyten sind unten dargestellt. Abbildung 1A zeigt, dass Arbutin deutlich unterdrückt die zelluläre Tyrosinase-Aktivität im Vergleich mit dem Fahrzeug behandelt. In ähnlicher Weise wurde der Melanin Inhalt von Zellen stimuliert mit Arbutin deutlich im Vergleich mit den Reglern (Abbildung 1 b) reduziert. Mikroskopi.......

Diskussion

Wir präsentierten Protokolle für die Bewertung der Hypopigmentation Aktivität der Testverbindungen mit kultivierten Melanozyten. Die repräsentativen Ergebnisse zeigten die Hypopigmentation Wirkung von Arbutin, ein Tyrosinase-Inhibitoren, die Tyrosinase-Aktivität und zellulären Melanin Inhalt gehemmt. Diese Methoden sind in der Anti-Melanogenic Aktivität Forschung verbreitet. Mit diesen Tests, haben wir auch erfolgreich identifiziert mehrere bioaktive Substanzen, die Melanogenese hemmende Effekte auf B16F10 Zellen in der .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
3,4-Dihydroxy-l-phenylalanin	Sigma	D9628
Ammoniumhydroxidlösung	Sigma	#320145
Arbutin	Fluka	# 10960
DMEM	HyClone	SH30243.01
FBS	HyClone	SH30084.03
Formalin	Yakuri Pure Chemicals	# 16223	37%
Goldchlorid	American MasterTech	AHG0226	0,10%
HCl	Samchun Chemikalie	H0255
KCl	Bio basic Canada Inc.	PB0440
KH2PO4	Sigma	#60218
Na2HPO4	J.T.Baker	#3817-01
NaCl	Duksan pure chemicals	#81
NaOH	Sigma	655104
Nuclear fast red	Merck	100121	Nuclear fast red 0,1% in 5% Aluminium Sulfat.
Penicillin und Streptomycin-Lösung	HyClone	SV30010
Silbernitrat	Duksan Pure Chemicals	#900
Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)	J.T. Baker	#3817-01
Natriumphosphat monobasisch (Na2HPO4)	Sigma	S5011
Natriumthiosulfat-Pentahydrat	Duksan Pure Chemicals	#2163
Tris(hydroxymethyl)aminomethan	Bio Basic Kanada	TB0196
Triton X-100	Union Carbide	T8787
Tyrosinase aus Pilz	Sigma	T3824	25 KU