Saccharomyces cerevisiae Exponentielles Wachstum Kinetik in Batch-Kultur, Atem- und fermentativen Stoffwechsel analysieren

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die Atemwege und fermentativen Stoffwechsel durch den Einbau des exponentiellen Wachstums von Saccharomyces Cerevisiae exponentielles Wachstum Gleichung zu schätzen. Berechnung der kinetischen Parameter kann für das Screening der Einflüsse der Stoffe/Verbindungen auf Gärung oder mitochondriale Atmung.

Zusammenfassung

Saccharomyces Cerevisiae Zellen in der exponentiellen Phase unterstützen ihr Wachstum durch die Produktion von ATP durch Gärung und/oder mitochondriale Atmung. Der vergärbaren Kohlenstoffgehalt regelt vor allem, wie die Hefezellen ATP erzeugen; so treibt die Variation in vergärbare Kohlenhydrate Ebenen den Energiestoffwechsel von S. Cerevisiae. Dieses Whitepaper beschreibt eine Hochdurchsatz-Methode basiert auf exponentielle Hefe Wachstum, die Auswirkungen von Änderungen der Konzentration und Art der Kohlenstoffquelle auf Atemwege und fermentativen Stoffwechsel zu schätzen. Das Wachstum von S. Cerevisiae ist in einer Mikrotestplatte gemessen oder geschüttelt konischen Kolben durch die Bestimmung der optischen Dichte (OD) bei 600 nm. Dann baut eine Wachstumskurve durch Plotten OD im Vergleich zur Zeit, was ermöglicht die Erkennung und Auswahl der exponentiellen Phase und ist ausgestattet mit der exponentiellen Wachstums-Gleichung, kinetische Parameter zu erhalten. Geringen spezifischen Wachstumsraten mit höheren Verdoppelung Zeit repräsentieren in der Regel eine respiratorische Wachstum. Im Gegensatz dazu zeigen höhere spezifische Wachstumsraten mit niedrigeren Verdoppelung Mal fermentative Wachstum. Grenzwerte der Verdoppelung der Zeit und spezifischen Wachstumsrate sind anhand der bekannteste Atem- oder fermentative Bedingungen wie nicht vergärbaren Kohlenstoffquellen oder höhere Konzentrationen an vergärbaren Zucker geschätzt. Dies ist für jede spezifische Belastung erreicht. Schließlich sind die berechneten kinetischen Parameter gegenüber der Schwellenwerte um festzustellen, ob die Hefe fermentative und/oder Atemwege Wachstum zeigt. Der Vorteil dieser Methode ist die relative Einfachheit für das Verständnis der Auswirkungen einer Substanz/Verbindung auf fermentative oder respiratorischen Stoffwechsel. Es ist wichtig, hervorzuheben, dass das Wachstum eines komplizierten und komplexen biologischen Verfahrens; vorläufige Daten aus dieser Methode müssen daher durch die Quantifizierung der Sauerstoffverbrauch und Akkumulation von Gärreste erhärtet werden. Dabei kann diese Technik als eine Vorauswahl von Verbindungen/Substanzen verwendet werden, die möglicherweise stören oder fermentativer oder respiratorischen Stoffwechsel.

Einleitung

Saccharomyces Cerevisiae Wachstum diente als ein wertvolles Werkzeug, Dutzende von physiologischen und molekularen Mechanismen zu identifizieren. Wachstum wird hauptsächlich durch drei Methoden gemessen: Verdünnungsreihen für Stichproben, koloniebildenden Stückzählen und Wachstumskurven. Diese Techniken können allein oder in Kombination mit einer Vielzahl von Substraten, Umweltbedingungen, Mutanten und Chemikalien verwendet werden, um konkrete Antworten oder Phänotypen zu untersuchen.

Mitochondriale Atmung ist ein biologischer Prozess, in dem Wachstum Kinetik erfolgreich angewendet wurde für die Entdeckung unbekannter Mechanismen. ....

Protokoll

(1) Kultur, Medien und Inokulum Vorbereitung

1. 100 mL 2 % Hefe-Extrakt-Pepton-Traubenzucker (YPD) flüssigen Medium vorbereiten (1 g Hefe-Extrakt, Kasein Pepton, 2 g und 2 g Glucose in 100 mL destilliertem Wasser hinzufügen). 3 mL der Medien in 15 mL sterilisierbare konische Rohre zu verzichten. Autoklaven der Medien für 15 min bei 121 ° C und 1,5 Psi.
   Hinweis: Der Datenträger kann bis zu einem Monat bei 4 – 8 ° c aufbewahrt werden
2. Impfen Sie eine konische Rohr gefüllt mit 3 mL cool steril 2 % YPD Brühe mit 250 μL von S. Cerevisiae Zellen erhalten in Glycerin bei-20 ° C. Über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 30 ° C unter Rühren bei 200 ....

Ergebnisse

Wachstumskurven lässt sich vorläufig zwischen Atem- und fermentative Phänotypen in der Hefe S. Cerevisiae zu unterscheiden. Daher führten wir Batch Kulturen von S. Cerevisiae (BY4742) mit verschiedenen Glukosekonzentration, die fermentative Wachstum induzieren gemeldet wurden: 1 %, 2 % und 10 % (w/V)⁹. Zeigt einen fermentativen Phänotyp Kulturen haben eine kleine Verzögerung und eine exponentielle Phase mit einer hohen Wachstumsrate (

Diskussion

Eine lange Zeit ist vergangen, seit J. Monod¹⁰ zum Ausdruck gebracht, dass die Untersuchung des Wachstums von Bakterienkulturen die grundlegende Methode der Mikrobiologie. Das Aufkommen der Molekulare Werkzeuge verzögert die Nutzung und das Studium des Wachstums als eine Technik. Trotz der Komplexität des Wachstums die zahlreichen miteinander verbundenen Prozesse umfasst, können die zugrunde liegenden Mechanismen mithilfe mathematischer Modelle¹¹beschrieben werden. Dies ist.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Orbitalschüttler	Thermo Scientific	4353	Für die Inkubation von Inokulum oder konische Fask-Kulturen
Bioscreen	Wachstumskurven	C MBR	Für Batch-Kulturen in Mikrotiterplatten
Glucose	Sigma	G7021	Für die Zubereitung von YPD-Brühe
Pepton aus Kasein, enzymatischer Aufschluss	Sigma	82303	Für die Zubereitung von YPD-Brühe
Hefeextrakt	Sigma	09182-1KG-F	Für die Zubereitung von YPD-Brühe
Bakteriologischer Agar	Sigma	A5306	Für die Zubereitung von YPD-Agar
NaH2PO4	Sigma	S8282	Für die Zubereitung von SC-Brühen
(NH4)2SO4	Sigma	A4418	Für die Zubereitung von SC-Brühe
Hefestickstoffbasis ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat	Sigma	Y1251	Für die Zubereitung von SC-Brühe
Hefe synthetisches Drop-Out-Medium Ergänzungen	Sigma	Y1501	Für die Zubereitung von SC-Brühe
Ammoniumsulfat granulat	J.T. Baker	0792-R	Für mittlere Supplementierung Beispiel
Resveratrol	Sigma	R5010	Für mittlere Supplementierung Beispiel
Galactose	Sigma	G8270	Für mittlere Supplementierung Beispiel
Saccharose	Sigma	S7903	Beispiel für eine mittlere Supplementierung
Absolut ethanol	Merck	107017	Beispiel für eine mittlere Supplementierung
Glycerol	J.T. Baker	2136-01	Beispiel für eine mittlere Supplementierung
GraphPad Prism	GraphPad Software		Für die Datenanalyse
Waben-Mikrotiterplatten	Thermo Scientific	9502550	Für Mikrotiterplattenkulturen