Summary
É apresentado aqui um protocolo útil para a fixação do pulmão que cria uma condição estável para a avaliação histológica de espécimes do pulmão de um modelo do rato do enfisema. A vantagem principal deste modelo é que pode fixar muitos pulmões com a mesma pressão constante sem colapso ou deflação do pulmão.
Abstract
O enfisema é uma característica significativa da doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC). Os estudos que envolvem um modelo emphysematous do rato exigem a fixação óptima do pulmão para produzir espécimes histológicos de confiança do pulmão. Devido à natureza da composição estrutural do pulmão, que consiste em grande parte de ar e tecido, há um risco de que ela desmorona ou desestica durante o processo de fixação. Existem vários métodos de fixação pulmonar, cada um dos quais tem suas próprias vantagens e desvantagens. O método de fixação pulmonar aqui apresentado utiliza pressão constante para possibilitar a avaliação tecidual ideal para estudos utilizando um modelo de pulmão de camundongo emphysematoso. A principal vantagem é que ele pode corrigir muitos pulmões com a mesma condição de uma só vez. Os espécimes pulmonares são obtidos de camundongos crônicos expostos ao fumo do cigarro. A fixação pulmonar é realizada por meio de equipamentos especializados que possibilitam a produção de pressão constante. Esta pressão constante mantem o pulmão em um estado razoavelmente inflado. Assim, este método gera um espécime histológico do pulmão que é adequado para avaliar o enfisema leve induzido por fumaça de cigarro.
Introduction
A DPOC é uma das principais causas mundiais de óbito1. A fumaça do cigarro é a causa mais importante da DPOC, mas os mecanismos de patogênese permanecem incompletamente definidos. A DPOC demonstra duas características principais, incluindo a limitação progressiva do fluxo aéreo e uma resposta inflamatória anormal do pulmão. A desordem emphysematous ocorre freqüentemente nos pulmões de pacientes de DPOC2. Os achados patológicos do enfisema são caracterizados pela destruição da parede alveolar3. Várias espécies animais têm sido utilizadas para gerar modelos de DPOC in vivo (ou seja, cães, cobaias, macacos e roedores)4. No entanto, o mouse se tornou o mais comumente usado na construção de modelos de DPOC. Isso tem muitas vantagens, incluindo seu baixo custo, capacidade de ser geneticamente modificada, extensa disponibilidade de informação genômica, disponibilidade de anticorpos e capacidade de usar uma variedade de cepas de mouse5. Presentemente, não há nenhum modelo do rato que possa imitar as características cheias da DPOC humana; assim, os pesquisadores individuais devem escolher qual modelo é mais adequado para a pesquisa específica de DPOC6. O modelo do rato emphysematous é um de muitos modelos do rato de DPOC que estão atualmente disponíveis. Modelos adicionais incluem o modelo de exacerbação do camundongo, modelo de comorbidades sistêmicas e modelo de suscetibilidade à DPOC7.
O modelo emphysematous do rato pode ser gerado por diversos tipos de agentes exógenos, incluindo agentes químicos e exposição do fumo do cigarro4. A exposição química (por exemplo, a elastase) produz um tipo severo de enfisema, enquanto o fumo do cigarro resulta em enfisema leve8,9. Acredita-se que a fumaça do cigarro seja a principal causa para a patogênese da DPOC; Portanto, a escolha da fumaça do cigarro como um meio para criar um modelo de mouse de DPOC é razoável10. Muitos estudos usaram fumaça de cigarro para criar enfisema no mouse. Por exemplo, Nikula et al. criaram com sucesso um modelo emphysematous do rato de B6C3F1 ratos fêmeas expondo os à fumaça de cigarro por 7 ou 13 meses11. Nós igualmente estabelecemos um modelo emphysematous do rato através do marcador da senescência protein/SMP-30 ratos de KO12. É crucial executar um método da fixação do pulmão que possa corretamente Visualizar este modelo suave do enfisema pela exposição do fumo do cigarro.
Vários métodos para fixação pulmonar foram estabelecidos13. No entanto, não há nenhum método padrão-ouro de fixação do tecido pulmonar para avaliação do enfisema14. Vários estudos deste laboratório mostraram que o sistema de fixação aqui apresentado é útil ao criar uma condição estável para avaliar o enfisema12,15,16,17,18. A vantagem principal do sistema atual é que pode fixar muitos pulmões com a mesma circunstância em uma vez sem colapso ou deflação do pulmão. O sistema atual da fixação do pulmão usa algum equipamento especial que permita que os espécimes do pulmão sejam inflados em uma pressão constante apropriada por um período dado. Este equipamento especial consiste em três porções, incluindo um recipiente mais baixo, um recipiente superior, e uma bomba. Os espécimes pulmonares são colocados no recipiente inferior que está conectado a agentes de fixação pressurizados, resultando em uma diferença de pressão de 25 cmH2o no nível de agentes entre os recipientes superior e inferior19.
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Protocol
Os seguintes métodos foram aprovados pelos comitês de cuidados e uso de animais da faculdade de medicina da Universidade Juntendo. As directrizes para a conduta apropriada de experimentos animais, Conselho da ciência de Japão, junho 1, 2006 foram seguidas. Existem três etapas principais neste método: 1) dissecção do camundongo, 2) exsanguinação pulmonar e 3) fixação de tecidos pulmonares assistidos por equipamentos especializados. Tipicamente, os espécimes do pulmão são processados ao Embebimento após 48 h da fixação12,15,16,17,18.
1. dissecção do rato
- Meça o peso de corpo do rato, a seguir determine a quantidade de pentobarbital a administrar.
- Injete pentobarbital via intraperitoneal em uma dosagem de 70 MGS/quilograma do peso corporal e confirme a anestesia pela ausência de reação à pitada do dedo do pé.
- Injete a agulha em um ângulo de 45 ° até que penetre a pele e o músculo. Desenhe o êmbolo e confirme um vácuo de ar e, em seguida, injete o pentobarbital.
- Confirme a anestesia pela ausência de movimento reflexo.
Nota: usar o rato anestesiado em oposição a um rato eutanasiado é recomendado para a exsanguinação total do pulmão. - Corte a pele do rato e o músculo abdominal na linha medial, visando a área cefólica.
- Corte lateralmente para fornecer um espaço de trabalho mais largo.
2. exsanguinação pulmonar
- Exponha a camada de diafragma e perfure-a com fórceps.
- Abra o espaço torácico e corte a área esternal, permitindo que os pulmões e o coração sejam vistos claramente.
- Corte o coração no átrio esquerdo e no ventrículo direito.
- Inserir uma cânula (24 G) na área do ventrículo direito e direcioná-la para a área cefólica até atingir a artéria pulmonar, como mostra a Figura 1.
- Gire sobre a bomba e permita que o 1x fosfato-tampão salino (PBS) circule (aproximadamente 200 mL/h) até que todo o tecido do pulmão mude a uma cor branca.
3. fixação do tecido pulmonar
- Retire a traquéia, pulmões e coração.
- Libertar todos os três órgãos cortando os tecidos conjuntivos circundantes.
- Amarre o brônquio principal direito com um fio de sutura e corte todos os lóbulos do pulmão direito.
- (Opcional): os lóbulos do pulmão direito consistem em quatro partes. Corte estas peças do brônquio principal direito e divida as peças para processamento como amostras de tecido congelado.
- Insira o coração e os lóbulos do pulmão esquerdo em agentes de fixação, localizados dentro de uma seringa de 10 mL.
PRECAUÇÃO: os agentes de fixação são perigosos. Use equipamento de proteção adequado (por exemplo, luvas de borracha longas) e trabalhe em um quarto bem ventilado. - Criar uma condição de vácuo usando uma seringa de 10 mL para inflar o pulmão, como mostrado na Figura 2.
- Inserir uma cânula (20 G) na traquéia e amarrar um nó.
- Inflar o pulmão com agentes de fixação para verificar com vazamentos, usando uma seringa de 1 mL.
- Transferência para equipamento de pressão de fixação pulmonar, conforme ilustrado na Figura 3.
- Após períodos de fixação, retire a amostra de pulmão que amarra a traquéia com um nó.
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Representative Results
Conforme descrito anteriormente, o equipamento especializado, que gera pressão constante estendida, pode ser dividido em três partes (Figura 3A). A parte inferior é o ponto no qual se insere a amostra pulmonar (Figura 4a). O pulmão é conectado através de uma cânula (20 G) à ponta do fluxo de formalina usando um galo de parada de três vias (Figura 4B). A pressão é gerada a partir dos diferentes níveis de superfície dos agentes de fixação entre os recipientes inferior e superior (Figura 5). A diferença de pressão é de 25 cmH2o; no entanto, usando o botão de ajuste de altura, a pressão pode ser ajustada dentro da faixa de 25 – 30 cmH2o (Figura 5). Uma bomba conecta os recipientes inferiores e superiores através dos tubos (Figura 3a), preservando uma diferença de 25 cm na altura de superfície do agente de fixação. A direção do fluxo do agente é descrita na Figura 3B.
Apresentado em seguida é um resultado representativo de achados histológicos no pulmão, seguindo 48 h de fixação. Os camundongos masculinos de seis meses de idade SMP30-KO foram expostos a fumaça de cigarro ou ar fresco (como controle) por 8 semanas. Ambos os espécimes do tecido foram manchados com hematoxilina e eosina. Figura 6 A mostra achados histológicos dos camundongos expostos ao ar, que não apresentaram ampliação marcada do espaço aéreo. Em contrapartida, a Figura 6B revela aumento significativo do espaço aéreo e destruição da parede alveolar em camundongos expostos à fumaça crônica do cigarro.
A média de interceptos lineares (MLI) foi determinada de acordo com o método descrito por Thurlbeck et al. 20 para acessar o tamanho do espaço aéreo. O índice destrutivo (DI) foi determinado para avaliar a destruição da parede alveolar de acordo com o método descrito por Saetta et al. 21. estes exames morfométricos do espécime pulmonar REVELARAM que di e MLI foram significativamente maiores nos camundongos SMP30-ko expostos ao fumo do que nos camundongos expostos ao ar (Figura 6C, D).
Figura 1: exsanguinação pulmonar. Uma cânula foi inserida no local do ventrículo direito e direcionada para a artéria pulmonar. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: inflação do pulmão da seringa de vácuo. Condição de vácuo dentro da seringa de 10 mL contendo agentes de fixação para inflar os pulmões. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: equipamento de fixação pulmonar. (A) o equipamento acrílico permitiu uma diferença de pressão de 25 cmH2o para inflar os pulmões continuamente para 48 h, utilizando uma máquina da bomba. (B) a direção do fluxo do agente de fixação é indicada por setas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: recipiente inferior. (A) o espécime do pulmão do rato foi posicionado dentro dos agentes de fixação no recipiente mais baixo. (B) dentro do recipiente mais baixo, há uma caixa da colocação da amostra, na parte superior de que o formalina flui através de uma torneira de três vias e da cânula. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: botão de ajuste superior do recipiente e da altura. O recipiente superior gerou uma pressão de 25 cmH2o. Há dois pares de botões de ajuste de altura que podem ser usados para ajustar a altura do recipiente superior; em conseqüência, a pressão que é gerada pode ser ajustada dentro da escala de 25 – 30 cmH2o. estale por favor aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: achados histológicos e morfométricos do pulmão do camundongo. Imagens histologic representativas de seções do pulmão do cigarro de 8 semanas fumo-expor ou camundongos SMP30-KO ar-expor (6 mês-velho, macho), manchado com hematoxylin-eosina. Barra de escala = 100 μm. (A) o grupo exposto ao ar não demonstrou aumento significativo ou outros achados. (B) o grupo exposto à fumaça de cigarro mostrou aumento acentuado do espaço aéreo e destruição da parede alveolar. (C) as Interceptas lineares médias (MLI). Nos pulmões de camundongos expostos ao fumo do cigarro, a MLI foi significativamente maior do que os camundongos expostos ao ar (* p < 0, 1). (D) o índice destrutivo (di). Nos pulmões de camundongos expostos ao fumo do cigarro, o DI foi significativamente aumentado em comparação com os pulmões de camundongos expostos ao ar (* p < 0, 1). Os valores são apresentados como média ± DP (n = 6 para cada grupo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O procedimento de fixação para os pulmões de roedores aqui apresentados não é novidade; no entanto, este sistema tem várias vantagens. Em primeiro lugar, pode fixar muitos pulmões (máximo de 20) com a mesma condição de uma só vez. A sociedade de patologia toxicológica afirma que a pressão para a instilação da gravidade varia de 22 – 25 cmH2O22. Notavelmente, vários estudos têm realizado fixação pulmonar a uma pressão de 25 cmH2O13,19,23,24,25,26,27 , que foi adotado em nosso laboratório utilizando o sistema atual12,15,16,17,18.
Em segundo lugar, pode fixar os tecidos pulmonares a uma pressão constante por vários períodos de tempo. Em nosso laboratório, as amostras pulmonares são geralmente fixadas para 48 h. Muitos investigadores usam um período relativamente curto de tempo (por exemplo, 5 – 20 min)13,28,29,30,31,32, em seguida, amarrar o pulmão inflado e mergulhar em formalina por períodos prolongados, conforme pretendido. Não há dados ou pesquisas que indiquem um padrão-ouro para o comprimento da duração da fixação pulmonar. No entanto, a afirmação da sociedade americana de tórax (ATS)/sociedade respiratória Européia (ERS) descreve o "padrão prata", no qual a pressão de inflação da via aérea deve ser mantida por pelo menos 24 h14. A sociedade japonesa de patologia também recomendou tempos de fixação de não mais de 1 semana para produzir lâminas imuno-histoquímicas consistentes; embora, sua recomendação é baseada na análise usando espécimes humanos33. Períodos de tempo de fixação relativamente curtos podem não ser aplicáveis ao sistema atual, pois cada amostra deve ser colocada individualmente no recipiente inferior. Esta é uma limitação do sistema atual. Em conclusão, o tempo apropriado para a fixação do pulmão do rato permanece desconhecido.
As etapas críticas neste método estão relacionadas ao risco de vazamento de formalina pulmonar durante o processo de fixação de formalina. O escapamento do formalina do pulmão pode causar o encolhimento do tamanho do pulmão. Este risco pode ser dividido em duas partes. A primeira parte ocorre durante a etapa de sacrifício. Ao abrir a gaiola torácica, é importante não causar ferimento à superfície do pulmão. A chave para a prevenção é abordar isso a partir do diafragma e continuar a cortar a gaiola torácica após o pulmão é destacado da pleura parietal. Este método evita lesões pulmonares causadas por equipamentos cirúrgicos. Uma outra etapa chave ocorre ao amarrar o brônquio principal direito. É importante identificar quais são os lóbulos direito do rato. Coloc os pulmões em uma posição onde possam ser vistos de uma vista dorsal permite a identificação mais fácil da posição dos pulmões.
A segunda parte é durante o processo da fixação do pulmão usando o equipamento especializado. Uma etapa crítica ocorre ao inserir o espécime do pulmão no porto do formalina do recipiente mais baixo. Deve-se confirmar que a inserção é firmemente fixada para impedir o destacamento do espécime do pulmão do porto do formalina durante o processo constante da pressurização. Outro aspecto a destacar é a conexão da tubulação entre as três partes do equipamento especializado (recipiente inferior, recipiente superior e bomba). Todas as ligações do tubo devem ser firmemente conectadas. Se ocorrer vazamento, o volume de formalina no recipiente superior diminuirá, reduzindo assim a pressão constante.
De acordo com as recomendações da sociedade de patologia toxicológica, a instilação intratraqueal da formalina tem vantagens para o modelo de pulmão de roedores, que prevalece sobre suas desvantagens22. Sugeriram o uso de um método intratraqueal da fixação do formalina ao executar estudos quantitativos da morfometria alveolar do pulmão. A instilação pulmonar intratraqueal tem duas vantagens, incluindo a preservação das vias aéreas e da parede alveolar, bem como a visualização do parênquima pulmonar22. Um estudo realizado por Braber et al. revelou que o método de instilação intratraqueal de formalina é superior em termos de preservação da estrutura pulmonar quando comparado com a inflação do vácuo e os métodos de perfusão do corpo inteiro13. O método atual utiliza instilação intratraqueal em um modelo de mouse para otimizar a visualização da área alveolar.
Em relação aos agentes de fixação, a formalina a 10%, que contém formaldeído, é convencionalmente utilizada. O formaldehyde é amplamente utilizado como um agente de fixação para investigações imunopatológicas porque não destrói completamente a imunogenicidade da proteína. No entanto, a declaração ATS/ERS não recomenda a fixação de formalina, pois não estabiliza adequadamente a estrutura do tecido14. O glutaraldeído é recomendado para a instilação das vias aéreas em vez disso; Entretanto, é sujeito para destruir a imunogenicidade da proteína, que conduz a um agente de fixação inadequado para immunohistochemistry. Várias evidências relataram que os pulmões fixos podem ser fornecidos para avaliação morfométrica (por exemplo, interceptos lineares médios, área superficial interna e índice destrutivo) após fixação de formalina utilizando o sistema de fixação atual12 , 15 anos de , 16 anos de , 17 anos de , 18. certamente, o glutaraldeído pode ser adotado para o sistema atual; assim, os pesquisadores podem escolher os dois agentes no sistema atual de acordo com as necessidades experimentais.
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Disclosures
Os autores não têm interesses concorrentes para declarar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pelo JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) e pelo Instituto de medicina ambiental e de gênero, faculdade de medicina da Universidade de Juntendo, Grant Number E2920 (T. Sato). O financiador não teve nenhum papel no desenho dos métodos atuais e na escrita do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin (formalin neutral buffer solution) | Wako | 060-01667 | |
| Bent forceps | Hammacher | HSC187-11 | |
| Cannula, size 20G | Terumo | SR-FS2032 | |
| Cannula, size 22G | Terumo | SR-OT2225C | Cannula to exsanguinate lung |
| Forceps | Hammacher | HSC184-10 | |
| Kimtowel | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 61000 | |
| Kimwipe | Nippon Paper Crecia (Kimberly Clark) | 62011 | |
| Lower container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
| Roller pump | Nissin Scientific Corp | NRP-75 | Pump machine to exsanguinate lung |
| Roller pump RP-2000 | Eyela (Tokyo Rikakikai Co. Ltd) | 160200 | Pressure equipment pump |
| Silicone tube Ø 9 mm | Sansyo | 94-0479 | Pressure equipment component |
| Somnopentyl (64.8 mg/mL) | Kyoritsu Seiyaku | SOM02-YA1312 | Pentobarbital Sodium |
| Surgical scissor | Hammacher | HSB014-11 | |
| Suture thread, size 0 | Nescosuture | GA01SW | |
| Syringe, 1 mL | Terumo | SS-01T | |
| Syringe, 1 ml with needle | Terumo | SS-01T2613S | |
| Syringe, 10 mL | Terumo | SS-10ESZ | |
| Three-way stopcock | Terumo | TS-TR1K01 | |
| Upper container (acrylic glass material) | Tokyo Science | Custom-made | Pressure equipment component |
References
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