Neutrophilenzahl extrazelluläre fallen durch geringe Dichte Neutrophilen erzeugt gewonnenen Peritoneal Lavage Fluid vermitteln Tumor Zellwachstum und Anlage

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode in der menschlichen Low-Density Neutrophilen (LDN), erholte sich von postoperativen peritoneal Lavage Fluid, produzieren massive Neutrophilenzahl extrazelluläre Traps (NETs) und effizient trap freie Tumorzellen, die anschließend wachsen.

Zusammenfassung

Aktiviert neutrophile Release Neutrophilen extrazelluläre fallen (Netze), die erfassen und Mikroben vernichten können. Neuere Studien legen nahe, dass verschiedene Krankheitsprozesse, wie z. B. Autoimmun-Krankheit, Thrombose und Tumor Metastasen Netze beteiligt sind. Hier zeigen wir eine detaillierte in-Vitro -Technik, um NET Aktivität während das Abfangen von freien Tumorzellen erkennen, die nach Bindung an Netze wachsen. Zunächst sammelten wir niedrige Dichte Neutrophilen (LDN) von postoperativen peritoneal Lavage Fluid von Patienten, die Laparatomien unterzogen. Kurzfristiger Kultivierung von LDN führte zu massiven NET Formation, die mit nuklearen grün fluoreszierende und Chromosom gegenfärbung visualisiert wurde. Nach der Co Inkubation des menschlichen Magen-Krebs-Zell-Linien MKN45, OCUM-1 und NUGC-4 mit den Netzen wurden viele Tumorzellen durch die Netze gefangen. Anschließend die Anlage wurde komplett aufgehoben durch den Abbau von Netzen mit DNase I. Time-lapse Video zeigte, dass Tumorzellen gefangen durch die Netze nicht sterben aber stattdessen wuchs kräftig in einer kontinuierlichen Kultur. Diese Methoden können für die Erkennung von Klebstoff Interaktionen zwischen Netzen und verschiedene Arten von Zellen und Materialien angewendet werden.

Einleitung

Polymorphen nuklearen Neutrophilen im Blut zirkulierenden sind in der Regel durch die Art der Dichte-Gradienten Zubereitung von mononukleären Zellen getrennt. Allerdings sind einige Neutrophilen bekannt als Low-Density Neutrophilen (LDN), mit CD11b(+), CD15(+), CD16(+) und CD14(-) Phänotypen, Co gereinigten mit mononukleären Zellen. Die relative Anzahl der LDN erhöht in verschiedenen pathologischen Bedingungen einschließlich Autoimmunerkrankungen^1,2, Sepsis³und Krebs^4,5. Frühere Studien haben gezeigt, dass LDN eine phänotypisch ....

Protokoll

LDN wurden Patienten in dieser Studie entnommen und durch die institutionelle Review Board der Jichi Medizinische Universität angenommen wurden.

1. Isolierung von LDN aus Bauchhöhle Lavages und NET Detection

1. Probe-Übernahme
   1. Die Infusion 1.000 mL normale sterile Kochsalzlösung direkt in die Bauchhöhle vor Wundverschluss bei Patienten, die aufgrund von Magen-Darm-Malignität Bauch operiert wurden.
      Hinweis: Proben stammen von Patienten, die eine Gastrektomie, Colectomy oder Ösophagektomie ohne Vorurteile basierend auf Alter oder Geschlecht unterzogen. Kochsalzlösung wurde in einen Behälter überführt und innerhalb einer Minu....

Ergebnisse

In der 2-Stunden-Kultur CD66b(+) LDN peritoneal Lavage Fluid angezeigte Zeichenfolge Strukturen abgeleitet gebeizt mit grün fluoreszierenden Farbstoff für nukleare und Chromosom (Abbildung 1 b), während CD66b(-) MONONUKLEÄRE Zellen nicht (Abbildung 1). Jedoch wenn die LDN-Kulturen mit vorbehandelt wurden 100 U/mL DNase I, die charakteristische Architektur wurde zerstört (Abbildung 1), darauf hinweist.......

Diskussion

Frühere Studien haben berichtet, dass die zirkulierenden Tumorzellen durch NET Substrate in Vivo^10,11gefangen werden kann. Metastasierendem Brustkrebs-Zellen nachweislich zu stimulieren Neutrophilen und induzieren die Bildung von Netzen, die Zelle Tumorwachstum in die Ziel-Organ-¹⁷unterstützt. Darüber hinaus fanden wir, dass kurzfristige Kulturen von LDN aus postoperative Lavage Fluid massive Netze hergestellt, die effizient Tumor.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare, SCHWEDEN	17-1440-02
StraightFrom™ Vollblut CD66b Mikrobeads	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland	130-104-913
Fc-Block	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland	130-059-901
MACS Spüllösung	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland	130-091-222
MACS BSA Stammlösung	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland	130-091-376
LS Säulen	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland	130-041-306
MACS Magnetabscheider	Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland	130-042-501
SYTOX grüne Nukleinsäurefärbung 5mM Lösung in DMSO	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S7020
PKH26 Rot fluoreszierendes Zellverbinder-Kit für die allgemeine Zellmembranmarkierung	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P9691
Verdünnungsmittel C	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	CGLDIL RPMI1640
Medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	R8758
Dulbecco' s Modifizierter Eagle Mittlerer bis hoher Glukosegehalt (DMEM)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D5796
Dulbecco' s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	D8537
0,5 mol/l-EDTA-Lösung (pH 8,0)	nacalai tesque, Japan	06894-14
Fötales Rinderserum, qualifiziert, USDA-zugelassene Regionen	gibco by life technologies, Mexiko	10437-028
Rinderserum Albumin lyophilisiertes Pulver, ≥ 96% (Agarose-Gelelektrophorese)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A2153
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Japan	15140-122
Plasmocin Prophylaxe	InvivoGen, San Diego, CA-USA	ant-mpp
DNase I	Worthington, Lakewood NJ)	LS002138
Poly-L-Lysin-beschichtete MIKROPLATTE 6Well	IWAKI, Japan	4810-040
Poly-L-Lysin-beschichtete MIKROPLATTE 24Well	IWAKI, Japan	4820-040
Fluoreszein-Stereomikroskop	BX8000, Keyence, Osaka, Japan	BZ-X710
Ganzbild-Zellbeobachtungssystem	Nikon, Kanagawa, Japan	BioStudio (BS-M10)
MKN45 humane Magenkrebszelllinie	Riken, Tukuba Japan	N/A
NUGC-4 humane Magenkrebs-Zelllinie	Riken, Tukuba Japan	N/A
OCUM-1 humane Magenkrebs-Zelllinie	Osaka City University, Japan	N/A	Geschenk von Dr. M.Yashiro