Methodenartikel

Dynamische Adhäsion Assay für die funktionelle Analyse von Anti-Adhäsion Therapien bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen

DOI:

10.3791/58210

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20. September 2018

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1Department of Medicine 1, University of Erlangen-Nuremberg

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dynamische Adhäsion von Immunzellen, die Gefäßwand ist eine Voraussetzung für Darm-Homing. Hier präsentieren wir ein Protokoll für einen funktionellen in Vitro Assay für die Impact-Analyse der Antikörper Anti-Integrin, Chemokine oder andere Faktoren auf die dynamische Zelladhäsion von menschlichen Zellen mit Bearbeit-beschichteten Kapillaren.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Darm-Homing von Immunzellen ist wichtig für die Pathogenese der entzündlichen Darmerkrankungen (IBD). Integrin-abhängige Zelladhäsion, Addressins ist ein entscheidender Schritt in diesem Prozess und therapeutische Strategien stören Adhäsion haben erfolgreich etabliert. Der Anti-α4β7 Integrin Antikörper, Vedolizumab, dient der klinischen Behandlung von Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) und weitere Verbindungen sind wahrscheinlich folgen.

Die Einzelheiten des Verfahrens Adhäsion und Wirkungsmechanismen von Anti-Integrin-Antikörper sind in vielerlei Hinsicht aufgrund der begrenzten verfügbaren Techniken für die funktionelle Forschung in diesem Bereich noch unklar.

Hier präsentieren wir Ihnen eine dynamische Adhäsion-Assay für die funktionelle Analyse der menschlichen Zelle Adhäsion unter Strömungsverhältnisse und die Auswirkungen der Anti-Integrin-Therapien im Rahmen der IBD. Es basiert auf die Perfusion der primären humanen Zellen durch Bearbeit-beschichtete ultradünnen Glaskapillaren mit mikroskopischen Analysen in Echtzeit. Der Test bietet eine Vielzahl von Möglichkeiten für Verbesserungen und Modifikationen und Potenziale für die mechanistischen Entdeckungen und Translationale Anwendungen hält.

Einleitung

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Zelle Bewegung ist ein streng regulierten Prozess unverzichtbar für die Entwicklung und Funktion der mehrzelligen Organismen, sondern ist auch in der Pathogenese zahlreicher Erkrankungen1verwickelt. Homing Prozess der Immunzellen aus dem Blutstrom zu den peripheren Geweben hat vor kurzem, zunehmende Aufmerksamkeit gewonnen, da sie Nachschub und Ausbau der pathogene Zellen in entzündetem Gewebe bei immunologisch vermittelten Erkrankungen2 fördert ,3. Referenzfahrt ist insbesondere nachweislich, translationale Relevanz bei entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) zu haben. Die therapeutische Anti-α4β7 Integrin Antikörper Vedolizumab Darm referenzieren stören hat Wirksamkeit gezeigt, in großen klinischen Studien4,5 und erfolgreich eingesetzt in der klinischen Praxis6,7 , 8. weitere Verbindungen sind wahrscheinlich9,10folgen. Ebenso ist der therapeutische Anti-α4-Integrin-Antikörper, Natalizumab, zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS)11verwendet.

Unsere funktionalen Verständnis des homing-Prozesses im allgemeinen und der Mechanismus der Wirkung solcher therapeutischer Antikörper ist insbesondere jedoch nach wie vor begrenzt. Es ist allgemein bekannt, dass Homing aus mehreren Schritten besteht, einschließlich der Zelle tethering und Walzen mit nachfolgenden Zelladhäsion, zur festen Festnahme gefolgt von Trans endotheliale Migration12,13. Die oben genannten Antikörper neutralisieren Integrine auf der Zelloberfläche, die Interaktion mit Addressins auf das Endothel der Gefäßwand zu verhindern. Dies ist gedacht, um feste Zelle Adhäsion14,15behindern. Allerdings sind wir erst am Anfang zu verstehen, die differenzierte Relevanz der spezifischen Integrine für Zelle Homing von eindeutigen Zelle Teilmengen. Darüber hinaus die Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörper auf verschiedenen Zelle Teilmengen und Dosis-Wirkungs-Verbände sind weitgehend unbekannt, was zu viele offene Fragen auf dem Gebiet der Darm homing und Anti-Adhäsion Therapien in IBD.

Praktische Tools für solche Fragen sind daher dringend erforderlich. Die Wirkung von Anti-Integrin-Antikörper auf Integrin-Bearbeit Interaktion ist bisher überwiegend ausgewertet worden, durch die Beurteilung verbindliche Wirksamkeit/Bindung Hemmung mit Durchflusszytometrie oder durch statische Haftung Assays16,17 ,18,19,20, also mit scheinbaren Vereinfachung und Abweichung von der physiologischen Situation. Wir hat kürzlich einen dynamischen Adhäsion-Assay Integrin-abhängige Adhäsion von menschlichen Zellen, Addressins und die Auswirkungen der Anti-Integrin-Antikörpern unter Scherbelastung2studieren. Das Prinzip der Technik wurde früher mit Maus Zellen21,22nachgewiesen. Hier wurde es angepasst und entwickelt, um die oben genannten translatorische Fragen, Eröffnung neuartige Wege zum besseren Verständnis der Mechanismen der Therapie mit Anti-Integrin Antikörper in Vivo.

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Protokoll

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In den folgenden Abschnitten beschriebenen Studien wurden nach Genehmigung der Ethikkommission der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg durchgeführt.

1. Vorbereitung der Kapillaren

  1. Verbinden Sie rechteckige Kapillaren mit den Gummischlauch durch Dehnung des Schlauchs auf der einen Seite mit einer kleinen Schere und sorgfältig Einfügen der Kapillare (ca. 0,5 cm) in die Röhre. Die Verbindung zwischen Kapillare und Schlauch mit Kunststoff Paraffin Film zu versiegeln.
  2. Beschichten die Kapillare mit 20 µL Bearbeit (rekombinante Fc Chimäre; 5 µg/mL Bearbeit, z.B. MAdCAM-1, in Beschichtung Puffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES)) oder die entsprechenden Isotype-Control-Lösung mit einer Pipette p20 (Flüssigkeit saugt sich in der Kapillare). Dann, die Seite nicht auf das Rohr mit dem Kunststoff Paraffin-Film verbunden verschließen und mindestens 1 h bei 37 ° c inkubieren Verwendung einer Kapillare gefüllt nur mit der Beschichtung-Puffer oder mit dem entsprechenden Isotype-Steuerelement als Negativkontrolle.
  3. Entfernen Sie den Kunststoff Paraffin-Film von der Spitze der Kapillare, Entleeren Sie die Beschichtung zu, indem man die Flüssigkeit Tränken aus der Kapillare auf ein Papier Handtuch und Block Kapillaren für mindestens 1 h mit 20 µL Lösung (1 X PBS mit 5 % BSA) bei 37 ° c zu blockieren Versiegeln Sie die offene Seite der Kapillare mit Kunststoff Paraffin Film. Entfernen Sie nicht die blockierende Lösung vor der Mikroskopie.

2. Handy-Isolation, Behandlung und Vorbereitung für die Mikroskopie

Hinweis: Diese Schritte können während der Inkubation Perioden notwendig für die Kapillare Vorbereitung durchgeführt werden.

  1. Sammeln Sie 18 mL Antikoagulanzien volles menschliches Blut mit einer aseptischen Blutentnahme vom cubital Ader der Freiwilligenarbeit Personen (z. B. IBD Patienten und gesunden Kontrollpersonen) nach informierte Zustimmung gemäß den Vorschriften der örtlichen Ethik-Kommission.
    Hinweis: Dieser Schritt sollte nur von geschulten und erfahrenen medizinischen Personal gemäß den nationalen und/oder lokalen Vorschriften durchgeführt werden.
  2. Füllen Sie das Blut in ein 50 mL-Tube und auf ein Volumen von 35 mL mit 1 X PBS verdünnen. Dann Unterlage die Blut-PBS-Mischung mit 10 mL der Dichte-Gradienten-Medium.
  3. Führen Sie Dichte-Gradienten-Zentrifugierung für 15 min bei 800 X g und 24 ° C ohne Bremse, Zellen zu trennen.
  4. Sammeln Sie die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) durch Absaugen der weißen Zellschicht rechts oben auf die Dichte mittlere Verlaufsebene (klare mittlere Schicht). Übertragen Sie PBMCs in einem frischen 50 mL-Tube, füllen Sie bis zu 50 mL mit 1 X PBS und Zentrifuge für 10 min bei 300 x g und 10 ° C.
  5. Den überstand verwerfen, Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL 1 X PBS und anschließend zählen Zellzahlen, z. B. durch die Verwendung einer Neubauer Zelle zählen Kammer.
  6. Optional: Zur Untersuchung der Haftung der Granulozyten führen die folgenden Schritte. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 2.7 oder 2.8.
    1. Die Granulozyten-Schicht (unterste Schicht nach der Dichte Steigung Zentrifugierung, enthält auch die Erythrozyten) zu sammeln. Zellen in 40 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. Fügen Sie dann 8 mL 6 % Dextran in 1 X PBS, vorsichtig mischen und lassen Zellen Sediment für 30 min bei Raumtemperatur.
      Hinweis: Die Erythrozyten sinkt auf den Boden des Rohres, während die Granulozyten werden in der Schwebe bleiben.
    2. Nach 30 min. Überstands sammeln, übertragen in eine frische 50 mL-Tube und Zentrifuge für 6 min bei 300 x g und 4 ° C. Den überstand verwerfen und lösen Sie die verbleibenden Erythrozyten durch Zugabe von 5 mL 0,2 % NaCl in DdH2O. Inkubation für 1 min.
    3. Geben Sie 5 mL 1,4 % NaCl in DdH2O und eine weitere Minute inkubieren. Stoppen Sie die hypotone Lyse durch Zugabe von 20 mL 1 X PBS und Zentrifuge für 6 min bei 300 X g und 4 ° C.
    4. Die Zelle Pellet in 10 mL 1 X PBS aufzuwirbeln. Dann zählen Sie Zellzahlen mithilfe einer Neubauer Zelle zählen Kammer.
  7. Optional: Um das Anhaften von PBMC Teilmengen zu studieren, zu reinigen, verschiedene Zelltypen oder Teilmengen (z. B. CD4+ und CD8+ T Zellen oder CD19+ B Zellen) mit Microbeads laut Protokoll des Herstellers oder durch Fluoreszenz-aktivierte cell sorting (FACS). Fahren Sie andernfalls mit Schritt 2,8.
  8. Zentrifugieren der Zellsuspension für 10 min bei 300 x g und 10 ° C. Verwerfen Sie den überstand und beflecken Sie Zellen mit Cell tracking Farbstoff (z. B. CFSE) entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
  9. Anschließend die Zellen für 10 min bei 300 X gZentrifugieren und überstand verwerfen. In 1 X PBS aufzuwirbeln Sie, bestimmen Sie die Anzahl von Zellen und Zentrifuge wieder für 10 min bei 300 X g.
  10. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der gefärbten Zelle Pellet in die entsprechende Menge an Haftung Puffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) um eine Suspension von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten. Fügen Sie dann den entsprechenden Betrag von 100 mM MnCl2 , eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
    Hinweis: Diese Zellen sind nun bereit für die Mikroskopie.
  11. Optional: Behandlung von Zellen mit Zytokine, Antikörper oder andere Verbindungen zu neutralisieren. Fahren Sie andernfalls mit Schritt 3.
    1. Überspringen Sie Schritt 2.10 und Aufschwemmen der gefärbten Zelle Pellet aus Schritt 2,9 in RPMI Medium (mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin), eine Konzentration von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten.
    2. Pipette 1 mL dieser Zellsuspension in möglichst viele Vertiefungen einer 48-Well-Platte, da gibt es Bedingungen analysiert werden. Bereiten Sie immer einen Brunnen mit unbehandelten Zellen durch eine unbeschichtete Kapillare als Negativkontrolle durchblutet werden und einen Brunnen mit unbehandelten Zellen durch eine Kapillare Bearbeit beschichtet als Positivkontrolle durchblutet werden.
    3. Für die Behandlung mit Anti-Integrin-Antikörpern die entsprechende Menge des Antikörpers (z.B. 10 µg/mL Vedolizumab) hinzufügen der Zellsuspension. 1 h bei 37 ° c inkubieren Fügen Sie für die Behandlung mit Zytokinen die entsprechende Menge an rekombinanten Zytokine (z. B. 10 ng/mL CXCL10 hinzu), die Zellsuspension. 5 min bei 37 ° c inkubieren
    4. Ernten Sie nach der Inkubation Zellen durch resuspending Zellen mehrmals mit Hilfe einer Pipette p1000. Übertragen Sie Zellen in einer 2 mL-Tube, mit 1 mL 1 X PBS wieder gut spülen Sie ab und fügen Sie der 2 mL Tube hinzu. Bestimmen Sie die Anzahl von Zellen.
      Hinweis: Inkubation von adhärente Zell-Populationen (z. B. Monozyten) erfordern zusätzliche Maßnahmen (z. B.., Behandlung mit Trypsin), Zellen von der Platte zu lösen.
  12. Zentrifuge Zellen für 10 min bei 300 X g bei 10 ° C. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in die entsprechende Menge an Haftung Puffer, eine Suspension von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten. Fügen Sie dann den entsprechenden Betrag von 100 mM MnCl2 , eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten. Bei Vorbehandlung mit Chemokine keine hinzu MnCl2 der Zellsuspension. Diese Zellen sind nun bereit für die Mikroskopie.
    Hinweis: Das Mindestvolumen für den Assay verwendet ist abhängig von der Pumpe und Schlauch verwendet. In dieser Studie, die mit Hilfe der peristaltischen Pumpe und den Schlauch in die Tabelle der Materialienangegeben war ein Mindestvolumen von 400 µL erforderlich. Wenn gewünscht und (je nach Zelltyp und Ertrag) Anwendung, kann die Zellkonzentration in der Suspension erhöht werden, um höhere Haftung in kürzerer Zeit zu messen.
  13. Mögliche Änderung: wettbewerbsfähige dynamische Adhäsion Assay
    1. Führen Sie die oben genannten Schritte mit verschiedenen Zell-Populationen (z. B. regulatorische und T-Effektorzellen isoliert durch magnetische Wulst Isolierung nach Anweisungen des Herstellers entsprechend Schritt 2.7) miteinander verglichen werden.
    2. Färben Sie jedes Volk mit einem anderen Farbstoff (z. B. CFSE und FarRed), wie beschrieben 2,8-2,9, Zell-Populationen während Mikroskopie unterscheiden zu können.
    3. Verwerfen Sie den überstand und Aufschwemmen Sie der gefärbten Zelle Pellets in die entsprechende Menge an Haftung Puffer (150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2) um eine Suspension von 1,5 x 106 Zellen/mL zu erhalten.
    4. Mischen Sie gleiche Volumina von Zellsuspensionen (z. B. 500 µL der regulatorischen T-Zellen) und 500 µL T-Effektorzellen zu einem Finale gemischt Zellkonzentration von 1,5 x 106 Zellen/mL. Fügen Sie dann den entsprechenden Betrag von 100 mM MnCl2 , eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten. Solcher Suspensionen können anschließend für Wettbewerbsanalyse der Klebevorgang durch verschiedene Zell-Populationen durch die gleichen Kapillare Vorrichtung verwendet werden.

3. live Cell Imaging der dynamischen Adhäsion

  1. Schalten Sie das Mikroskop und wählen Sie den entsprechenden Filter oder laser-tracking-Dye(s) (z. B. 488 nm Laser für CFSE-), eine geeignete Ziel (z. B. 40 X) und eine Übernahme-Modus ermöglicht Zeit verfallen Bildgebung Zelle zu begeistern.
  2. Entfernen Sie den Kunststoff Paraffin-Film von der Spitze der Kapillare und verbinden Sie die Kapillare mit einem kurzen Stück Schlauch (ca. 5 cm Länge) durch Dehnung des Schlauchs auf der einen Seite mit einer kleinen Schere und sorgfältig Einfügen der Kapillare (ca. 0,5 cm) in die Röhre. Die Verbindung zwischen Kapillare und Schlauch mit dem Kunststoff Paraffin-Film zu versiegeln.
  3. Montieren Sie die Kapillare auf einem Tablett Fixierung (z.B. Deckel von einer 6-Well-Platte mit einem rechteckigen Ausschnitt etwas kürzer als die Länge der Kapillare) und platzieren Sie die feste Kapillare auf dem Tablett-Halter des Mikroskops, so dass die Kapillare im Fokus und bereit ist für die Mikroskopie.
  4. Stecken Sie den Gummischlauch in die entsprechende Kerbe der peristaltischen Pumpe und stecken Sie das Ende nicht an der Kapillare in das entsprechende Probenröhrchen, enthält die Zellsuspension angefügt. Stecken Sie den kurzen Schlauch auf der anderen Seite der Kapillare in ein 15 mL-Tube, Flow-through zu sammeln.
  5. Lassen Sie die Schläuche füllen mit einem Durchsatz von 500 µL pro Minute bis die Zellsuspension fast die Kapillare erreicht. Dann lassen Sie die Kapillare Füllung mit einer Durchflussmenge von 100 µL/min.
    Hinweis: Eine schnelle Füllung der Kapillare sorgt für eine gleichmäßige Verteilung der Zellsuspension innerhalb der Kapillare.
  6. Wenn die Kapillare mit der Zellsuspension gefüllt ist, einstellen Sie Durchfluss bis 10 µL/min.
    Hinweis: Diese Flussraten können variieren, wenn Kapillaren eine andere Größe oder andere Schlauchpumpen verwendet werden. In dieser Studie wurde die Durchflussmenge von 10 µL/min für die Pumpe und Kapillaren zu in Vivo Blutfluss zu imitieren optimiert.
  7. Zeitraffer-Aufnahmen der Zellen langsam durch die Kapillare entlang der Bearbeit-Beschichtung auf der Innenseite Wand alle 2 s für eine Gesamtmenge von 3 min.
    Hinweis: Intervalle und Gesamtzeit variieren je nach Zelltyp und Frage angegangen werden.
  8. Vor dem Ablegen der Kapillare, die ganze Kapillare Bildschirm durch das Okular des Mikroskops um sicherzustellen, dass der Abschnitt auf dem Video gezeigt Vertreter ist. Wenn nötig, machen Sie eine zweite Aufnahme.
  9. Den Schlauch von der Pumpe frei und lassen Sie die restliche Flüssigkeit laufen zurück in der 2-mL-Tube, dann trennen Sie die Kapillare und Schlauch aus der Fixierung und fahren Sie mit der nächsten Kapillare.

4. Bewertung und Zellzählung

  1. Öffnen Sie die Zeitraffer-Sequenz mit der entsprechenden Software und exportieren Sie die ersten drei Bilder ("Anfang") und die letzten drei Bilder ("Ende") als TIFF-Dateien.
  2. Offen die drei "Anfang" Bilder in ImageJ, konvertieren, 32-Bit ("Bild | Typ | 32-Bit ") und Bilder zu verschmelzen (' Bild | Farbe | Kanäle verbinden; Ordnen Sie die Farben rot, grün und blau zu den verschiedenen Bildern) zu. Zusammengesetztes Bild in RGB umwandeln (' Bild | Type-RGB') und speichern als TIFF-Datei. Wiederholen Sie mit dem "Ende"-Bilder.
    Hinweis: Zuerst aufgeteilt In wettbewerbsfähigen dynamischen Adhäsion Assays mit Zellen mit verschiedenen Farben gefärbt, die Kanäle der Bilder, um die Adhäsion der unterschiedlichen Zellpopulationen separat zu analysieren.
  3. Zählen Sie die weißen Zellen sichtbar im "Anfang" und "Ende" Composite und subtrahieren Sie die Zahl der weißen Blutkörperchen in den "Anfang" von der weißen Blutkörperchen in das "Ende".
    Hinweis: Der Unterschied entspricht der Anzahl der neu Einhaltung im Zeitintervall von 3 min-Zellen. In das zusammengesetzte Bild sind Zellen, die verschoben in die spezifische Farbe, die den jeweiligen Frame zugewiesen wurde, da sie an einer anderen Stelle im vorhergehenden und folgenden Frame lokalisieren, sichtbar. Für Zellen, die Anhänger, die roten, grünen und blauen Signale in der gleichen Stelle Überlappung zu weiß.
  4. Um die Ergebnisse besser zu visualisieren, kompilieren Sie ein Video von den Zeitraffer-Sequenzen, z. B. mit ImageJ.

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Ergebnisse

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Die vorgestellte Methode in diesem Manuskript zielt darauf ab, die in Vivo -Prozess der menschlichen Zelle Adhäsion an der endothelialen Wand so nah wie möglich an funktionell simulieren bewerten Zelladhäsion und die Rolle der störende Antikörper. Daher sind ultradünne Kapillaren mit Addressins beschichtet und mit Gewebekulturen beschriftete menschliche Zellen mit einer Perfusion Pumpe durchströmt. Mit live Cell imaging das Anhaften von menschlichen Zellen, die Addressins kann in...

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Diskussion

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Das obige Protokoll beschreibt eine nützliche Technik, um dynamische Haftung der menschlichen Immunzellen zur endothelialen Liganden zu studieren. Durch Variation der beschichteten Liganden PERFUNDIERTEN Zelltypen oder Teilmengen, die Inkubation mit zusätzlichen Reize oder verschiedene neutralisierende Antikörper, es hat fast unbegrenzte Einsatzmöglichkeiten. Daher können solche dynamischen Adhäsion Assays nützlich sein, sowohl grundlegende Fragen der Grundlagenforschung sowie translational Abfragen, die helfen könnten, ...

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Offenlegungen

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M.F.N. diente als Berater für Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda und Boehringer. M.F.N. und S.Z. seitens Forschungsförderung der Takeda und Roche.

Danksagungen

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Die Forschung von CN, IA, MFN und SZ wurde unterstützt durch das interdisziplinäre Zentrum für klinische Forschung (IZKF) und der ELAN-Programm der Universität Erlangen-Nürnberg, der Else Kröner-Fresenius-Stiftung, der Fritz-Bender-Stiftung, die deutsche Morbus Crohn und Ulcerosa Foundation (DCCV), die klinische Forschung Gruppe CEDER von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG), das DFG-Thema-Programm auf Mikrobiota, Emerging-Feld-Initiative und die DFG Collaborative Research Centers 643, 796 und 1181.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
48-Well-PlatteSarstedt833,923
Adhäsionspuffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES + 1 mM MgCl2 + 1 mM CaCl2
Blocklösung: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA
Rinderserumalbumin (BSA)ApplichemA1391,0100
CaCl2Merck2382
Kapillaren: Rechteckige Boro-Schläuche 0,20 mm x 2,00 mm ID, 50 mm LängeCM Scientific3520-050
CCL-2, humaneImmunotools11343384
CD4-Mikrokügelchen, humaneMiltenyi Biotec130-045-101
CellTrace™ CFSE Cell Proliferation KitThermoFischer ScientificC34554
Zentrifuge (Rotixa 50 RS)Hettrich
Coating Puffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES
Konfokales Mikroskop (TCS SP8)Leica
CXCL-10,humane Immunotools11343884
Dextran 500Roth9219.3
EDTA KE/9 mL MonovetteSarstedt
Falken (50 mL)Sarstedt62.547.004
Fc-Chimären-Isotyp-Kontrolle& D Systems110-HG
Durchflusspumpen (LabV1)Baoding Shenchen Precision Pump Company
HEPESVWRJ848-100ML
Human IgG Isotype ControlThermoFischer Scientific31154
Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc ChimeraR& D Systems720-IC-050
LS-SäulenMiltenyi Biotec130-042-401
MgCl2Roth
MnCl2Roth
Maus IgG-IsotypkontrolleMiltenyi Biotec130-106-545
Mukosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc-ChimäreForschung & Forschung D Systems6056-MC
NaClRoth3957.3
NatalizumabBiogen
Neubauer ZählkammerRothT729.1
Pancoll, humanPAN BiotechP04-601000
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)BiochromL 182-10ohne Mg und Ca
Paraffinfolie aus Kunststoff: Parafilm (PM-996)VWR52858-000
gereinigtes Anti-Human-CD18Biolegend302102
RPMI Medium 1640Gibco Life Technologies61870-010
Gummischlauch: SC0059T 3-Stopp LMT-55 Schlauch, 1,02 mm ID, 406,4 mm LängeIsmatecSC0059
Serologische PipettenSarstedt861,254,025
TrypanblauRothCN76.1
Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimäreBiolegend553706
Vedolizumab (Entyvio)Takeda
R

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration - Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
  2. Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn's Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
  3. Binder, M. -T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , in press (2018).
  4. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
  5. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
  6. Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice--a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
  7. Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
  8. Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
  9. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), London, England. 309-318 (2014).
  10. Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), London, England. 135-144 (2017).
  11. Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
  12. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
  13. Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
  14. Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
  15. Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
  16. Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
  17. Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), Baltimore, Md. 1497-1505 (1997).
  18. Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
  19. Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
  20. Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
  21. Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
  22. Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
  23. Binder, M. -T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
  24. Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
  25. House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
  26. Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
  27. Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  28. Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
  29. Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).

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