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Methodenartikel

Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen

7.2K Aufrufe

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DOI:

10.3791/58229

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30. Oktober 2018

1Division of Neuromedical Science, Institute of Natural Medicine, University of Toyama

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentiert sich ein Protokoll, das frühe Effekte von Amyloid-β (Aβ) im Gehirn zu untersuchen. Dies zeigt, dass Aβ Clathrin-vermittelte Endozytose und Zusammenbruch der axonalen Wachstum Kegel induziert. Das Protokoll ist nützlich bei der Untersuchung der frühen Auswirkungen von Aβ auf axonale Wachstum Kegel und Prävention der Alzheimer-Krankheit erleichtern kann.

Zusammenfassung

Amyloid-β (Aβ) bewirkt, dass Gedächtnisstörungen bei der Alzheimer-Krankheit (AD). Obwohl Therapeutika haben gezeigt, dass Aβ in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten zu reduzieren, verbessern diese Memory-Funktionen nicht. Da Aβ im Gehirn vor dem Aufkommen von Gedächtnisstörungen Aggregate, kann gezielt Aβ ineffizient sein zur Behandlung von Alzheimer-Patienten, die bereits Gedächtnisdefizite ausstellen. Daher sollten nachgeschaltete Signalisierung durch Aβ Ablagerung vor AD Entwicklung blockiert werden. Aβ induziert axonalen Degeneration, führt zu einer Störung der neuronalen Netzwerke und Gedächtnisstörungen. Obwohl es viele Studien über die Mechanismen der Aβ-Toxizität gibt, ist die Quelle von Aβ-Toxizität unbekannt. Um die Quelle zu ermitteln, schlagen wir eine neuartige Protokoll, die Mikroskopie, gen Transfektion und live Cell imaging zu frühen Veränderungen durch Aβ axonale Wachstum Zapfen von kultivierten Neuronen untersuchen verwendet. Dieses Protokoll zufolge Aβ induziert Clathrin-vermittelte Endozytose in axonale Wachstum Kegel gefolgt von Wachstum Kegel Zusammenbruch, zeigen, dass die Hemmung der Endozytose Aβ Toxizität verhindert. Dieses Protokoll wird in der frühen Auswirkungen von Aβ nützlich sein und kann dazu führen, effizienter und vorbeugende Behandlung der AD.

Einleitung

Ablagerungen von Amyloid-β (Aβ) befinden sich im Gehirn von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD) und gelten als eine kritische Ursache von AD1 , die neuronale Netze stören zu Speicher Beeinträchtigungen2,3,4. Viele klinische Wirkstoffkandidaten nachweislich effektiv verhindern Amyloid-β (Aβ) Produktion oder Aβ Ablagerungen entfernen. Jedoch ist keine Verbesserung der Gedächtnisfunktion AD Patienten5gelungen. Aβ lagert sich bereits im Gehirn vor dem Beginn der Speicher Beeinträchtigungen6; Daher können Verminderung der Aβ-Zahl in den Gehirnen von Patienten ausstellenden Gedächtnisstörungen unwirksam sein. Aβ Ablagerung ist in präklinischen Alzheimer-Patienten; Allerdings stellen diese Patienten selten mit neuronalen Degeneration und Speicher Defizite6. Gibt es eine zeitliche Verzögerung zwischen Aβ-Ablagerungen und Gedächtnisstörungen. Daher ist eine kritische Strategie zur Prävention von AD Aβ Toxizität während der frühen Stadien von AD, vor der Entwicklung von Gedächtnisstörungen Signalisierung blockiert. Ablagerung von Aβ induziert Axon Degeneration7,8,9,10,11,12,13, führen zu einer Störung der neuronale Netze und dauerhafte Beeinträchtigung der Memory-Funktion. Viele Studien haben die Mechanismen der Aβ-Toxizität untersucht; zum Beispiel zeigten die degenerierten Axone AD Mäuse Gehirne Autophagie14gestiegen. Calcineurin-Aktivierung wurde als ein möglicher Mechanismus der Aβ-induzierte axonalen Degeneration15gemeldet; die direkte Auslöser der axonalen Degeneration bleibt jedoch unbekannt.

Diese Studie konzentriert sich auf den Zusammenbruch der axonalen Endungen genannt Wachstum Kegel. Der Zusammenbruch der axonalen Wachstum Zapfen kann durch axonale Wachstum Repellentien wie semaphorin-3A und Ephrin-A516,17,18,19,20verursacht werden. Kollaps-wie dystrophischen axonale Endungen sind in den Gehirnen von AD Patienten21,22beobachtet worden. Darüber hinaus kann ein Versagen des Wachstums Kegel funktionieren axonalen Degeneration23provozieren. Es ist jedoch unbekannt, ob Aβ Wachstum Kegel Zusammenbruch induziert. Diese Studie stellt daher eine neuartige Protokoll um die frühen Auswirkungen von Aβ in kultivierten Neuronen zu beobachten und untersuchen Aβ-induzierte Wachstum Kegel Zusammenbruch.

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Protokoll

Alle Experimente wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren auf dem Sugitani-Campus der Universität Toyama und wurden vom Ausschuss für Animal Care und Verwendung von Labortieren auf dem Sugitani Campus der genehmigten die Universität Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

(1) Zusammenbruch Assay

  1. Poly-D-Lysin-Beschichtung
    1. 8-Well Kultur Folien mit 400 μl 5 μg/mL Poly-D-Lysin (PDL) in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu beschichten und sie über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
    2. Die PDL-Lösung entfernen und die Brunnen 3 Mal mit destilliertem Wasser zu waschen.
  2. Neuron Kultur24
    1. Hackfleisch frisch isolierte zerebrale Rinde aus embryonalen Tag 14 (E14) DdY Mäuse mit Microscissors in Neuron Kulturmedium mit 12 % Pferd Serum, 0,6 % Glukose und 2 mM L-Glutamin (Medium A). Fügen Sie keine Antibiotika.
      Hinweis: In diesem Protokoll wird die DdY Maus verwendet. Dies ist eine outbred Sorte, die häufig in Japan verwendet. Dieses Neuron-Kultur-Protokoll kann auch für Ratte kortikale Neuronen7,25angewendet werden.
    2. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 87 X g für 3 min.
    3. Den Überstand zu entfernen. Fügen Sie dann zum Pellet, 2 mL 0,05 % Trypsin und 15 min bei 37° c inkubieren Durch Tippen auf alle 5 min. mischen.
    4. Durch Antippen 4 mL mittlere A und Mischung hinzugeben.
    5. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 178 X g für 3 min.
    6. Den Überstand zu entfernen, und das Gewebe mit 600 U/mL DNase I und 0,3 mg/mL Soja-Trypsin-Inhibitor aufgelöst mit PBS-Puffer für 15 min bei 37 ° c inkubieren Durch Tippen auf alle 5 min. mischen.
    7. Hinzugeben Sie nach der Inkubation 4 mL mittlere A und Mischung durch Antippen.
    8. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 178 X g für 3 min.
    9. Nach dem Entfernen des Überstands, fügen Sie 4 mL Medium A und das Gewebe mit einer polierten Pasteurpipette genannte.
    10. Das triturierten Gewebe mit einem 70 µm Porengröße Netz zu filtern. Berechnen Sie nach der Filtration die Dichte der Zellen mit einem Hemocytometer.
    11. Kultur der Zellen in der 8-Brunnen-Kultur auf 0,8 x 104 Zellen/Brunnen mit Medium A schieben und halten sie in einem CO2 Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre 10 % CO2 bei 37 ° C.
    12. Ersetzen Sie nach 4 h der Kultivierung das Kulturmedium zu einem mit 2 % Zuschlag für neuronale Kultur, 0,6 % Glukose und 2 mM L-Glutamin (Medium B).
      Hinweis: Die Reinheit der Neuronen war ca. 75 %, wie zuvor beschrieben26.
  3. Kollaps-Assay27
    1. Lösen Sie im Handel erhalten Full-length Amyloid β1-42 (Aβ1 42) in destilliertem Wasser in einer Konzentration von 0,5 mM und 7 Tage bei 37 ° C inkubieren. Bewahren Sie nach der Inkubation die aggregierte Aβ1-42-Lösung in einem-30 ° C-Gefrierschrank bis zur Verwendung auf.
      Hinweis: Diese Inkubation ist notwendig für die Aggregation und Toxizität von Aβ27,28,29,30.
    2. Nach 4 Tagen der neuronalen Kultur behandeln die Brunnen mit 100 μL der neue mittlere B, aggregiert, enthält 0,5 μM Aβ1-42 oder Fahrzeug-Lösung (destilliertes Wasser) für 1 h.
      Hinweis: Auswirkungen des Aβ1-42 wurden Dosis-Abhängigkeit stieg von 0,1 bis 5 μM, und erreichte 0,5 μM bereits27beschrieben. Ähnliche Ergebnisse können als durch Aβ1-42-Behandlung für 1 h nach 3 Tagen der neuronalen Kultur31beobachtet werden.
    3. Das Kulturmedium zu entfernen und sofort die Neuronen mit 4 % Paraformaldehyd, enthält 4 % Saccharose mit PBS-Puffer für 1 h bei 37 ° C auf einer heißen Platte befestigen.
    4. Nach der Fixierung die Neuronen 3 Mal mit PBS waschen und mit einer wässrigen Eindeckmedium montieren. Trocknen Sie das Eindeckmittel bei 4 ° C für 2 – 4 Tage.
    5. Das gesamte Gebiet (7,8 x 9 mm2) von jedem Bohrloch mit einem 20 X trocken Objektiv auf einem inversen Mikroskop zu erfassen.
    6. Klassifizieren Sie die längste Neuriten jedes Neuron in Stufe 3 oder 4 als Axone, als zuvor beschriebenen32,33.
    7. Klassifizieren Wachstum Kegel nach folgenden Kriterien: (1) axonale Wachstum Zapfen fehlt Lamellipodia oder (2) besitzen weniger als drei Filopodien gelten zusammengebrochen Wachstum Zapfen, wie zuvor beschrieben17.
      Hinweis: Gesundes Wachstum Zapfen werden als 0-Punkt gewertet; reduzierte Wachstum Zapfen werden als 1 Punkt gewertet. Bedeuten Sie Zusammenbruch, die Scores berechnet werden für jede Behandlung.

(2) Amyloid β Immunostaining

  1. Kultur Maus kortikale Neuronen für 3 Tage, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  2. Behandeln mit aggregierten Aβ1-42 (5 μM) oder Fahrzeug für 4 h bei 37 ° C in einem CO-2 -Inkubator.
  3. Ohne das Medium zu entfernen, fügen Sie ein gleiches Volumen von 4 % Paraformaldehyd, enthält 4 % Saccharose in PBS in jede Vertiefung und pflegen Sie die Kultur bei 37 ° C auf einer heißen Platte für 5 min.
  4. Ersetzen Sie die Lösung mit 400 μl 4 % Paraformaldehyd, enthält 4 % Saccharose mit PBS-Puffer und pflegen bei 37 ° C auf der Heizplatte für 1 h. Diese Fixierung-Protokoll wurde von einem vorherigen Bericht34geändert.
  5. Waschen Sie die Neuronen 3 Mal mit PBS.
  6. Block mit 5 % normalem Ziegenserum in PBS.
  7. Inkubieren Sie die Neuronen mit Maus Anti-Amyloid β Immunglobulin G (IgG) (01:50) und 1 % Rinderserumalbumin mit PBS-Puffer bei 4 ° C über Nacht.
  8. Waschen Sie die Neuronen 3 Mal mit PBS.
  9. Inkubieren Sie die Nervenzellen mit einem Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper (1: 400) und 1 % Rinderserumalbumin mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur für 2 h.
  10. Die Neuronen 3 Mal mit PBS waschen und mit einer wässrigen Eindeckmedium montieren.
  11. Erfassen Sie Fluoreszenzbilder und Hellfeld Bilder mit Schrägbeleuchtung mithilfe eine 40 X trocken Objektiv auf inversen Mikroskop B.

(3) axonalen Immunostaining27

  1. Waschen Sie die Neuronen 3 Mal mit PBS nach kultivierten Neuron Fixierung, wie unter Punkt 1.3.3 beschrieben.
  2. Inkubieren Sie die Neuronen mit Maus anti-tau-1 IgG (1: 500), Kaninchen Anti-Mikrotubuli assoziierten Protein 2 (MAP2) IgG (1: 500) in normalem Ziegenserum 5 % und 0,3 % t- Octylphenoxypoly-Ethoxyethanol mit PBS-Puffer bei 4 ° C über Nacht.
  3. Waschen Sie die Neuronen 3 Mal mit PBS.
  4. Inkubieren Sie die Neuronen mit Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper (1: 400) und 0,3 % t- Octylphenoxypolyethoxyethanol mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur für 2 h.
  5. Die Neuronen 3 Mal mit PBS waschen und mit einer wässrigen Eindeckmedium montieren.
  6. Erfassen Sie Fluoreszenz und Differential Interferenzbilder Kontrast (DIC) mit einem 20 × trocken Objektiv auf inversen Mikroskop A.

4. live Cell Imaging27

  1. Beschichtung von Glas basierende Gerichte mit 500 μL der PDL (5 μg/mL), wie in Schritt 1.1.1 beschrieben.
    Hinweis: In diesem Protokoll wurden hausgemachte Glas basierende Gerichte verwendet. Handelsübliche Glas basierende Gerichte können auch für live-Aufnahmen verwendet werden. Glas-basierten Hausmannskost wurden wie folgt hergestellt: (1) stellen Sie ein Loch von ca. 1,4 mm Durchmesser in der Mitte einer 35-mm-Schale mit einer Hand, und (2) ein Glas-Deckglas (Durchmesser 22 mm) auf der Rückseite des Tellers mit Silikon befestigen.
  2. Die Platten mit destilliertem Wasser zu waschen, wie in Schritt 1.1.2 beschrieben und Kultur der kortikalen Neuronen in der Glas-basierten Schale auf 3 x 104 Zellen/Schüssel mit mittlerer A, wie in Schritt 1.2 beschrieben.
  3. Nach 4 Tage der Zellkultur, ersetzen Sie das Medium mit 2 mL des neuen Mediums B und Transfer invertiert das Gericht für Mikroskop A. pflegen die Kultur in eine feuchte Atmosphäre 10 % CO2 bei 37 ° C.

(5) Endozytose Experiment

  1. Kultur der Maus kortikale Neuronen, wie unter Punkt 1.2 beschrieben.
  2. Ersetzen Sie vier Tage später, das Medium mit 100 μL des neuen Mediums B mit 20 μM-Fluoreszenz-Membran-Sonde für 1 min.
  3. Fügen Sie 1 μL von 0,05 mM aggregierten Aβ1-42 (letzte 0,5 μM) oder Fahrzeuglösung (destilliertes Wasser) und Mischen von pipettieren. 20 min inkubieren.
  4. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Brunnen zweimal mit Medium B, das auf 37 ° c vorgewärmt worden ist
  5. Beheben Sie, waschen Sie, und montieren Sie die Neuronen zu, wie in den Schritten 1.3.3 und 1.3.4 beschrieben.
  6. Erfassen Sie Leuchtstofflampen und DIC-Bilder mit einem 63 X Öl Objektiv auf inversen Mikroskop A.
  7. Quantifizieren Sie die Dichte der Fluoreszenz Membran Sonde-positiven Bereich in jeder gesunden Wachstum Kegel mithilfe einer Image-Software.

6. gen Transfektion

  1. Bereiten Sie kortikale Neuronen, wie unter Punkt 1.2 beschrieben. Nach Abschluss der Schritte 1.2.1, 1.2.10, Zentrifugieren der Neuronen bei 178 X g für 3 min.
  2. Den Überstand zu entfernen, fügen Sie 4 mL Ca2 +-frei und Mg2 +-frei Hanks ausgeglichene Salzlösung (CMF-HBSS) und Mischen von pipettieren.
  3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 178 X g für 3 min.
  4. Entfernen des Überstands, 4 mL CMF-HBSS hinzufügen und Mischen von pipettieren. Als Nächstes berechnen Sie die Zelldichte, wie in Schritt 1.2.10 beschrieben.
  5. Übertragen Sie 5 x 106 Zellen auf einem 1,5 mL-Tube und Zentrifuge bei 1.677 x g für 1 min.
  6. Den Überstand zu entfernen, fügen 100 μL der Transfektion Lösung mit Beilage und 3 μg DNA Plasmid Codierung EGFP oder EGFP-AP180 C-Terminus und mischen durch pipettieren.
  7. Übertragen Sie die obige Lösung (Schritt 6,6) auf eine zertifizierte Küvette und transfizieren mit einem Electroporator laut Protokoll des Herstellers.
  8. Unmittelbar nach der Transfektion 500 μl Medium A in die Küvette hinzufügen und die Lösung auf eine 1,5-mL-Tube mit einer zertifizierten Pipette übertragen. Als Nächstes berechnen Sie die Zelldichte, wie in Schritt 1.2.10 beschrieben.
  9. Kultur der Zellen in einer 8-Well Kultur-Folie in 0,8 x 104 Zellen/gut, wie in den Schritten 1.2.11 und 1.2.12 beschrieben.
  10. Führen Sie nach 4 Tagen der Zellkultur einen Zusammenbruch-Assay wie unter Punkt 1.3 beschrieben.

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Ergebnisse

In diesem Protokoll wurde Aβ1-42 für 7 Tage vor dem Gebrauch, bei 37 ° C inkubiert, denn Inkubation Aβ1 / 42 nötig war für die Herstellung von toxischen Formen27,28,30,35. Nach dieser Inkubationszeit beobachtet aggregierte Formen von Aβ (Abbildung 1A). Es wurde berichtet, dass ähnliche Inkubation von Aβ1-42 Fibrille Form von Aβ

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Diskussion

Das Protokoll in dieser Studie beschriebenen aktiviert die Beobachtung der frühen Phänomene in axonale Wachstum Zapfen nach Aβ1-42-Behandlung. Aβ1-42 induzierte Endozytose in axonale Wachstum Zapfen innerhalb von 20 min, und Wachstum Kegel Zusammenbruch wurde innerhalb 1 h nach Behandlung beobachtet. Diese Endozytose wurde wahrscheinlich durch Clathrin vermittelt. Durch die Verwendung dieses Protokolls, bestätigte die Hemmung der Clathrin-vermittelte Endozytose um Aβ1-42-induzierte Wachstum Kegel Zusammenbruch und axonal...

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Offenlegungen

Der Autor hat nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von Forschungsstipendien von JSPS (KAKENHI 18K 07389), Japan, Takeda Science Foundation, Japan und Kobayashi Pharmaceutical Co., Ltd., Japan.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ddY MäuseSLC
Acht-Well-KulturobjektträgerFalcon354108
Poly-D-LysinWako168-19041
Kulturmedium, Neurobasales MediumGibco21103-049
HausserumGibco26050-088
GlukoseWako049-31165
L-GlutaminWako074-00522
0,05% TrypsinGibco25300-054
DNase IWorthingtonDP
Sojabohnen-Trypsin-InhibitorGibco17075-029
Filter mit 70 & Mikro; m Maschenweite, ZellsiebFalcon352350
B-27 SupplementGibco17504-044
CO2 InkubatorAstecSCA-165DS
Amyloid β 1-42Sigma-AldrichA9810
ParaformaldehydWako162-16065
Saccharose Wako196-00015
Wässriges Eindeckmedium, Aqua-Poly/Mountpolysciences18606-20
Inverses Mikroskop ACarl ZeissAxio Observer Z1 Verbunden mit AxioCam MRm, Heizeinheit XL S, CO2-Modul S1 und TempModul S1
Objektiv Plan-Apochromat 20xCarl Zeiss420650-9901
Objektiv Plan-Apochromat 63xCarl Zeiss440762-9904
Objektiv, CFI Plan Apo Lambda 40XNikon
anti-MAP2 IgGAbcamab32454
anti-tau-1 IgGChemiconMAB3420
Anti-Amyloid & Beta; AntikörperIBL10379Klon 11A1
normales ZiegenserumWako143-06561
RinderserumAlbumin Wako010-25783
t-OctylphenoxypolyethoxyethanolWako169-21105
Anti-Maus-IgG für Ziegen, konjugiert mit AlexaFluor 594InvitrogenA11032
Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit AlexaFluor 488InvitrogenA11029
HeizplatteNISSINNHP-M30N
DeckglasFisher Scientific12-545-85
35 mm SchaleIWAKI1000-035
Silikon RTVShin-EtsuKE42T
HandlocherRoper WhitneyNr.
Fluoreszenzmembransonde, FM1-43FXInvitrogenF35355
Ca2+- und Mg2+-frei Hanks' ausgewogene SalzlösungGibco14175-095
Transfektionslösung, NukleofektorlösungLonzaVPG-1001
Elektroporator, Nukleofektor IAmaxa
Inverses Mikroskop BKeyenceBZ-X710
Bildsoftware, ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
XX

Referenzen

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Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen
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