Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen

Zusammenfassung

Hier präsentiert sich ein Protokoll, das frühe Effekte von Amyloid-β (Aβ) im Gehirn zu untersuchen. Dies zeigt, dass Aβ Clathrin-vermittelte Endozytose und Zusammenbruch der axonalen Wachstum Kegel induziert. Das Protokoll ist nützlich bei der Untersuchung der frühen Auswirkungen von Aβ auf axonale Wachstum Kegel und Prävention der Alzheimer-Krankheit erleichtern kann.

Zusammenfassung

Amyloid-β (Aβ) bewirkt, dass Gedächtnisstörungen bei der Alzheimer-Krankheit (AD). Obwohl Therapeutika haben gezeigt, dass Aβ in den Gehirnen von Alzheimer-Patienten zu reduzieren, verbessern diese Memory-Funktionen nicht. Da Aβ im Gehirn vor dem Aufkommen von Gedächtnisstörungen Aggregate, kann gezielt Aβ ineffizient sein zur Behandlung von Alzheimer-Patienten, die bereits Gedächtnisdefizite ausstellen. Daher sollten nachgeschaltete Signalisierung durch Aβ Ablagerung vor AD Entwicklung blockiert werden. Aβ induziert axonalen Degeneration, führt zu einer Störung der neuronalen Netzwerke und Gedächtnisstörungen. Obwohl es viele Studien über die Mechanismen der Aβ-Toxizität gibt, ist die Quelle von Aβ-Toxizität unbekannt. Um die Quelle zu ermitteln, schlagen wir eine neuartige Protokoll, die Mikroskopie, gen Transfektion und live Cell imaging zu frühen Veränderungen durch Aβ axonale Wachstum Zapfen von kultivierten Neuronen untersuchen verwendet. Dieses Protokoll zufolge Aβ induziert Clathrin-vermittelte Endozytose in axonale Wachstum Kegel gefolgt von Wachstum Kegel Zusammenbruch, zeigen, dass die Hemmung der Endozytose Aβ Toxizität verhindert. Dieses Protokoll wird in der frühen Auswirkungen von Aβ nützlich sein und kann dazu führen, effizienter und vorbeugende Behandlung der AD.

Einleitung

Ablagerungen von Amyloid-β (Aβ) befinden sich im Gehirn von Patienten mit Alzheimer-Krankheit (AD) und gelten als eine kritische Ursache von AD¹ , die neuronale Netze stören zu Speicher Beeinträchtigungen^2,3,4. Viele klinische Wirkstoffkandidaten nachweislich effektiv verhindern Amyloid-β (Aβ) Produktion oder Aβ Ablagerungen entfernen. Jedoch ist keine Verbesserung der Gedächtnisfunktion AD Patienten⁵gelungen. Aβ lagert sich bereits im Gehirn vor dem Beginn der Speicher Beeinträchtigungen⁶; Daher können V....

Protokoll

Alle Experimente wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren auf dem Sugitani-Campus der Universität Toyama und wurden vom Ausschuss für Animal Care und Verwendung von Labortieren auf dem Sugitani Campus der genehmigten die Universität Toyama (A2014INM-1, A2017INM-1).

(1) Zusammenbruch Assay

1. Poly-D-Lysin-Beschichtung
   1. 8-Well Kultur Folien mit 400 μl 5 μg/mL Poly-D-Lysin (PDL) in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu beschichten und sie über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
   2. Die PDL-Lösung entfernen und die Brunnen 3 Mal mit destilliertem Wasser zu wasch....

Ergebnisse

In diesem Protokoll wurde Aβ1-42 für 7 Tage vor dem Gebrauch, bei 37 ° C inkubiert, denn Inkubation Aβ1 / 42 nötig war für die Herstellung von toxischen Formen^27,28,30,35. Nach dieser Inkubationszeit beobachtet aggregierte Formen von Aβ (Abbildung 1A). Es wurde berichtet, dass ähnliche Inkubation von Aβ1-42 Fibrille Form von Aβ

Diskussion

Das Protokoll in dieser Studie beschriebenen aktiviert die Beobachtung der frühen Phänomene in axonale Wachstum Zapfen nach Aβ1-42-Behandlung. Aβ1-42 induzierte Endozytose in axonale Wachstum Zapfen innerhalb von 20 min, und Wachstum Kegel Zusammenbruch wurde innerhalb 1 h nach Behandlung beobachtet. Diese Endozytose wurde wahrscheinlich durch Clathrin vermittelt. Durch die Verwendung dieses Protokolls, bestätigte die Hemmung der Clathrin-vermittelte Endozytose um Aβ1-42-induzierte Wachstum Kegel Zusammenbruch und axonal.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
ddY Mäuse	SLC
Acht-Well-Kulturobjektträger	Falcon	354108
Poly-D-Lysin	Wako	168-19041
Kulturmedium, Neurobasales Medium	Gibco	21103-049
Hausserum	Gibco	26050-088
Glukose	Wako	049-31165
L-Glutamin	Wako	074-00522
0,05% Trypsin	Gibco	25300-054
DNase I	Worthington	DP
Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor	Gibco	17075-029
Filter mit 70 & Mikro; m Maschenweite, Zellsieb	Falcon	352350
B-27 Supplement	Gibco	17504-044
CO2 Inkubator	Astec	SCA-165DS
Amyloid β 1-42	Sigma-Aldrich	A9810
Paraformaldehyd	Wako	162-16065
Saccharose	Wako	196-00015
Wässriges Eindeckmedium, Aqua-Poly/Mount	polysciences	18606-20
Inverses Mikroskop A	Carl Zeiss	Axio Observer Z1	Verbunden mit AxioCam MRm, Heizeinheit XL S, CO2-Modul S1 und TempModul S1
Objektiv Plan-Apochromat 20x	Carl Zeiss	420650-9901
Objektiv Plan-Apochromat 63x	Carl Zeiss	440762-9904
Objektiv, CFI Plan Apo Lambda 40X	Nikon
anti-MAP2 IgG	Abcam	ab32454
anti-tau-1 IgG	Chemicon	MAB3420
Anti-Amyloid & Beta; Antikörper	IBL	10379	Klon 11A1
normales Ziegenserum	Wako	143-06561
Rinderserum	Albumin Wako	010-25783
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol	Wako	169-21105
Anti-Maus-IgG für Ziegen, konjugiert mit AlexaFluor 594	Invitrogen	A11032
Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit AlexaFluor 488	Invitrogen	A11029
Heizplatte	NISSIN	NHP-M30N
Deckglas	Fisher Scientific	12-545-85
35 mm Schale	IWAKI	1000-035
Silikon RTV	Shin-Etsu	KE42T
Handlocher	Roper Whitney	Nr.
Fluoreszenzmembransonde, FM1-43FX	Invitrogen	F35355
Ca2+- und Mg2+-frei Hanks' ausgewogene Salzlösung	Gibco	14175-095
Transfektionslösung, Nukleofektorlösung	Lonza	VPG-1001
Elektroporator, Nukleofektor I	Amaxa
Inverses Mikroskop B	Keyence	BZ-X710
Bildsoftware, ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/