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Methodenartikel

Generierung von Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis for the Study of Kälte eine geschlechtergerechte MicroRNAs

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DOI:

10.3791/58242

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20. November 2018

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1Institute of Vegetables, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 2State Key Lab Breeding Base for Sustainable Control of Plant Pest and Disease, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3Institute of Horticulture, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 4Shanghai Biozeron Biotechnology Co., Ltd

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis, zusätzlich zu den Methoden der Gewebe Probenahme, Datengenerierung und Datenanalyse, zur Untersuchung von Kälte auf eine geschlechtergerechte MicroRNAs effizient machen.

Zusammenfassung

Micro-RNAs (MiRNAs) sind endogen kleine nicht-kodierende RNAs von ca. 20-24 nt, eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Anpassung spielen bekannt. Gibt es eine Anhäufung Beweise dafür, dass die Ausdrücke für bestimmte MiRNAs geändert werden, wenn aufpfropfen, eine landwirtschaftliche Praxis häufig von den Landwirten verwendet, um Ernte Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress zu verbessern. Flaschenkürbis ist ein von Natur aus klimaresistenten Ernte im Vergleich zu vielen anderen großen Kürbisgewächse, einschließlich der Wassermelone, wodurch es eines der am weitesten verbreitete Wurzelstöcke für Letzteres. Die jüngste Weiterentwicklung von Hochdurchsatz-Sequenzierung Technologien hat große Chancen, kalte reagierende MiRNAs und ihre Beiträge zum Heterograft Vorteile zu untersuchen; geeignete experimentelle Verfahren sind jedoch Voraussetzung für diesen Zweck. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur effizient Erzeugung von Homo- und Heterografts zwischen der Kälte-anfälligen Wassermelone und die Kälte-toleranten Flaschenkürbis, neben Gewebe Probenahmeverfahren, Datengenerierung und Datenanalyse. Die vorgestellten Methoden eignen sich auch für andere Pflanze-Pfropfen Systeme, MiRNA Vorschriften unter verschiedenen Umwelteinflüsse wie Hitze, Trockenheit und Salzgehalt zu befragen.

Einleitung

Pfropfung wurde lange als eine landwirtschaftliche Technik eingesetzt, um pflanzliche Erzeugung und Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Stress1,2,3zu verbessern. In Heterografting Systemen können Elite Wurzelstöcke Wasser und Nährstoffe Aufnahme von Pflanzen erhöhen, verstärken Resistenz gegen pathogene Boden und Begrenzung die negativen Auswirkungen der Metall-Toxizität4,5, die die Transplantate eine erweiterte verleihen kann Wachstum, Vitalität und erhöhte Toleranz gegenüber Umweltbelastungen. In vielen Fällen kann Heterografting auch Obst Qualitäten im Gartenbau Pflanzen führt zu verbesserten Fruchtgeschmack und erhöhten Gehalt von gesundheitsbezogenen Verbindungen6,7auswirken. Es wurde festgestellt, dass der Fernverkehr Transfer von Phytohormonen, RNAs, Peptide und Proteine zwischen der Unterlage und dem Spross ein grundlegender Mechanismus modulieren das Wachstum und die Entwicklung Umprogrammierung der Spross Pflanzen8,9 ,10. Pfropfen hat in Studien der Fernverkehr Signal- und Transport in Bezug auf umweltgerechte Anpassung11verbreitet wurde. Pfropfen Experimente sind besonders leistungsfähig für eindeutige Erkennung der übertragenen Moleküle bei der Aufnahme von Gewebe oder vaskulären Sap und Aktivierung oder Unterdrückung von molekularen Zielstrukturen durch Signal Übertragung12.

Eine Rolle bei der Erleichterung der Anpassung der Anlage an abiotischem Stress13wurden nicht-kodierende RNAs, eine große Klasse von RNA, die wichtige regulatorische Funktionen in Zellen ausüben gemeldet. MiRNAs sind endogen kleine nicht-kodierende RNAs von ca. 20-24 nt. Untersuchungen ergaben die regulierende Rolle von MiRNAs in verschiedene Aspekte der Pflanze Aktivitäten, so wie Wachstum, schießen seitlich Wurzel Bildung14,15,16, Nährstoffaufnahme, Sulfat-Stoffwechsel und Homöostase17, und Antworten zu biotischen und abiotischen stress18. Vor kurzem, der Ausdruck von MiRNAs und ihre Zielgene betrafen Stresstoleranz heterografted Gurke Sämlinge19Salz. In der intervariety Transplantationen von Trauben die Reaktionen der MiRNA Ausdruck auf Trockenstress erwiesen sich Genotyp-abhängige20.

Die rasante Entwicklung und sinkenden Kosten der Hochdurchsatz-Sequenzierung Technik haben eine große Chance für das Studium der MiRNA Vorschriften in agronomische Anlagen zur Verfügung gestellt. Wassermelone (Citrullus Lanatus [Thunb.] Mansf.), eine wichtige Cucurbit Ernte angebaut wird überall auf der Welt ist anfällig für niedrige Temperaturen. Flaschenkürbis (Lagenaria Siceraria [Molina] (Standl.) ist ein widerstandsfähiger Klima Cucurbit üblicherweise von Landwirten mit Wassermelone zu verpflanzen. Das primäre Ziel der aktuellen Studie soll einen Standard, effiziente und bequeme Methode zur Herstellung von Heterografts zwischen Wassermelone (Citrullus Lanatus [Thunb.] Mansf.) und Flaschenkürbis (Lagenaria Siceraria [Molina] Standl). Dieses Protokoll bietet auch eine detaillierte Regelung experimentelle und analytische Verfahren für die Untersuchung der Regulierung von MiRNA Ausdrücke nach Transplantation, die eignet sich für die Entdeckung der Mechanismen, die Heterografting Vorteile.

In dieser Studie verwendeten Anlage gehören die Wassermelone Sorte und der Flaschenkürbis Landrasse. Wassermelone Sorte ist eine kommerzielle Sorte mit hohem Ertrag aber anfällig für niedrige Temperaturen. Flaschenkürbis Landrasse ist eine beliebte Unterlage für Pfropfen mit Wassermelone, Gurke und Flaschenkürbis, durch seine sehr gute Verträglichkeit von niedrigen Temperaturen21.

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Protokoll

1. Samen Sie Sterilisation und Keimung

  1. Einweichen Sie Oberfläche Sterilisation der Flaschenkürbis Samen in einen 500-mL-Becherglas gefüllt mit Wasser bei 58 ° C mit gelegentlichen rühren, bis die Wassertemperatur auf 40 ° C sinkt.
  2. Unterdessen setzen 3 kg der Torfboden in einer Nylontasche und sterilisieren, Autoklaven es bei 120 ° C/0.5 MPa für 20 Minuten.
  3. Halten Sie Einweichen der Flaschenkürbis Samen für 4-5 Std. mehr mit nicht gerührt.
    1. Sobald das Wasser Zimmertemperatur erreicht, spülen Sie die Samen 2 x - 3 X mit destilliertem Wasser ab.
    2. Das überschüssige Wasser abgießen und die Samen sprießen in Gazebeutel bei 28 ° C in einer Kammer Wachstum im Dunkeln zu ermöglichen.
    3. Nach der Keimung die Saat in Kunststoff-Töpfe (6 cm Durchmesser) gefüllt mit sterilisierten Torfboden.
  4. Wenn die Sämlinge Flaschenkürbis zwei abgeflachten Keimblätter entwickelt haben, wiederholen Sie Schritte 1.1-1.3 mit Wassermelone Samen.
    Hinweis: Diese Zeit-Management sorgt dafür, dass die Größen der Spross und Unterlage für erfolgreiche Transplantation übereinstimmen.

(2) Wachstum des Keimlings und Veredelung

  1. Wachsen Sie die Keimlinge in einer Wachstums-Kammer mit einem dunklen Zyklus von 16 h Licht /8-h halten die Temperatur bei 28 ° C tagsüber (Licht) und bei 22 ° C in der Nacht (dunkel). Spülen Sie die Sämlinge durch Zugabe von Wasser 1 x pro Tag am späten Nachmittag.
  2. Verwenden Sie die Schnitt-Pfropfen Methode22 , Heterografts zu machen, wenn die Sämlinge der Flaschenkürbis (Wurzelstock) auf einen True-Blatt-Stadium und die Keimblätter der Wassermelone (Spross) (noch nicht abgewickelten) entstanden.
    1. Schneiden Sie die Hypocotyle der Wassermelone Sämlinge an 2-3 cm unterhalb der Keimblätter und der Spitze der Flaschenkürbis Sämlinge am Standort unmittelbar über den wahren lässt.
    2. Verwenden Sie einen Zahnstocher, um ein Loch in der Spitze der getrimmte Flaschenkürbis Sämlinge bilden. Legen Sie die gestutzten Wassermelone Sämlinge in die Löcher der Flaschenkürbis Sämlinge, Heterografts zu machen.
  3. Verwenden Sie eine ähnliche Methode wie in Schritt 2.2 vorgestellt, um Homografts zu machen.
    Hinweis: Homo- und Heterografting-Kombinationen sollte immer erfolgen gleichzeitig (Abbildung 1), die, in diesem Fall ergibt sich im folgenden: Wassermelone/Flaschenkürbis (WB, Heterograft), Watermelon/Wassermelone (WW, Homograft) und Flaschenkürbis /bottle Kürbis (BB, Homograft).

figure-protocol-1
Abbildung 1: Abbildung der Transplantat-Kombinationen und die veredelten Pflanzenstrukturen. WB = Wassermelone/Flasche Kürbis Heterografting; WW = Watermelon/Wassermelone Homografting; BB = Flaschenkürbis/Flasche Kürbis Homo-Pfropfen; WB-S = Spross Blätter von der Wassermelone/Flasche Kürbis-Heterografts, die abgetastet wurden; WB-R = Wurzelstock Blätter von der Wassermelone/Flasche Kürbis-Heterografts, die abgetastet wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

3. Management, Kältebehandlung, postgrafting und Probenahme

  1. Versetzen die verpflanzte Sämlinge mit transparenten Polyethylen-Beutel zu halten eine relativ hohe Luftfeuchtigkeit und pflegen sie für 7D unter Umweltbedingungen von 16 h Licht/8-h dunkel Zyklen, wobei die Temperatur bei 28 ° C tagsüber (Licht) und bei 22 ° C während der Nacht (dunkel).
  2. Entdecken Sie die transparente Polyethylen-Beutel am 7. Tag. Lassen Sie die Pflanze für eine zusätzliche 7-10 Tage unter den gleichen Bedingungen.
  3. Teilen Sie die gesunde einheitliche Sämlinge in zwei Gruppen, eine für Kältebehandlung (betont) und eine für die Steuerung (betont). Verlassen Sie für die Kontrollgruppe die Sämlinge in derselben Kammer Wachstum (bei 28 ° C) für weitere 48 h, während für die Kälte-betonte Gruppe zu, übertragen Sie die Sämlinge zu einer Wachstums-Kammer mit einer konstanten Temperatur bei 6 ° C, hell/dunkel-Bedingungen zu, wie in Schritt beschrieben 2.1.
  4. Probieren Sie die Blätter der Scion und die Unterlage aus der Grafts (Abbildung 1). Die Proben sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-70 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.

(4) Bibliothek Vorbereitung und Hochdurchsatz-Sequenzierung

  1. Die gefrorenen Proben zu einem 2-mL Microcentrifuge Schlauch in flüssigem Stickstoff zu übertragen.
  2. Jedes Rohr mit den Geweben fügen Sie eine Perle aus rostfreiem Stahl (5 mm Durchmesser hinzu).
  3. Homogenisieren der Gewebe zu einem feinen Pulver mit einer Perle Mühle Homogenisator für 30 s.
  4. Nehmen Sie für jede Pfropfen Kombination gleiche Mengen (0,1 g) Boden-Probe von zehn Sämlinge und mischen sie in einer 10 mL Zentrifugenröhrchen. Hinzufügen einer entsprechenden Menge an Guanidium Hydrochlorid Reagenz (Table of Materials) auf der Grundlage des Herstellers Vorschläge, das Gewebe Gewicht entspricht.
    1. Entfernen von genomischer DNA-Kontaminationen durch Zugabe von RNA-freie DNase I bis 150 U/mL bei 37 ° C für 1 h.
  5. Entscheidung über die insgesamt RNA-Menge auf ein Microcapillary Elektrophorese System für die RNA-Integrität gewährleisten Nummer > 7.0.
    Hinweis: RIN > 7.0 sorgt für eine hohe Integrität der RNA-Proben.
  6. Bereiten Sie kleine RNA-Bibliotheken mithilfe eines kommerziellen Kits (Table of Materials) entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Verwenden Sie 1 µg Gesamt-RNS pro Probe um zu initiieren.
    1. Tauwetter Bibliothek Normalisierung Reagenzien und Adapter nach den Richtlinien des Herstellers. Kleinen RNAs mit 5 ' und 3 '-Adapter verbinden und eluieren und sie zu reinigen. Dann umgekehrt die 5′ transkribieren und 3' ligiert kleinen RNAs, die nach den Richtlinien des Herstellers.
    2. Durchführen Sie PCR-Amplifikation gemäß Protokoll des Herstellers. Beurteilen Sie die Qualität und Quantität der cDNA-Bibliotheken, die mit einem Microcapillary-Elektrophorese-System.
    3. Laden 1 µL einer RNA-Bibliothek auf einem Microcapillary Elektrophorese System um sicherzustellen die RIN > 7.0.
  7. Die kleine RNA-Bibliotheken auf einem Instrument von Hochdurchsatz-Sequenzierung an anderer Stelle beschriebenen23-Sequenz.

5. MiRNA und Target Gen Vorhersage

  1. Verwenden Sie für jede Pfropfen Kombination die open-Source UEA sRNA Werkbank 2,4-Anlage Version24 , minderwertige Sequenzen zu entfernen und um Adapter Sequenzen aus der rohen liest zu trimmen. Sequenzen, die kleiner als 18 Jahre sind zu verwerfen nt oder größer als 32 nt.
  2. Die qualitativ hochwertigen "sauberen" Sequenzen auf die open-Source Rfam 11.0-Datenbank zu erkennen und zu entfernen, liest der rRNA, tRNA, SnoRNA und anderen SnRNAs zu vergleichen.
  3. Richten Sie die verbleibenden Lesezugriffe auf die Referenz-Genome mit einem kurzen lesende Sequenz Ausrichtung Tool25. In diesem Schritt darf keine stimmen nicht überein.
    Hinweis: Die Wassermelone "97103" Genom Versammlung V126 für die Angleichung an die liest aus dem Spross verwendet wurde, und der Flaschenkürbis "HZ" Genom Versammlung V127 wurde für liest aus dem Wurzelstock verwendet.
  4. Vergleichen Sie die restlichen liest gegen bekannte Reifen MiRNAs in der open-Source MiRBase 22,028. Lesevorgänge, die homolog zu bekannten MiRNAs sind werden als konservierte MiRNAs klassifiziert.
  5. Vergleichen Sie die Sequenzen, die nicht die bekannten MiRNA-Vorläufer mit der Genomsequenz überein. Verwenden Sie die MIREAP29 Algorithmus, um potenzielle neuartige MiRNAs bei Standardeinstellungen zu erkennen.

(6) differentielle Expression und Gene Ontology-Analyse

  1. Vergleichen Sie die Ausdruck-Ebenen der MiRNAs basierend auf ihre lesen Sie zählt. MiRNAs mit einem P-Wert (Fishers exakter Test) < 0,05 und eine absolute Log2 Wert > 2 gelten differenziell ausgedrückt werden.
  2. Verwenden Sie eine antisense-Oligonukleotid Ziel Website Auswahl Werkzeug (TargetFinder)30 mögliche ergänzende mRNAs (MiRNA Zielgene), die differentiell exprimierten MiRNAs unter Standardparameter vorherzusagen.
  3. Verwenden Sie die gen-Ontologie (gehen) Bereicherung analytisches Werkzeug31 , MiRNA Ziel Gene Ontology (gehen Sie) offenbaren Muster unter einer P- Schwellenwert von 0,05 für statistische Signifikanz.

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Ergebnisse

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Abbildung 2: Phänotypen von verschiedenen Transplantate bei Raumtemperatur und kalten betonte Bedingungen. (ein) zeigt dieses Panel Homo- und heterografted Sämlinge bei Raumtemperatur als Kontrolle. (b) zeigt dieses Panel Homo- und heterografted Sämlinge nach 48 h der Kältebehandlung.

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Diskussion

In diesem Protokoll beschrieben wir eine hoch effiziente und reproduzierbare Methode um Homo- und Heterografts zwischen Wassermelone und Flaschenkürbis ausführlich. Diese Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung ist sehr einfach zu bedienen und hat in der Regel eine sehr hohe Überlebensrate der Pfropfung. Die Methode kann auch verwendet werden, zu Transplantationen für andere Kürbisgewächse, wie z. B. zwischen Wassermelone, Gurke und Kürbis.

Es ist erwähnenswert, dass die relative Größe (A...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben. Die kleine RNA Sequenzierungsdaten lagert sich in der GenBank unter Zbl-Nummer SRP136842.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (31772191), das Forschungsprojekt für öffentliche Interesse in der Provinz Zhejiang (2017 C 32027), die Schlüssel Science Projekt der Pflanzenzüchtung in Zhejiang (2016 C 02051) und das nationale Programm für unterstützt. die Unterstützung von erstklassigen Young Professionals (zu P.X).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
TRIzol ReagenzInvitrogen15596026
RNA-frei DNase ITakaraD2270A
Truseq Kit zur Vorbereitung kleiner RNA-ProbenIlluminaRS-200-0012
2100 BionalyserAgilent5067
DNA-PolymeraseThermo Fisher ScientificF530S
UEA sRNA-Werkbank 2,4-Pflanzen-Version  (Software)NANAhttp://srna-workbench.cmp.uea.ac.uk/
Rfam 11.0 Datenbank ( website)NANAhttp://rfam.janelia.org
miRBase 22.0 ( website)NANAhttp://www.mirbase.org/
MIREAP(software)NANAhttps://sourceforge.net/projects/mireap/
TargetFinder ( software)NANAhttp://targetfinder.org/

Referenzen

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