Methodenartikel

Humanisierten NOD/SCID/IL2rγnull (Hu-NSG) Maus-Modell für HIV-Replikation und Latenz-Studien

DOI:

10.3791/58255

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7. Januar 2019

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1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell and Manela Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll stellt eine Methode zum humanisierten Mäuse (Hu-NSG) schaffen über intrahepatischen Injektion von humanen hämatopoetischen Stammzellen in Strahlung bedingt neonatale NSG Mäuse. Die Hu-NSG-Maus ist anfällig für HIV-Infektion und kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART) und dient als ein geeignetes pathophysiologischen Modell für HIV-Replikation und Latenz-Untersuchungen.

Zusammenfassung

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Ethischen Vorschriften und technischen Herausforderungen für die Forschung in menschliche Pathologie, Immunologie und therapeutische Entwicklung haben kleiner Tiermodelle in der hohen Nachfrage gelegt. Mit einer genetischen und Verhaltensstörungen Ähnlichkeit mit Menschen sind kleine Tiere wie der Maus gute Kandidaten für menschliche Krankheitsmodelle, durch die menschlich-wie Symptome und Antworten zusammengefaßt werden können. Darüber hinaus kann Maus genetischen Hintergrund geändert werden, um unterschiedlichen Anforderungen gerecht. Die NOD/SCID/IL2rγnull (NSG) Maus ist eines der am weitesten verbreitete immungeschwächten Mausstämme; Es ermöglicht Engraftment mit humanen hämatopoetischen Stammzellen und/oder menschlichem Gewebe und die anschließende Entwicklung eines funktionellen menschlichen Immunsystems. Dies ist ein entscheidender Meilenstein in der Prognose und Pathophysiologie des Mensch-spezifische Krankheiten wie HIV/AIDS zu verstehen und unterstützen die Suche nach einem Heilmittel. Hier berichten wir über ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von einem humanisierten Mausmodell der NSG (Hu-NSG) von hämatopoetischen Stammzelltransplantation in eine Strahlung bedingt neonatale NSG Maus. Die Hu-NSG-Maus-Modell zeigt Multi-Linie Entwicklung der transplantierten Stammzellen und die Anfälligkeit für virale Infektion HIV-1. Es fasst auch wichtige biologische Eigenschaften als Reaktion auf kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART).

Einleitung

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Denn Festlegung geeigneter Tiermodelle für menschliche Krankheiten Schlüssel zur Suche nach einem Heilmittel, wurden entsprechende Tiere Modelle lange verfolgt und im Laufe der Zeit verbessert. Mehrere Stämme von immungeschwächten murinen Modelle wurden entwickelt, die das Engraftment von menschlichen Zellen bzw. Gewebe und die anschließende Ausführung von humanisierten Funktionen1,2zulassen. Solchen humanisierte Mausmodelle sind entscheidend für Untersuchungen von Mensch-spezifische Krankheiten3,4,5.

Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) durch Infektion mit dem Human Immunodeficiency Virus (HIV) ist ein Beispiel. Vor der Gründung der humanisierte Mausmodelle beschränkt ethischen und technische Einschränkungen HIV/AIDS präklinische tierexperimentellen Studien an nicht-humanen Primaten3. Allerdings behindern die hohen Kosten und Anforderungen für Spezialbehandlungen für solche Tier HIV/AIDS Studien in typischen akademischen Umfeld. Vor allem HIV infiziert menschliche CD4 + T-Zellen und wirkt sich auf die Entwicklung und die Immunantwort von anderen menschlichen Immunzellen wie B-Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen6; gefragt sind daher kleiner Tiermodelle mit funktionalen menschlichen Immunsystem transplantiert.

Einen Durchbruch im Jahr 1988, als CB17 -scid -Mäuse mit einer Prkdcscid -Mutation entwickelt wurden und zeigte erfolgreiche Engraftment des menschlichen Immunsystems1. Der Prkdcscid -Mutation resultiert Defekte T - und B-Zell-Funktionen und eine Ablation adaptiven Immunsystems bei Mäusen, wodurch das Engraftment des menschlichen peripheren Mononukleäre Zellen (PBMCs), hämatopoetischen Stammzellen (HSCs), Blut und fetalen hämatopoetischen Geweben7,8. Dennoch werden geringe Mengen an Engraftment häufig in diesem Modell beobachtet; mögliche Ursachen sind 1) verbleibende angeborene Immunaktivität moduliert über natürliche Killer (NK)-Zellen und (2) der späten Entwicklung der Maus T - und B-Zellen (Undichtigkeit)5. Die spätere Entwicklung der nicht-adipösen Diabetiker (NOD)-scid -Maus-Modell erreicht dramatische Down-Regulierung von NK-Zell-Aktivität; so ist es in der Lage, ein höheres Niveau und weitere nachhaltige Engraftment des menschlichen Immunsystems Komponenten9zu unterstützen. Weiter zu unterdrücken oder hemmen die Entwicklung der angeborenen Immunität, Maus-Modellen (NOD) abschneiden oder total KO von Interleukin-2 Rezeptor γ-Kette (Il2rg) eingedenk -scid Hintergrund entstanden. Il2rg, auch bekannt als gemeinsame Zytokin-Rezeptor γ-Kette, ist ein unverzichtbarer Bestandteil von verschiedenen Zytokin-Rezeptoren10,11,12,13. Stämme wie NICKEN. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) und NODShi.Cg -PrkdcscidIl2rgtm1Sug (NOG) präsentieren Sie robuste Störung der Maus Cytokine signaling und vollständige Abtragung der NK-Zell-Entwicklung, Zusätzlich zu schwerer Beeinträchtigung der adaptiven Immunität14,15,16.

Drei humanisierte Mausmodelle trägt ein scid -Mutation und Il2rg Knockout werden häufig eingesetzt, in HIV/AIDS-Forschung: der BLT (Knochenmark, Leber, Thymus) Modell, das PBL (periphere Blut Leukozyten) Modell und das SRC (SCID Repopulating Zelle) Modell 3. der BLT-Modell wird über chirurgische Transplantation von menschlichen fetalen Leber und Thymus unter der Maus Niere Kapsel begleitet mit intravenöser Injektion der fetalen Leber HSCs3,17,18erstellt. Die BLT-Maus-Modell bietet hohe Engraftment Wirksamkeit, Entwicklung menschlicher hämatopoetischen Zellen in allen Linien und Etablierung eines starken menschlichen Immunsystems; Zusätzlich T-Zellen sind in einem menschlichen autologen Thymus ausgebildet und weisen HLA-eingeschränkten Immunantwort4,5,17,19. Die Forderung nach chirurgischen Eingriffen bleibt jedoch den großen Nachteil das BLT-Modell. Die PBL-Maus-Modell wird durch intravenöse Injektion mit menschlichen peripheren lymphatischen Zellen aufgebaut. Das PBL-Modell bietet Komfort und erfolgreiche T-Zell-Engraftment ergibt, aber seine Anwendung ist begrenzt aufgrund unzureichender B-Zell und myeloische Zellen Engraftment, niedrige Engraftment Ebenen insgesamt und das Auftreten von schweren Graft - Versus - Host-Seuche (GVHD)3 ,20. Die SRC-Maus-Modell wird durch Injektion von menschlichen HSCs in Neugeborenen oder jungen Erwachsenen SCID Mäuse hergestellt. Es weist durchschnittliche Engraftment Effizienz über 25 % (gemessen als peripheren Blut CD45 Prozentsatz) und unterstützt die Entwicklung der Multiple-Linie des injizierten HSCs und die Ausarbeitung eines angeborenen menschlichen Immunsystems. Die Beschränkung der SRC-Modells ist jedoch, dass die T-Zell-Antwort ist Maus H2 statt menschliche HLA-eingeschränkten14,21beschränkt.

Die SRC-Maus-Modell gilt als einfache und zuverlässige Vorbild für präklinische HIV/AIDS kleine Tierstudien, veranschaulicht durch die konsequente Engraftment eines menschlichen Immunsystem und erfolgreiche hämatopoetischen Entwicklung. Wir zuvor berichtet die Errichtung einer NSG Hu-SRC-SCID (Hu-NSG) Maus-Modell und seine Anwendung in der HIV-Replikation und Latenz Studien22,23,24beschrieben. Diese Hu-NSG Mausmodell weist hohe Knochenmark Homing, Anfälligkeit für eine HIV-Infektion und Reprise der HIV-Infektion und Pathogenese. Darüber hinaus die Hu-NSG-Maus-Modell reagiert angemessen auf kombinatorische antiretrovirale Therapie (cART) und rekapituliert Plasma viralen Rebound nach Warenkorb Zurücknahme, bestätigt die Gründung einer HIV Latenz Reservoir25,26 ,27. Diese HIV-Latenz-Reservoir ist weiter durch die Produktion von Replikation-kompetente HIV Viren Ex Vivo induziert durch menschliche ruhenden CD4 + T-Zellen isoliert von infizierten und Wagen behandelt Hu-NSG Mäuse belegt.

Hier beschreiben wir das ausführliche Protokoll für Einrichtung von Hu-NSG-Maus-Modell von Neugeborenen NSG-Mäusen, einschließlich der Verfahren im Zusammenhang mit HIV-Infektion und Karren Behandlung für Latenz-Entwicklung. Wir erwarten, dass dieses Protokoll eine Reihe neue Ansätze in HIV tierexperimentellen Studien bezüglich HIV Virologie, Latenz und Behandlung anbieten.

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Protokoll

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Alle Tierpflege und Verfahren wurden nach Protokollen überprüft und genehmigt durch die Stadt der Hoffnung institutionelle Tier Pflege und Nutzung Committee (IACUC) im Besitz der principal Investigator der Studie (Dr. John Rossi, IACUC #12034) durchgeführt. Menschlichen fetalen Lebergewebe wurde von Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA), eine gemeinnützige Organisation, Bundes- und einzelstaatlichen Vorschriften erhalten. Der Lieferant hat seine eigenen institutionellen Review Board (IRB) und ist kompatibel mit menschlichen Subjekts Schutzanforderungen. Menschlichen PBMCs sind isoliert aus ausrangierten peripherem Blutproben von anonymen gesunden Spendern von City of Hope Blood Donor Center (Duarte, CA), mit keine Kennzeichnung bezüglich Alter, Rasse, Geschlecht oder ethnischer Zugehörigkeit. IRB #/ REF #: 97071/075546

1. aseptische Allgemeinmedizin

  1. Durchführen Sie Gewebekultur Experimente in den dafür vorgesehenen Laminar-Flow Schränken.
  2. Gewebekultur Medium und Ergänzungen unter sterilen Bedingungen halten und Filtern mit 0,22 µm Filtrierung Einheit Prior um zu verwenden.
  3. Bewahren Sie vorbereitete menschlichen HSCs in sterilen Röhrchen zu und auf Eis bis Injektion.
  4. Als Folge der schweren Immunschwäche behandeln Sie NSG Mäuse aseptisch. Tragen Sie ein Einweg-Chirurgie-Kleid, Haare Kappe, Gesichtsmaske, Überschuhe und Handschuhe um Kontaminationen zu vermeiden. Desinfizieren Sie die Arbeitsfläche, Bestrahlung Halter und Induktion Kammer für Anästhesie mit Chlor Dioxid Basis Sterilisationsmittel (z.B.Clidox), vor und nach der Experimente.
  5. Auftragen Sie Erdöl-basierten Augensalbe nach Retro-Orbital Blutungen um zu verhindern, dass trockene Augen.
  6. Ändern Sie auf Antibiotika-haltige Ernährung zur Vorbeugung von Infektionen durch Retro-Orbital Blutungen.

2. Umgang mit HIV-Virus infizierten Nagetieren und Virus-haltigen Blut/Gewebeproben

Achtung: HIV ist ein Klasse 3 menschliche Krankheitserreger; die Umgang mit Regeln müssen genau befolgt werden.

  1. HIV Virus-haltigen Proben in einer dafür vorgesehenen BSL2 Griff + / 3 Laborfläche. Virus-haltigen Reagenzien sicher in einem sekundären Behälter während des Transports zu sperren. Desinfizieren Sie die äußere Oberfläche aller Container durch gründlich abwischen mit 10 % Bleichmittel und Isopropanol vor dem Transport.
  2. Halten Sie alle Virus-haltige Abfälle in die dafür vorgesehenen Abfallbehälter mit 2-3 Schichten von biogefährlichen Müllbeutel. Desinfizieren Sie vor der Entsorgung durch großzügig besprühen die Abfälle mit Jod/Ethoxylated Nonylphenol Lösung (z.B. Wescodyne) und Autoklaven.
  3. Persönlichen Schutzausrüstung zu tragen: Haare Kappe, Gesicht zu bedecken, Spritzschutz Gesichtsschutz, Überschuhe, Einweg-Chirurgie Kleid und Doppelschicht-Handschuhe.
  4. Infizierten Nagetieren mit äußerster Vorsicht zu behandeln. Durchführen Sie Injektionen und Blut Sammlungen, während Mäuse unter Narkose (Schritte 5.1-5.2, 6,3-6,5, 7.3 und 8.1-8.2) sind.

3. Isolation von hämatopoetischen Stammzellen

  1. Gewebe-Verdauung Kollagenase/Dispase Lösung vorbereiten.
    1. Lösen Sie Kollagenase/Dispase Pulver in einer Konzentration von 100 mg/mL Stammlösung zu, und speichern Sie Kollagenase/Dispase-Stammlösung in 150 µL-Aliquots bei-20 ° C.
    2. Verdünnen Sie für die Arbeit Kollagenase Lösung 150 µL Kollagenase/Dispase Lager mit 15 mL RPMI 1640 mit 10 % FCS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
      Hinweis: Die Endkonzentration von Kollagenase/Dispase für Gewebe Verdauung ist 1 mg/mL.
  2. Geschnitten Sie mit einer sterilen Rasierklinge fetale Lebergewebe (16-24 Wochen Schwangerschaft) in kleine Stücke (ca. 2-3 mm3 in der Größe) gefolgt von Verdauung mit Kollagenase/Dispase Lösung (1 mg/mL) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Lautstärke der Aufschlusslösung, sodass alle Gewebe Stücke vollständig eingetaucht sind. Verwenden Sie das hintere Ende der Spritzenkolben vorsichtig Schleifen die Gewebeprobe um die Verdauung zu erleichtern.
  3. Durchlaufen Sie die Verdauung Mischung eine 70 µm sterile Nylon Siebfilter, eine einzelne Zelle Aussetzung zu erwerben.
  4. CD34 + HSCs mit einem Mac-System pro Anweisungen des Herstellers zu bereichern.
  5. Zählen Sie den lebensfähigen Prozentsatz der angereicherten CD34 + HSCs mit einem Hemacytometer28 und fahren Sie mit intrahepatischen Injektion in Neugeborenen NSG Mäuse.
  6. Frieren Sie der verbleibenden angereicherten CD34 + HSCs in Medien (z. B.CryoStor CS2) Einfrieren ein und konservieren Sie Zellen in einem flüssigen Stickstoff-Tank. Erzählen Sie bei der zukünftigen Verwendung die tragfähigen Prozentsatz der aufgetauten CD34 + HSCs vor der Injektion. Mit dem Einsatz des Einfrierens Medien ist nach dem Tauwetter-Lebensfähigkeit zwischen 80 bis 90 %.

(4) intrahepatischen Injektion von menschlichen CD34 + HSCs bei Neugeborenen NSG Mäusen

Hinweis: Neonatale NSG Mäuse sind 2-3 Tage von der Geburt am besten geeignet für dieses Verfahren sind stark genug, um die Bestrahlung bei halb-tödliche Dosis, während jung genug, um völlig Immunsystem beeinträchtigt zu ertragen. Keine Anästhesie ist erforderlich für die HSC-Injektion.

  1. Legen Sie die ganze Wurf von Neugeborenen NSG-Mäusen (in der Regel 5 bis 10 Mäuse, beide Geschlechter) in einem sterilen Kuchen-förmigen Bestrahlung Käfig und setzen Sie eine Gesamtdosis von 200-250 cGy Gammastrahlen-Strahlung aus einer Strahlungsquelle Cäsium-137. Gewährleisten Sie, dass die Strahlendosis innerhalb des Bereichs liegt, da erheblichen Gewichtsverlust oder sogar zum Tod beobachtet werden kann als NSG Mäuse, hochdosierte Bestrahlung ausgesetzt sind. 12
    Hinweis: Strahlung ist eine Gefahr für die Gesundheit, persönlichen Strahlenschutz getroffen werden.
  2. Nach Bestrahlung, Spritzen jeder Neugeborenen NSG-Maus mit 5 x 105 lebensfähigen menschlichen CD34 + HSCs mit einer Spritze/Nadel-Setup (Abbildung 1). Injizieren Sie Zellen in der Leber direkt.

5. Engraftment Validierung durch Retro-Orbital Blutungen und Flow Cytometry Analysis

  1. 10-12 Wochen Post-HSC-Injektion betäuben Sie Mäuse verwenden ein Isofluran/Sauerstoff-Inhalation-Apparat. Passen Sie die Sauerstoffzufuhr um Isofluran bei 4-5 % beizubehalten. Betäubung dauert ca. 3-5 Minuten, je nach individuellen Maus. Richtig narkotisierten Mäuse zeigen eine langsame und tiefe Atmung und keine Reaktion auf die Zehe kneifen Stimulation.
  2. Sammeln Sie 50-100 µL des peripheren Blutes aus jeder Maus durch Retro-Orbital Probenahme28. Speichern Sie Blutproben in K2EDTA oder heparinisierten Blutentnahmeröhrchen Gerinnung zu verhindern.
    Hinweis: Blutentnahmeröhrchen sind verpflichtet, blutgerinnungshemmende Beschichtung haben, so dass Maus PBMCs von Vollblut für Flow-Zytometrie Analyse isoliert werden können. EDTA ist bekanntermaßen enzymatische Reaktionen wie PCR und qRT-PCR hemmen; Also, wenn nachgeschaltete enzymatische Reaktionen erforderlich sind, benutzen Sie eine heparinisierten Blut Sammlung Gerät.
  3. Zentrifugieren Sie für 20 Minuten bei 4 ° C zu Blutzellen Pellets Blutproben bei 2.000 x g.
    1. Übertragen Sie die Überstände Plasma nach Zentrifugation und Store bei-80 ° C an neuen Mikrozentrifugenröhrchen, wenn Zytokin Analyse erforderlich ist.
    2. Lyse der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) innerhalb der Blutkörperchen Pellet bei Raumtemperatur für 10 Minuten mit roten Blutzelle Lysis Puffer (Table of Materials).
      Hinweis: Wenn Plasma-Proben nicht erforderlich sind, lysieren Sie direkt Vollblut mit Lyse Lösung ohne Zentrifugation.
  4. Pellet-übrigen Blutzellen nach RBC Lyse bei 300 X g für 5 Minuten bei 4 ° C; den Überstand abgesaugt. Waschen Sie die Zelle-Pellets mit 0,01 % BSA mit DPBS, Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten bei 4 ° C und aspirieren Sie überstand. Wiederholen Sie die Wäsche noch einmal.
  5. Block-Zellen mit 100 µL 1 X blockieren cocktail (Tabelle 3 für Rezept) 20 min bei 4 ° C.
  6. Nach der Blockierung, direkt jeder Antikörperlösung in die Zellsuspension in einer Konzentration von 2 µL/106 Zellen hinzufügen und 30 Minuten bei 4 ° C inkubieren. Antikörper für Engraftment Validierung sind: Anti-Human CD45 (Leukozyten, RRID: AB_2732068), Anti-Human CD3 (T-Zellen, RRID: AB_396896), Anti-Human CD4 (Helfer T-Zellen, RRID: AB_397037), Anti-Human CD8 (zytotoxische T-Zellen, RRID: AB_2722501), Anti-Human CD14 (Monozyten, RRID: AB_10373536), und Anti-Human CD19 (B-Zellen, RRID: AB_10373382). Empfohlene Flow Panel entnehmen Sie bitte Tabelle 4 und Tabelle der Materialien für die Katalognummern, RRIDs und Chargennummern.
    Hinweis: Antikörper Färbung in blocking-Lösung eliminiert unspezifische Bindung der Antikörper Anti-Human in Richtung Maus Oberflächenmarker, als mehrere Oberflächenmarker teilen Homologie zwischen Mensch und Maus.
  7. Isolieren Sie menschlichen PBMCs von gesunden Spendern zu und bereiten Sie Single-gefärbten Flow Cytometry Entschädigung Steuerelemente mit gereinigtem menschlichen PBMCs. Alternativ, verwenden Sie Fluoreszenz-markierten Mikrosphären, als Entschädigung29kontrolliert.
  8. Die peripheren Blutproben mit einem Durchflusszytometer analysieren und den Prozentsatz der menschlichen CD45 + Zellen, CD3 + Zellen, menschlichen CD14 + Zellen und menschliche Zellen CD19 + vom totalen peripheren Blutzellen zu quantifizieren.
    1. Für nachgeschaltete HIV-Infektion und Latenz Studien Berechnung des Prozentsatzes der CD4 + T-Zellen und CD8 + T-Zellen innerhalb der CD3 + Zellen.
      Hinweis: In der Regel wird ein CD4:CD8 Verhältnis zwischen 1,5 und 2,5 vor HIV-Infektion30beobachtet.

6. Analyse der HIV-Infektion von Hu-NSG Mäusen und Plasma-Viruslast mittels qRT-PCR

  1. HIV-BaL virale bestand im menschlichen PBMCs von gesunden Spendern zu propagieren, geerntet am 10. Tag nach der Infektion und titrieren mit p24 ELISA kit31.
  2. Wählen Sie Hu-NSG Mäuse mit mehr als 20 % Zellen menschlichen CD45 + im peripheren Blut HIV-Infektion.
  3. Hu-NSG Mäuse verwenden ein Isofluran/Sauerstoff-Inhalation-Apparat (Schritt 5.1) zu betäuben.
  4. Nach der Bestätigung Tier betäubt ist, injizieren BaL HIV Virus bei einer Dosis von 200 ng von p24 per Mausklick durch intraperitoneale Route.
    Hinweis: Seien Sie extrem vorsichtig mit der Nadel, nicht wiederverwenden Sie, Nadeln, und sofort nach Gebrauch in bestimmten scharfe Behälter entsorgen. Bereich der Injektion nach Virus-Verabreichung zu desinfizieren.
  5. Drei Wochen nach der Infektion, Hu-NSG Mäuse zu betäuben und peripherem Blut durch Retro-Orbital sammeln Blutungen mit heparinisierten Kapillare und Röhrchen.
  6. Separate Plasma und Blutzellen durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 20 Minuten.
  7. Lyse der Erythrozyten. Block und Flecken übrigen Blutzellen mit Antikörpern für Flow-Zytometrie-Analyse (Abschnitt 5.3-5.8).
    Hinweis: Flow-Zytometrie-Analyse sollte im Mittelpunkt CD4:CD8 Verhältnis zu vergleichen, vor und nach der Infektion. Signifikante Abnahme der CD4 + Zellzahl wird erwartet, da die CD4 Antigen dient als ein Ko-Rezeptor für virale Eintrag.
  8. Verwendung Plasma-Proben zu analysieren, das HIV Virus laden mittels qRT-PCR. Virale RNA von Plasmaproben mit einem viralen RNA Mini-Kit zu isolieren. Führen Sie qRT-PCR mit HIV-1 LTR-spezifische Primer und Sonde setzt (Sequenz Details in Tabelle 5), Protokoll des Herstellers verwenden.

7. orale Verabreichung von cART und Validierung der virale Suppression (optional)

Hinweis: Dieser Schritt ist optional für Untersuchungen zur HIV-Prognose, Virologie oder Infektion-bezogenen Pathophysiologie während der akuten Infektionsphase. Warenkorb-Behandlung von HIV-infizierten Hu-NSG wird verwendet, um HIV-Latenz bei menschlichen Patienten, die Karre zu rekapitulieren. Hu-NSG erfolgreich HIV-infizierte Mäuse sind Warenkorb für 4 Wochen gegeben. Die Warenkorb-Therapie besteht aus Tenofovir Disoproxil Fumarat (TDF, 300 mg/Kapsel), Emtricitabin (FTC; 200 mg/Kapsel) und Raltegravir (RAL; 400 mg/Kapsel). Die Dosis von Wagen für die Behandlung von HIV-infizierten Hu-NSG Mäuse ist je nach Körper Fläche (Tabelle 1, Formel 1, Tabelle 2)32angepasst.

  1. Berechnen Sie die Höhe der jedes Medikament für jeden Käfig während einer Woche der Behandlung, unter Berücksichtigung der Volumen der Flasche Wasser, die Anzahl der Mäuse in jedem Käfig und einer durchschnittlichen täglichen Wasseraufnahme von 4 mL pro Maus erforderlich.
    Hinweis: Der entscheidende Punkt in diesem Schritt soll sicherstellen, dass jede Maus seine tägliche Dosis innerhalb von 4 mL Trinkwasser erwirbt.
  2. Alle drei Medikamente mit angepassten Dosen zu feinen Pulver mahlen und löst die Pulvermischung in gesüßtem Wasser (z. B. Medidrop Suralose). Ändern Sie die Flasche Wasser jede Woche mit frisch gelöster Warenkorb Cocktail in gesüßtem Wasser geliefert.
    Hinweis: Das Medikament Pulver kann nicht sofort auflösen, kräftig schütteln, um eine homogene Suspension zu erreichen, bevor Sie wieder die Flasche an den Käfig halten.
  3. Sammeln Sie peripheren Blutproben über Retro-Orbital Blutungen alle zwei Wochen und analysieren Sie sowohl das CD4:CD8 Verhältnis mittels Durchflusszytometrie (Abschnitt 5.3-5,8) und der Plasma-Viruslast mittels qRT-PCR (Ziffer 6.6).
    Hinweis: In der Regel nach 4 Wochen der Behandlung, die Plasma-Viruslast sinkt auf unter der Nachweisgrenze und eine typische CD4:CD8-Verhältnis wird wiederhergestellt.

8. Bewertung der viralen Rebound auf Warenkorb Widerrufsrecht (optional)

Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend für die Validierung der Latenz-Modells, da viralen Rebound nach Zurücknahme der Warenkorb direkte Beweise für eine Latenz-Reservoir bietet. Es wird auch empfohlen, als ein Kontrollexperiment für therapeutische Untersuchungen auf HIV Rebound Suppressants dienen.

  1. Planen Sie für den Warenkorb Rückzug nach Plasma-Viruslast aus peripherem Blutproben unterhalb der Nachweisgrenze sind und das CD4:CD8 Verhältnis in einem Bereich zwischen 1,5 und 2,5 wiederhergestellt wird.
  2. Sammeln Sie peripheren Blutproben durch Retro-Orbital Blutungen alle 2 Wochen nach Abzug der Warenkorb. Verfolgen Sie die Änderung im Plasma-Viruslast (Ziffer 6.6) sowie das CD4:CD8 Verhältnis (Abschnitt 5.3-5.8).

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Ergebnisse

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Flow-Zytometrie-Analyse wird häufig durchgeführt, um die Reinheit der isolierten HSCs zu validieren, Engraftment Ebenen, Profil Immunantwort auf virale Infektion, zu bewerten und Übersicht Warenkorb Wirksamkeit. Eine typische Antikörper-Panel enthält 4-6 individuelle Eindringmittel beschriftete Antikörper; Daher ist ein Durchflusszytometer mit mehreren Lasern und eine große Auswahl an Filter entscheidend, um genaue Ergebnisse zu erzielen.

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Diskussion

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Immungeschwächte Mäuse mit menschlichen Zellen/Gewebe pfropfte menschenähnliche physiologische Merkmale aufweisen und einen enormen Wert für Pathologie, Pathophysiologie und Immunologie Studien zur Mensch-spezifische Krankheiten sind. Unter mehreren Stämmen immungeschwächte Mäuse, den Zuschlag. CG -PrkdcscidIl2rgtm1Wji (NSG) Modell ist die am meisten immungeschwächte aufgrund seiner mangelnden angeborenen und der adaptiven Immunität sowie abgetragene Maus-spezifischen Cytokine signaling

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Offenlegungen

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Die Autoren Interessenkonflikte keine.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Institutes of Health [gewähren, J.J.R. Zahlen, R01AI29329, R01AI42552 und R01HL07470] und National Cancer Institute der National Institutes of Health [Grant-Nummer P30CA033572, Stadt der Hoffnung Integrative Genomics zu unterstützen Analytische Pharmakologie und analytische Zytometrie Kerne]. Die folgende Reagenz wurde durch die AIDS-Forschung NIH und Referenzprogramm Reagenz, Division of AIDS NIAID, NIH erhalten: BaL HIV Virus.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyiBiotec130-046-703
CryoStor CS2Stemcell Technologies07932
NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wji The Jackson Laboratory005557Züchter anstelle von Versuchsmäusen bestellen
IsoFloPatterson Veterinary07-806-3204Bestellung über Tiereinrichtung, eingeschränkter Artikel
Clidox DesinfektionsmittelFisher SicentificNC9189926
WescodyneFisher Sicentific19-818-419
Hamilton 80508 Spritze/NadelHamilton80508Maßgeschneidertes
Blutentnahmeröhrchen (K2EDTA)BD Bioscience367843
Blutentnahmeröhrchen (Heparin)BD Bioscience365965
Kapillarröhrchen (heparinisiert)Fisher Sicentific22-362574
Lysionspuffer für rote BlutkörperchenSigma Aldrich11814389001
QIAamp Viral RNA Mini KitQiagen52906
TaqMan Fast VIrus 1-Step Master MixThermofisher4444434
HIV-1 P24 ELISA (5 Plate Kit)PerkinElmerNEK050B001KT
IgG aus HumanserumSigma AldrichI4506-100MG
IgG aus MausserumSigma AldrichI5381-10MG
BB515 Maus Anti-Human CD45 (Klon HI30)BD Biosciences564586RRID: AB_2732068, LOT 6347696
PE-Cy7 Maus Anti-Human CD3 (Klon SK7)BD Biosciences557851RRID: AB_396896, LOT 6021877
Pacific Blue Mouse Anti-Human CD4 (Klon RPA-T4)BD Biosciences558116 RRID: AB_397037, LOT
6224744 BUV395 Maus Anti-Human CD8 (Klon RPA-T8)BD Biosciences563795RRID: AB_2722501, LOT 6210668
APC-Alexa Fluor 750 Maus Anti-Human CD14 (TuK4)ThermoFisherMHCD1427RRID: AB_10373536, LOT 1684947A
PE Maus Anti-Human CD19 (SJ25-C1)ThermoFisherMHCD1904RRID: AB_10373382, LOT 1725304B

Referenzen

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