Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Evaluierung der proteolytischen Aktivität eine intrinsisch Niedrige Aktivität, einzelne Umsatz Protease in einem zellulären Kontext. Insbesondere wird diese Methode angewendet, um die proteolytische Aktivität des PCSK9, ein wesentlicher Bestandteil des Fettstoffwechsels zu bewerten, deren proteolytische Aktivität für ihre ultimative normalem Funktion erforderlich ist.
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Methodenartikel
Ein High-Throughput Luciferase Assay Proteolyse von Single-Umsatz Protease PCSK9 bewerten
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Proprotein Konvertase Subtilisin/Kexin Typ 9 (PCSK9) ist ein Single-Umsatz-Protease die Serumspiegel Low density Lipoprotein (LDL) regelt und damit Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Obwohl PCSK9 Proteolyse für seine volle normalem Wirkung erforderlich ist, die Bewertung ihrer proteolytischen Funktion ist anspruchsvoll: PCSK9 ist nur bekannt, sich Spalten, erfährt nur einen einzigen Umsatz und nach Proteolyse, behält seine Substrat in seiner aktiven Seite als ein Auto-Inhibitor. Die hier vorgestellten Methoden beschreiben eine Probe, die diese Herausforderungen überwindet. Der Test konzentriert sich auf intermolekularen Proteolyse in einem Zell-basierte Kontext und Links erfolgreiche Spaltung die sekretierten Luciferase-Aktivität, die leicht im konditionierten Medium gelesen werden können. Über aufeinander folgenden Schritten Mutagenese, Transiente Transfektion und eine Luciferase auslesen, kann der Test PCSK9 Proteolyse unter Bedingungen von genetischen oder Molekulare Störung in gewissem Sinne Hochdurchsatz-Sonde. Dieses System eignet sich gut für beide die biochemische Auswertung der klinisch entdeckte Missense Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), als auch für das Screening von kleinen Molekül-Inhibitoren des PCSK9 Proteolyse.
Einleitung
PCSK9 richtet den LDL-Rezeptor (LDL-R) für den Abbau, Erhöhung von LDL-Cholesterin (LDL-C) und fahren atherosklerotische Herzkrankheit1,2. Therapeutika targeting PCSK9 robust niedrigere LDL-C und Verbesserung der Herz-Kreislauf-Ergebnisse für Patienten, auch wenn eine aggressive lipidsenkenden Therapie mit Statinen3,4hinzugefügt. Derzeit zugelassene Therapien beschränken sich auf Antikörper-basierte Ansätze, und leiden unter mangelnder Wirtschaftlichkeit5,6. Um dieses Problem zu lösen, sind wen....
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Protokoll
1. Site-verwiesene Mutagenese der Protease-Vektor
- Entwerfen und bestellen Brauch synthetisiert Oligonukleotide, eine Mutation von Interesse, die eine Modifikation der standard Site-verwiesene Mutagenese Protokolle12zu installieren. Standard entsalzten Primer (ohne zusätzliche Reinigung) sind durchaus akzeptabel.
Hinweis: Eine allgemeine Ausrichtung zu Grundierung Designs beinhaltet die Schaffung teilweise überlappender Grundierungen wie in Tabelle 1, unter Verwendung eines schmelzenden Temperatur (Tm) Rechners speziell für die Polymerase von Interesse. - Richten Sie Polymerase-Kettenreaktion (PCR....
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Ergebnisse
Hochdurchsatz-Proteolyse Assay stützt sich auf drei große Herausforderungen zu überwinden. Erstens ist zur Überwindung der intrinsisch geringen Leistung eines Single-Umsatz PCSK9 Protease, ein PCSK9 Protease fehlt die hemmenden prodomain mit der Spaltung Sequenz am Ende der prodomain verwendet, verbunden mit einer Luciferase, die sekretierten14sein können. Zweitens coexpressed zu der Notwendigkeit der Protease zu Falten Komplex mit seinen hemmenden prodomain, zwei .......
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Diskussion
Die oben beschriebenen Versuchsverfahren präsentieren eine Methode zum überwinden der intrinsisch niedrigen Aktivität der einzelnen Umsatz Protease PCSK9 und seine proteolytische Funktion in einer robusten Weise zu bewerten. Der Schlüsselbegriff des Assays stützt sich auf ein Single-Umsatz-Ereignis in einer enzymatisch verstärkte Auslesen umzuwandeln. Die Stärken des Assays gehören die relativ kurzen Zeitrahmen und Benutzerfreundlichkeit der Luciferase Reporter, als auch die Skalierbarkeit für Hochdurchsatz-Ansätze. Darü.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren danken die großzügige finanzielle Unterstützung vom NHLBI/NIH (K08 HL124068 und LRP HMOT1243), NCATS/NIH durch die UCSF klinische und Translationale Wissenschaft Institut Catalyst-Programm (UL1 TR000004), des akademischen Senats von UCSF Hellman-Stiftung, eine Gilead Sciences Research Scholar Award, dem ASPIRE Pfizer Herz-Kreislauf-Award (alle John S. Chorba) und dem Howard Hughes Medical Institute (zum Adri M. Galvan und Kevan M. Shokat).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| PCR-Röhrchen | USA Scientific | 1402-2900 | für PCR |
| Q5 Hot Start | New England Biolabs | M0493L | High-Fidelity DNA-Polymerase |
| Desoxynukleotid Solution Mix | New England Biolabs | N0447L | dNTPs (für PCR) |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT | Autoren | n/a | Verfügbar von Autoren |
| pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A | Autoren | n/a | Verfügbar von den Autoren |
| Agarose LE | Gold Biotechnology | A-201-100 | Für DNA-Gele |
| E-Gel Imager System mit Blaulichtbasis | ThermoFisher Scientific | Für die Bildgebung von DNA-Gelen | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Für DNA-Gele |
| Tris Base | ThermoFisher Scientific | BP152-1 | Für DNA-Gel-Laufpuffer |
| Eisessig | ThermoFisher Scientific | A38-500 | Für DNA-Gel-Laufpuffer |
| Ethylendiamintetraessigsäurelösung | Millipore Sigma | 3690 | EDTA, für DNA-Gel-Laufpuffer |
| 1 kb DNA-Leiter | Gold Biotechnologie | D010 | DNA-Leiter |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | Restriktionsenzym |
| LB Agar Platten mit 100 & Mikro; g/mL Carbenicillin | Teknova | L1010 | LB-Carb Platten |
| One Shot Mach1 T Phagenresistent Chemisch kompetent E. coli | ThermoFisher Scientific | C862003 | Chemisch kompetente Zellen |
| LB Brühe, Miller | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | LB |
| Carbenicillin | Gold Biotechnologie | C-103-5 | Selektives Antibiotikum |
| E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I | Omega BioTek | D6942-02 | DNA-Aufreinigung Miniprep Kit |
| NanoDrop 2000 Spektralphotomer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | Spektralphotometer |
| 293T Zellen | American Tissue Culture Collection (ATCC) | CRL-3216 | HEK 293T Zellen |
| DMEM, hoher Glukosegehalt, Pyruvat | ThermoFisher Scientific | 11995065 | DMEM, Säugetierzelle Medien |
| Fötale Rinderseren | Axenia Biologix | F001 | FBS |
| Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot | ThermoFisher Scientific | 25300062 | Trypsin, für die Zelldissoziation |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | ThermoFisher | Scientific 10010023 | PBS |
| Countess automatisierter Zellzähler | ThermoFisher Scientific | C10227 | Automatisierte Zellzählung |
| Countess Kammer Objektträger für die Zellzählung | ThermoFisher Scientific | C10228 | Objektträger für die Zellzählung |
| CELLSTAR Gewebekulturplatten, weiß, mit weißem Boden, mit Deckel | Grenier Bio-One 655083 | Weiß, 96-Well-Platte mit weißem Boden | |
| TempPlate 96-Well-PCR-Platte ohne Rand, natur | USA Scientific | 1402-9596 | 96-Well-Platte für Master-Plasmidplatte |
| Nunc 2,0 mL DeepWell Platten | ThermoFisher Scientific | 278743 | 96-Well-Deep-Well-Platte |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Reagenz für die Lipidtransfektion, Lf3K |
| P3000 Reagenz | ThermoFisher Scientific | L3000008 | Reagenz für die DNA-Präkomplexierung, bereitgestellt mit Lf3K |
| OptiMEM I Reduced Serum | Medium ThermoFisher Scientific | 31985062 | Reduced Serum Medium zur Transfektion |
| (+)-Natrium-L-Ascorbat | Millipore Sigma | A4034 | Natriumascorbat |
| Natriumchlorid | Millipore Sigma | S9888 | NaCl |
| Albumin, Rinderserum, Fraktion V, Niedrige Schwermetalle | Millipore Sigma | 12659 | BSA |
| Methanol (HPLC) | ThermoFisher Scientific | A4524 | MeOH |
| Salzsäure | VWR | JT9535-2 | Konzentrierter |
| CZ2.5 | Luciferase-Substrat | ||
| , steril | ThermoFisher Scientific | 09-720-3 | Sterilfilter, PVDF, 0,22 & Mikro; m pore |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | Mehrkanalpipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+ | Rainin | 17013808 | Mehrkanalpipette |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+ | Rainin | 17013807 | Mehrkanalpipette |
| Reagenzreservoir | Corning | 4870 | Rinne für Reagenzien |
| Zentrifugenröhrchen, 15 mL | ThermoFisher | Scientific 05-539-12 | 15 mL Röhrchen |
| Zentrifugenröhrchen, 50 mL | Corning | 430829 | 50 mL Röhrchen |
| Spark Microplate Reader | Tecan | N/a | Plate Reader |
| Excel | Microsoft | 2016 für Mac | Tabellenkalkulationssoftware |
| Prism | GraphPad Software | v7 | Scientific Datenanalysesoftware |
Referenzen
- Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
- Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H.
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Nachdrucke und Genehmigungen
