Eine wirksame Strategie zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila von Genom-Bearbeitung

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Erzeugung von gewebespezifischen binäre Transkription Systeme in Drosophila der erste kodierende Exon Gene durch Transkription Treiber ersetzen. CRISPR/Cas9-basierte Methode stellt eine transaktivator Sequenz der endogenen Verordnung eines Gens ersetzt und somit erleichtert Transctivator Ausdruck ausschließlich im Gen-spezifischen räumlich-zeitliche Muster.

Abstract

Binäre Transkription Systeme sind genetische Werkzeuge zur Visualisierung und Manipulation Zelle Schicksal und Gen-Ausdruck in spezifischen Gruppen von Zellen oder Geweben in Modellorganismen weit verbreitet. Diese Systeme enthalten zwei Komponenten als separate transgene Linien. Eine Treiber-Linie drückt eine transcriptional Aktivator unter der Kontrolle der gewebespezifische Promotoren/Enhancer und ein Reporter/Effektor Linie Häfen ein Zielgen flussabwärts die Bindungsstelle des Aktivators Transkription platziert. Tiere beherbergen beide Komponenten induzieren gewebespezifischen werden von einem Ziel-Genexpression. Präzisen raumzeitlichen Expression des Gens in gezielte Geweben ist entscheidend für unvoreingenommene Auslegung der Zelle/Genaktivität. Daher ist es wichtig, ein Verfahren zur Erzeugung von exklusiven Zelle/Gewebe-spezifische Treiber Linien zu entwickeln. Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, um Gewebe hochspezifische gezielte Expressionssystems erzeugen durch den Einsatz einer "gruppierten regelmäßig Interspaced kurze palindromische Repeat/CRISPR-assoziierte" (CRISPR/Cas)-Genom Bearbeitung Technik basiert. Bei dieser Methode die Endonuklease, die Cas9 durch zwei Chimären ausgerichtet ist guide RNAs (gRNA) auf bestimmte Websites im ersten kodierenden Exon eines Gens im Genom Drosophila Doppel-strangbrüchen (DSB) zu erstellen. Anschließend ermöglicht die Verwendung eine exogene Spender Plasmid mit dem transaktivator-Sequenz, die Zelle-autonome Reparatur-Mechanismus unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) des DSB, was präzise löschen und durch die transaktivator zu ersetzen das exon Sequenz. Klopfte in transaktivator äußert sich ausschließlich in den Zellen wo der Cis-regulatorische Elemente des Gens ersetzt sind funktionsfähig. Das detaillierte Schritt für Schritt Protokoll hier vorgestellten zur Erzeugung von binären transkriptionelle Fahrer ausgedrückt in Drosophila Fgf/astlosen-produzierenden epithelialen/neuronalen Zellen für jedes Gen oder gewebespezifische Ausdruck angenommen werden kann.

Introduction

Die genetische Toolbox für gezielte Genexpression wurde gut in Drosophila, so dass es eines der besten Modellsysteme, die Funktion von Genen, die in einer Vielzahl zellulärer Prozesse zu untersuchen. Binäre Expressionssysteme wie Hefe Gal4/UAS (upstream Aktivierung Sequenz), wurde zuerst angenommen, für gewebespezifischen Enhancer Trapping und gen Misexpression in Drosophila genetischen Modell¹ (Abbildung 1). Dieses System erleichtert die Entwicklung einer Vielzahl von Techniken wie räumlich-zeitliche Regelung der Überexpression des Gens, Misexpression, ko in ausgewählten Gruppen von Zell....

Protocol

1. entwerfen und konstruieren gRNA Expressionsvektor

1. Um genau eine lange definierte Region ein Exon ersetzen, verwenden Sie eine doppelte gRNA Ansatz⁶, in denen jeder gRNA zwei Enden des ausgewählten Bereichs von Interesse gezielt kann. Um eine genaue Gen-spezifischen räumlich-zeitliche Ausdruck des Fahrers zu erhalten, wählen Sie zwei gRNA Ziel-Sites innerhalb der ersten kodierenden Exon des Gens.
2. Wählen Sie für Drosophila Melanogasterdie gRNA Ziel-Sites mit dem FlyCRISPR optimalen Ziel-Finder-Tool (http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/). Andere verfügbare CRISPR-Design-Tools verwendet werde....

Results

Dieses Protokoll wurde erfolgreich eingesetzt, um eine gezielte binärer Ausdruck Reporter System speziell für Bnl Ausdruck Zellen⁵zu generieren. Der Cis-regulatorische Elementen (CREs), die komplexe raumzeitlichen Bnl Ausdruck Steuern sind nicht gekennzeichnet. Daher wurde um raumzeitlichen Ausdruck unter der Kontrolle der endogenen Bnl regulatorische Sequenz zu erreichen, nur die ersten kodierende Exon des Bnl entwickel.......

Discussion

Traditionell wurden Drosophila Enhancer fallen durch zwei unterschiedliche Methoden erzeugt. Eine der Möglichkeiten umfasst zufällige Einfügung eines Treibers (zB., Gal4) Sequenz des Genoms durch Umsetzung (zB., P-Element Umsetzung)¹ . Alternativ können die Fahrer Sequenzen transkriptionelle einer vermeintlichen Enhancer/Promotor-Region in ein Plasmid-Konstrukt, unterstellt werden, die dann in eine ektopische Website des Genoms^3,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
X-Gal/IPTG	Gentrox (Genesee Scientific)	18-218	Klonierung
LB-Agar	BD Difco	BD  244520	Klonierung
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T3253	Molekularbiologie
EDTA	Sigma Aldrich	E1161	Molekularbiologie
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	Molekularbiologie
Ultrareines DNase/RNase-freies Wasser	ThermoFisher Scientific	10977-023	Molekularbiologie
10% SDS	Sigma Aldrich	71736	Molekularbiologie
KOAc	Fisher-Scientific	P1190	Molekularbiologie
EtOH	Fisher-Scientific	04-355-451	Molekularbiologie
GeneJET Miniprep	ThermoFisher Scientific	K0503	Miniprep
PureLink HiPure Plasmid Maxipep Kits	ThermoFisher	Scientific K210006	Maxiprep
BbsI	NEB	R0539S	Restriktionsenzym-Primer
	IDT-DNA		PCR
pCFD4	Kornberg Lab		DNA-Template und Vektor für gRNA
KAPA HiFi Hot Start- (Kapa Biosystems)	Kapa Biosystems	KK2601	PCR
Q5-High Fidelity Taq	NEB NEB	#M0491	PCR
Gibson Assembly Master Mix	NEB	NEB #E2611	DNA-Assemblierung
pBPnlsLexA:p65Uw	Addgene		DNA-Template für die LexA-Amplifikation
Proteinase K	ThermoFisher Scientific	25530049	Molecular
Biology 2x PCR PreMix, mit Farbstoff (rot)	Sydlab	MB067-EQ2R	Molecular Biology
Gel-Elutionskit	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-300	Molecular Biology
TRI Reagenz	Sigma-Aldrich		Molecular Biology
Direct-Zol RNA Purification Kits	Zymo Research (Genesee Scientific)	11-330	Molecular Biology
OneTaq One-Step RT-PCR Kit	NEB	E5315S	Molecular Biology
lexO-CherryCAAX	Kornberg Lab		Fliegenschnur
UAS-CD8:GFP	Kornberg Labor		Fliegen-Schnur
btl-Gal4	Kornberg Labor		Fliegenschnur
MKRS/TB6B	Kornberg Labor		Fliegenschnur
Konfokales Mikroskop SP5X	Leica		Imaging Expressionsmuster
CO2 Station	Genesee Scientific	59-122WCU	Fliegenschieben
Stereomikroskop	Olympus	SZ-61	Fliegenschieben
Stößel zur Homogenisierung von Mikroröhrchen	Fisher-Scientific	03-421-217	genomische DNA-Isolierung
NanoDrop Spektralphotometer	ThermoFisher Scientific	ND-1000	DNA-Quantifizierung