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Methodenartikel

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

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DOI:

10.3791/58279

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24. Oktober 2018

 ,  ,  ,  , 
1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine einfache zweistufige Methode zur Differenzierung von Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Xeno und Feeder zellfreie Kulturbedingungen. Die Zelle Kulturmethoden hier vorgestellten ermöglichen kosteneffiziente, groß angelegte Produktion von klinische Qualität Zellen auf Hornhaut Zelle Therapie Verwendung anwendbar.

Zusammenfassung

Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen (LESCs) sind verantwortlich für das Hornhaut-Epithel kontinuierlich erneuert und damit die Aufrechterhaltung Hornhaut Homöostase und visuelle Klarheit. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete LESCs bieten eine viel versprechende Zelle Quelle für Hornhaut Zellersatztherapie. Undefiniert, xenogene Kultur und Differenzierung Bedingungen verursachen Variation in Forschungsergebnisse und behindern die klinische Übersetzung hPSC abgeleitet Therapeutika. Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare und effiziente Methode für hPSC LESC Differenzierung unter Xeno und Feeder zellfreie Bedingungen. Erstens dient Monolayer Kultur der undifferenzierten hPSC auf rekombinante Laminin-521 (LN-521) und definierte hPSC Medium als Grundlage für stabile Produktion von qualitativ hochwertige Ausgangsmaterial für Differenzierungen. Zweitens ergibt eine schnelle und einfache hPSC LESC Differenzierung Methode LESC Populationen in nur 24 Tagen. Diese Methode beinhaltet eine viertägige Oberfläche ektodermalen Induktion in der Schwebe mit kleinen Molekülen, gefolgt von anhaftenden Kultur Phase auf LN-521/Kollagen IV Kombination Matrix in definierten Hornhaut epithelialen Differenzierung Medium. Cryostoring und erweiterte Differenzierung weiter reinigt die Zellpopulation und Banken der Zellen in großen Mengen für Zelle Therapie Produkte ermöglicht. Die daraus resultierende qualitativ hochwertige hPSC-LESCs bieten eine potenzielle neue Behandlungsstrategie für Hornhaut Flächenrückführung, limbisches Stammzell-Mangel (LSCD) zu behandeln.

Einleitung

Die durchsichtige Hornhaut an der Augenoberfläche ermöglicht Licht in die Netzhaut und die Mehrheit der Brechkraft des Auges. Die äußerste Schicht, die geschichtete Hornhaut-Epithel wird kontinuierlich vom limbischen epithelialen Stammzellen (LESCs) regeneriert. Die LESCs befinden sich in der basalen Schicht der limbischen Nischen an der Corneoscleral Kreuzung1,2. LESCs fehlen spezifische und einzigartige Marker, so dass ihre Identifikation eine umfassendere Analyse eines Satzes von vermeintlichen Marker erfordert. Epitheliale Transkription Faktor p63 und vor allem N-Terminal verkürzten Abschrift der alpha Isoform von p63 (ΔNp63α), wurde vorgeschlagen, als eine entsprechende positive LESC Marker3,4. Asymmetrische Teilung der LESCs ermöglicht es ihnen, selbst zu erneuern, sondern auch produzieren nachkommen, die centripetally und anterior zu migrieren. Wie die Zellen die Fortschritte in Richtung der Hornhautoberfläche sie allmählich verlieren ihre Stemness und schließlich unheilbar differenzieren zu oberflächlichen Plattenepithelzellen, die kontinuierlich von der Hornhautoberfläche verloren gehen.

Schäden die Hornhautschichten kann zu schweren Sehbehinderungen führen und Hornhaut Mängel sind somit eine der häufigsten Todesursachen weltweit Verlust der Sehkraft. Im limbischen Stammzell-Mangel (LSCD) ist der Limbus zerstört, durch Krankheit oder Trauma führt zu Conjunctivalization und getrübten der Hornhautoberfläche und folgenden Verlust von Vision5,6. Handy-Ersatz-Therapie mit autologen oder allogenen limbisches Transplantate bietet eine Behandlungsstrategie für Patienten mit LSCD4,7,8,9. Jedoch Ernte autologe Transplantate birgt ein Risiko von Komplikationen für das gesunde Auge und Spendergewebe ist Mangelware. Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), spezifisch humanen embryonalen Stammzellen (HES) und menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs), kann als eine unbegrenzte Quelle von klinisch relevante Zelltypen, einschließlich der Hornhaut Epithelzellen dienen. HPSC abgeleitet LESCs (hPSC-LESCs) stellen daher eine attraktive neue Zelle Quelle für okuläre Zellersatztherapie.

Bisher haben die undifferenzierte hPSC Kulturmethoden und ihrer Differenzierung Protokolle zum LESCs über den Einsatz von undefinierten Feeder-Zellen, tierischen Seren, konditionierte Medien oder amniotic Membranen10,11, verlassen 12 , 13 , 14 , 15. vor kurzem Bemühungen in Richtung sicherer Zelle Therapie Produkte haben dazu veranlasst, die Suche nach mehr standardisierte und Xeno-freie Kultur und Differenzierung-Protokolle. Infolgedessen sind mehrere definierte und Xeno-freie Methoden für langfristige Kultur der undifferenzierten hPSCs jetzt handelsüblichen16,17,18. Als ein Kontinuum, gezielte Differenzierung, die Protokolle unter Berufung auf molekulare Signale zu hPSCs Hornhaut epithelialen Schicksal führen in letzter Zeit haben19,20,21,22eingeführt, 23. Doch verwendet viele dieser Protokolle entweder nicht definiert, Feeder-basierte hPSCs als ab Material oder komplexe, xenogene Wachstumsfaktor Cocktails zur Differenzierung.

Dieses Protokoll soll eine robuste, optimierte, Xeno bieten- und Feeder-freie hPSC Kultur-Methode und anschließende Differenzierung zu Hornhaut LESCs. Monolayer Kultur der pluripotenten hPSCs auf Laminin-521 (LN-521) Matrix in definierten, Albumin-freie hPSC Medium (speziell wichtig 8 Flex) ermöglicht schnelle Herstellung von homogenen Ausgangsmaterial für Differenzierungen. Danach führt eine einfache zweistufige Differenzierungsstrategie hPSCs in Richtung Oberfläche ektodermalen Schicksal in der Schwebe, gefolgt von anhaftenden Differenzierung zu LESCs. Eine Zellpopulation wo express > 65 % ΔNp63α wird innerhalb von 24 Tagen gewonnen. Das Xeno und Feeder-frei-Protokoll wurde mit mehreren hPSC Linien (hESC und HiPSCs), ohne jede Anforderung für Zelle Linie gezielte Optimierung getestet. Die Protokolle für Wochenende-freie Wartung, Passagierung, Cryostoring und hPSC LESC Phänotypisierung hier beschriebenen ermöglichen die Produktion von Großserien von qualitativ hochwertigen LESCs für klinische oder wissenschaftliche Zwecke.

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Protokoll

Universität Tampere hat die Genehmigung der Nationalbehörde für rechtsmedizinische Angelegenheiten Finnland (Dnro 1426/32/300/05), Forschung an menschlichen Embryonen zu betreiben. Das Institut hat auch unterstützende Aussagen der Ethik-Ausschuß des Landkreises Pirkanmaa Krankenhaus ableiten, Kultur, und differenzieren hESC Linien (Skottman/R05116) und HiPSC Linien in Augenheilkunde (Skottman/R14023) zu verwenden. Keine neuen Zell-Linien wurden für diese Studie abgeleitet.

Hinweis: Die beschriebenen Protokoll basiert auf speziellen, im Handel erhältlichen hPSC und Hornhaut-Epithel Differenzierung Medien. Entnehmen Sie bitte der Tabelle der Materialien für Hersteller/Lieferanten Informationen und Katalog-Nummern.

1. zur Gründung Xeno und Feeder-freie hPSC Kultur

  1. Vorbereitungen
    1. Mantel 24-Well-Platten mit menschlichen rekombinante Laminin-521 (LN-521). Verwenden Sie für den ersten Feeder-frei (FF) Durchgang, LN-521 in einer Konzentration von 1,09 µg/cm2bei 0,55 µg/cm2 für die folgenden Passagen. Die vorgeschlagenen LN-521-Konzentrationen dienen als Ausgangspunkt für erfolgreiche FF Kultur aber gesenkt werden können.
      1. Tauen Sie LN-521 Ampulle langsam bei 4 ° C, wie vom Hersteller angewiesen.
        Hinweis: Entsprechend behandelt LN-521-Lösung kann bis zu 3 Monate nach dem Auftauen bei 4 ° C aufbewahrt werden.
      2. Zur Vorbereitung der Beschichtungslösung verdünnen Sie entsprechende Menge an LN-521-Stammlösung mit 1 X Dulbecco Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) mit Ca2 + und Mg2 + auf ein Gesamtvolumen von 300 µL pro Bohrloch.
      3. Pipettieren der Beschichtungslösung in die Vertiefungen der well-Platte mit Parafilm verschließen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren Beschichtete Platten können bis zu 2 Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.
        (Optional): Alternativ für eine schnelle Beschichtung Protokoll inkubieren well-Platten mit Beschichtungslösung für 2 h bei 37 ° C, 5 % CO2.
    2. Bereiten Sie hPSC Kulturmedium (speziell wichtig 8 Flex) durch die Ergänzung von basal Medium mit bereitgestellten Ergänzung, wie vom Hersteller angewiesen. Fügen Sie 50 U/mL Penicillin-Streptomycin. Beachten Sie, dass die Formulierung empfindlich auf Licht und hohen Temperaturen. Tauen Sie die Ergänzung auf und wärmen Sie die Medien bei Raumtemperatur (RT), vor Licht geschützt werden. Nutzen Sie die ergänzten hPSC Medium innerhalb von zwei Wochen ab dem Datum der Supplementierung.
  2. Übertragung der hPSC FF Kultur auf LN-521
    1. Vorwärmen der benötigten Materialien und Reagenzien zu RT in der Laminar-Flow-Haube.
    2. Durchgang hPSCs von standard Kultursystem auf Anleger Schichten (z. B. inaktivierten menschliche Vorhaut (hFF) oder Maus embryonalen Fibroblasten) oder anderen FF-Kultur-Systemen mit Standardmethodik. Zum Beispiel können hPSC Kolonien auf hFF-Feeder-Zellen kultiviert, kleine Stücke mit einem Skalpell und die Stücke dann getrennt mit einer Nadelspitze seziert werden. Menschlichen PSCs kultiviert mit FF-Kultur-Systeme können mit Cluster Passagierung Methode mit oder ohne vorherige Enzymbehandlung übertragen werden.
    3. Entfernen Sie der LN-521 Beschichtungslösung aus 24-Brunnen zu und fügen Sie 1 mL vorgewärmten hPSC Medium pro Bohrloch.
      Hinweis: Lassen Sie nicht die Brunnen trocken wie LN-521 wird beim Trocknen zu inaktivieren.
    4. Übertragen Sie die Kolonie Stücke/Zellcluster auf LN-521 beschichtet 24-Brunnen in hPSC Medium mit einer Pipette. Übertragen Sie 20 – 30 Kolonie Stück pro Bohrloch, Brunnen Überbelegung zu vermeiden.
    5. Ersetzen Sie das Medium mit 1 mL hPSC Medium am Tag nach Transfer und jeden Tag danach. Die Kulturen sind bereit für Passagierung 3 – 4 Tage später, als hPSCs in Kolonien mit glatten, undifferenzierte Morphologie heraus gewachsen sind. Als Referenz, siehe Abbildung 1 b (erstes Bild). Für den ersten Durchgang der FF die Kolonien darf sich nicht auf ein vollständig konfluierende Monolage wachsen, aber die Kulturen sollten passagiert, wenn Kolonien eine ungefähre Größe von 1 mm erreichen.
  3. Passagierung und Erhaltung der FF hPSC Kultur
    1. Vorwärmen der benötigten Materialien und Reagenzien zu RT in der Laminar-Flow-Haube.
    2. Der zweite FF Passage ab Durchgang der FF hPSCs wenn die Kultur 80-100 % Konfluenz erreicht hat. Durchgang FF hPSCs, neue LN-521 beschichtet 24-Well-Platten mit einzelligen Passagierung zweimal wöchentlich (montags und donnerstags), weiterhin qualitativ hochwertige Kulturen mit undifferenzierten Morphologie und am Wochenende-freie Fütterung Therapie zu erreichen. Weitere Informationen finden Sie in18,24,25.
      1. Spülen Sie die FF-hPSCs zweimal mit 1 mL 1 X DPBS ohne Ca2 + und Mg2 +.
      2. FF hPSCs mit Xeno-freie Trypsin-EDTA (speziell TrypLE wählen Sie Enzym) durch Inkubation 500 µL pro Bohrloch bei 37 ° C, 5 % CO2abnehmen. Können Sie für optimale Inkubationszeit die Zellen Runden aber nicht lösen. Dies dauert in der Regel 3 min bei 37 ° C, 5 % CO2 (nicht mehr als 5 min).
      3. Entfernen Sie Xeno-freie Trypsin-EDTA zu und fügen Sie sofort 500 µL pro Bohrloch definierten Trypsin-Inhibitor.
      4. Lösen Sie FF hPSCs, indem Sie vorsichtig, aber dennoch gründliche pipettieren, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Übertragen Sie die FF hPSC Aussetzung durch ein Sieb 40 µm Zelle in eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen mit vorgewärmten hPSC Medium.
      5. Waschen Sie die Brunnen mit 1 mL der hPSC Medium und die konische Zentrifugenröhrchen 15 mL fügen Sie Waschmedium hinzu.
      6. Die einzigen Zellsuspension für 5 min bei 300 X g Zentrifugieren, Aspirieren der Zelle Pellet und in 1 mL vorgewärmten hPSC Medium Aufschwemmen.
      7. Zählen Sie die Zellen mit Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler.
      8. LN-521 Beschichtungslösung (0,55 µg/cm2) vom 24-Brunnen und fügen Sie hPSC Medium wie 1.2.3.
      9. Platte FF hPSCs auf 0,55 µg/cm2 LN-521 beschichtet 24-Wells in einer Zelldichte von 40.000-50.000 Zellen/cm2.
      10. Medium mit frischen hPSC Medium übermorgen Passagierung und jeden zweiten Tag danach außer sonntags zu ersetzen.
    3. Die Zellen sind bereit, für Differenzierung ca. 3-4 Tage nach Passagierung, verwendet werden, wenn die Kultur erreicht hat > 85 % Konfluenz. Für die hohe Qualität der hPSCs zu gewährleisten, beziehen sich auf Charakterisierungsmethoden in früheren Werken18,24,25ausführlich beschrieben. Es empfiehlt sich, nur Kultur hPSCs bis Passage Level 15 in der FF-System mit einzelnen Zelle Passagierung um karyotypic Änderungen zu vermeiden. Verwenden Sie nur qualitativ hochwertige, undifferenzierte hPSCs als Ausgangsmaterial für Differenzierungen.

2. gezielte Differenzierung und Kryokonservierung von hPSC abgeleitet LESCs

  1. Vorbereitungen
    1. Xeno-freie basale Induktion Medium (basale Induktion Mittel) vorbereiten: Ergänzung Dulbecco Adlers Medium (speziell Ko DMEM) mit 15 % Xeno-freie Serum Ersatz modifiziert (Spesifically CTS KnockOut SR XenoFree), 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM 2 - Mercaptoethanol, 1 % nicht-essentiellen Aminosäuren und 50 U/mL Penicillin-Streptomycin. Nutzen Sie die basalen Induktion Medium innerhalb von zwei Wochen.
    2. Hornhaut Induktion in Suspensionskultur Medien vorbereiten.
      1. Tag 1: Ergänzung basale Induktion Medium mit 5 μM Blebbistatin.
      2. 2. Tag: Ergänzen Sie basale Induktion Medium mit 10 µM SB-505124 und 50 ng/mL menschlichen grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF).
      3. Tag 3-4: Ergänzung basale Induktion Medium mit 25 ng/mL Knochen morphogenetische Protein 4 (BMP-4).
    3. Hornhaut-Epithel Differenzierung Medium (Mittel der Differenzierung, speziell CnT-30) für anhaftende Kultur vorbereiten: basal Medium gemäß den Anweisungen des Herstellers Ergänzungen hinzu, und fügen Sie 50 U/mL Penicillin-Streptomycin.
      Hinweis: Differenzierung mittlere Formulierung ist lichtempfindlich. Nutzen Sie die ergänzten Differenzierung Medium innerhalb von 6 Wochen nach Supplementierung.
    4. 100 mm Gewebekultur Schalen für anhaftende Differenzierung zu beschichten (siehe Punkt 2.3) mit einer Mischung von 5 µg/cm2 menschliche Plazenta Kollagen Typ IV (Col IV) und 0,5 µg/cm2 in 1 X DPBS mit Ca2 + und Mg2 +, in insgesamt verdünnt LN-521 Beschichtung-Volumen von 5 mL pro Schale. Bereiten Sie vor und speichern Sie die Beschichtungen mit Col IV und LN-521 wie in 1.1.1.3 beschrieben.
  2. Schritt I: Hornhaut Induktion in Suspensionskultur
    1. Vorwärmen der benötigten Materialien und Reagenzien zu RT in der Laminar-Flow-Haube.
    2. FF hPSCs zu einzelnen Zellsuspension mit Xeno-freie Trypsin-EDTA zu lösen, wie in den Schritten 1.3.2.1–1.3.2.6 beschrieben. Zählen der Zellen, und 2-3 x 106 Zellen pro niedrigen Anlage 6-Well-Platte, im Gesamtvolumen von 3 mL der basalen Induktion Medium ergänzt mit 5 μM Blebbistatin induzieren EB Bildung über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2 (1. Tag) zu verteilen.
    3. Am nächsten Tag (Tag2) entfernen Sie das Medium und ersetzen mit 3 mL basale Induktion Medium mit 10 µM SB-505124 und 50 ng/mL bFGF ergänzt.
    4. Auf den folgenden zwei Tagen (3 – 4 Tage), entfernen Sie das Medium und ersetzen mit 3 mL basale Induktion Medium ergänzt mit 25 ng/mL BMP-4.
  3. Schritt II: Hornhaut Differenzierung in adhärenten Kultur
    1. Vorwärmen der benötigten Materialien und Reagenzien zu RT in der Laminar-Flow-Haube.
    2. Am 5. Tag der EBs Platte unten auf 100 mm Gewebekultur Schalen beschichtet mit 5 µg/cm2 Col IV und 0,5 µg/cm2 LN-521.
      1. Entfernen Sie die Beschichtungslösung aus 100 mm Gewebekultur Schalen und 10 mL vorgewärmten Differenzierung Medium pro Schale.
        Hinweis: Lassen Sie das Geschirr zu trocknen, da LN-521 wird beim Trocknen zu inaktivieren.
      2. Der EBs auch auf zwei bis drei 100 mm Gewebekultur Schalen aus einem 6-Well-Platte zu übertragen (ca. 50 EBs pro cm2) durch pipettieren. Verteilen Sie die EBs durch sanftes Schütteln gleichmäßig.
    3. Pflegen Sie die Zellen im anhaftende Kultur bei 37 ° C, 5 % CO2, ersetzen das Medium mit 10 mL frisches Differenzierung Medium dreimal pro Woche (am Montag, Mittwoch und Freitag) für die nächsten 2,5-3 Wochen. Überprüfen Sie die Zellen regelmäßig für die Entstehung der richtige epithelialen Morphologie Phase Kontrast Mikroskop.
  4. Schritt III: Cryo-Banking hPSC abgeleitet LESCs
    1. Vorwärmen der benötigten Materialien und Reagenzien zu RT in der Laminar-Flow-Haube, mit Ausnahme der Kryokonservierung Medium, das vorab gekühlt werden sollte.
    2. Lösen Sie hPSC abgeleitet LESCs mit Xeno-freie Trypsin-EDTA zu und zählen Sie die Zellen zu, wie für FF hPSCs in Stufen 1.3.2.1–1.3.2.6, aber mit Differenzierung Medium angewiesen.
      Hinweis: Für hPSC abgeleitet LESCs, optimale Inkubationszeit mit Xeno-freie Trypsin-EDTA ist länger (ca. 5 min). Verwenden Sie Xeno-freie Trypsin-EDTA und definierten Trypsin-Inhibitor 3 mL pro 100 mm Schale.
    3. Nach Auszählung der Zellen, wiederholte Zentrifugation für 5 min bei 300 X g, Aspirieren Medium und Aufschwemmen der Zelle Pellet in vorgekühlt, Xeno-freie hPSC Kryokonservierung Medium. Pipettieren die einzelne Zelle Aussetzung in Cryoröhrchen, damit jedes Cryotube enthält 0,5 bis 1 x 106 Zellen in 1 mL Kryokonservierung Medium.
    4. Legen Sie die Rohre in einem eiskalten Behälter und Transfer sofort (innerhalb von 5 min) bis-80 ° C über Nacht.
    5. Am Folgetag übertragen Sie die Rohre zu flüssigem Stickstoff für die langfristige Lagerung.
  5. Schritt IV: Auftauen der kryokonservierten hPSC-LESCs
    1. Vor dem Auftauen, Mantel der Gerichte/Well-Platten mit 5 µg/cm2 Col IV und 0,5 µg/cm2 LN-521.
    2. Vorwärmen der benötigten Materialien und Reagenzien zu RT in der Laminar-Flow-Haube.
    3. Die Beschichtungslösung vom Gerichte/Wells und fügen Sie entsprechende Volumen der vorgewärmten Differenzierung Medium.
      Hinweis: Lassen Sie das Geschirr zu trocknen, da LN-521 wird beim Trocknen zu inaktivieren.
    4. Auftauen der Zellen schnell bei RT und sofort die Zellsuspension auf eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen mit 5 mL vorgewärmten Differenzierung Medium übertragen.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 min bei 300 X g Aspirieren und Aufschwemmen der Pellet Differenzierung Mittel-und jedem Kryokonservierung Medium zu entfernen.
    6. Die Zellen auf Gerichte/Brunnen mit 5 µg/cm2 Col IV und 0,5 µg/cm2 LN-521, Differenzierung Medium bei einer Dichte von 40.000-50.000 Zellen/cm2beschichtete Platte. Pflegen Sie die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2, ersetzen die Differenzierung Medium dreimal pro Woche.

3. die Phänotypisierung von hPSC abgeleitet LESCs

  1. Qualitative Immunfluoreszenz-Analyse
    1. Für die Immunfluoreszenz, Mantel 24 oder 12-Well Platte Brunnen mit 5 µg/cm2 Col IV und 0,5 µg/cm2 LN-521 und Platte/Auftauen hPSC-LESCs in Differenzierung Medium bei einer Dichte von 40 000 bis 50 000 Zellen/cm2.
    2. Wenn die Kulturen Konfluenz erreicht haben, befestigen Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd (PFA): Waschen Sie die Brunnen zweimal mit 1 X DPBS ohne Ca2 + und Mg2 +und inkubieren Sie 15-20 min mit 4 % PFA bei RT Waschen Sie danach zweimal mit 1 X DPBS, PFA Rückstände zu entfernen. Mit 0,5-1 mL pro Bohrloch-Lösungen.
      Hinweis: Feste Zellen können in 1 X DPBS bei 4 ° C bis zu einer Woche vor der Färbung gespeichert werden.
      Achtung: PFA ist giftig und ätzend. PFA in einer Dampfhaube behandeln und Schutzkleidung, Schutzbrille und Handschuhe zu tragen.
    3. 1 X DPBS Aspirieren und Zellmembranen durch Inkubation für 10-15 min mit 0,1 % Triton x-100 in 1 X DPBS permeabilize.
    4. Aspirieren Sie 0,1 % Triton x-100 und Block unspezifische Antikörper Bindungsstellen durch Inkubation für 1 h mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) in 1 X DPBS bei RT. Prepare Primärantikörper Verdünnungen in 0,5 % BSA in 1 X DPBS.
      Hinweis: Siehe Tabelle 1 für empfohlene primäre Antikörper.
    5. 3 % BSA abzusaugen und mit entsprechend verdünnter Primärantikörper über Nacht bei 4 ° c inkubieren
    6. Waschen Sie die Brunnen 3 X 5 Minuten mit 1 X DPBS. Bereiten Sie Sekundärantikörper Verdünnungen in 0,5 % BSA in 1 X DPBS.
      Hinweis: Siehe Tabelle 1 für empfohlene Sekundärantikörper.
    7. Aspirieren Sie 1 X DPBS und inkubieren Sie mit geeigneten, entsprechend verdünnten Sekundärantikörper für 1 h bei RT, vor Licht geschützt werden.
      Hinweis: Halten Sie von diesem Schritt auf die Proben vor Licht geschützt werden, zur Vermeidung von Ausbleichen der Fluoreszenz-Farbstoffen.
    8. Waschen Sie die Brunnen 3 X 5 min mit 1 X DPBS und schließlich Gegenfärbung Kerne mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und Mount mit Fluoreszenz Montage Medien. DAPI kann separat verwendet werden nach Angaben des Herstellers oder in das Eindeckmittel enthalten. Ort runden Deckgläsern (Durchmesser 19 mm und 13 mm für 12 und 24-Well-Platten, beziehungsweise) in jede Vertiefung. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers zur Trocknung und Lagerung der montierten Proben.
    9. Bild der gefärbten Zellen mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.
  2. Quantitative Immunfluoreszenz-Analyse
    1. Cytospin Proben der hPSC abgeleitet LESCs am Objekt Gläser vorbereiten.
      1. Lösen Sie hPSC abgeleitet LESCs mit Xeno-freie Trypsin-EDTA zu und zählen Sie die Zellen zu, wie in Schritt 2.4.2 angewiesen.
      2. Fügen Sie nach Auszählung vorgekühlt 1 X DPBS und Zentrifuge für 5 min bei 300 X g. anpassen das Probenvolumen und Zellkonzentration gemäß den Anweisungen des Herstellers des gegebenen Cytocentrifuge, z. B. 50.000 – 100.000 Zellen in ein Probenvolumen von 150 µL hinzu.
      3. Spin-Zellen auf Objekt-Gläser mit einem Cytocentrifuge z.B. 5 min bei 28 x g und Verlegenheit sofort für 15-20 min mit 4 % PFA in 1 X DPBS bei RT Die empfohlene Spinnen Zeit und Geschwindigkeit finden Sie in der Bedienungsanleitung angegebenen Cytocentrifuge.
    2. Fahren Sie mit der Cytospin Proben Färbung, wie beschrieben in Schritten 3.1.3–3.1.8 Einsatz flüssiger Blocker Stift zu die Proben mit einem hydrophoben Kreis umgeben und führen die Färbung in ein Tröpfchen für die wirtschaftliche Praxis. Wäschen können in Behältern mit Objekthalter, durchgeführt werden, um effiziente Entfernung von überschüssigen Antikörper und minimaler Hintergrundfärbung zu gewährleisten. Gegenfärbung Kerne mit DAPI und montieren Sie die gefärbten Proben mit Fluoreszenz Montage Medien, Abdeckung mit Deckgläsern. Anweisungen des Herstellers zur Trocknung und Lagerung der montierten Proben.
    3. Aufnehmen Sie 5 – 10 Bilder pro Probe von zufällig ausgewählten Standorten mit z.B. 10 X Vergrößerung ein Fluoreszenzmikroskop.
    4. Schätzen Sie den Anteil der positiv gefärbten Zellen in Bezug auf insgesamt (DAPI positiv) Zellen, z. B. mit ImageJ Bildverarbeitung und Analyse-Software (https://imagej.nih.gov/ij/)-Tools. Analysieren Sie vorzugsweise > 500 Zellen pro Probe.
      1. Öffnen Sie das Bild in ImageJ-Software analysiert werden. Duplizieren Sie das Bild und die Filter mit Standard Gaußsche Unschärfe zu entfernen.
      2. Erstellen Sie eine Schwelle. Die Schwellenwerte zur optimalen Auswahl der positiv gefärbten Zellkerne anpassen und anwenden. Das duplizierte Bild wird nun in eine binäre Ansicht konvertiert.
      3. Prozess der Binärbild mit binären Verarbeitung Werkzeuge "Löcher füllen" und "Watershed", die zusammengeführten Bereiche repräsentieren einzelne Kerne automatisch trennen wird.
      4. Verwenden Sie die "Analyze Partikel", um automatisch Liste Regionen von Interesse (ROIs), die bei der Anwendung des Befehls öffnet Fenster ROI-Manager. Schließen Sie das binäre Bild.
      5. Visualisieren Sie die ROIs im Originalbild durch die Auswahl "Alle anzeigen" im ROI-Manager. Bestätigen Sie richtige Auswahl der gefärbten Zellkerne zu, und bei Bedarf manuell entfernen und Hinzufügen von einzelnen Selektionen.
  3. Flow-Zytometrie-Analyse
    1. Um die p63α Ausdruck Niveaus zu bestätigen, färben Sie die Zellen für die Durchflusszytometrie.
      1. Lösen Sie hPSC abgeleitet LESCs mit Xeno-freie Trypsin-EDTA zu und zählen Sie die Zellen zu, wie in Schritt 2.4.2 angewiesen.
      2. Waschen der Zellen zweimal mit 1 mL Pre gekühlt 1 X DPBS und Zentrifugieren für 5 min bei 300 X g. Fix und permeabilize mit Fixierung/Permeabilisierung Ready-to-Use Lösung für 20 min bei 4 ° C. Danach waschen vorab gekühlt die Zellen zweimal mit 1 mL 1 x permeabilizing Waschpuffer.
        Hinweis: Von diesem Schritt auf, halten Sie die Zellen bei 4 ° C oder auf Eis, sofern nicht anders angegeben.
      3. Vorsicht: Fixierung/Permeabilisierung Lösung enthält 4,2 % Formaldehyd. Behandeln Sie die gefährliche Lösung in einer Dampfhaube und tragen Sie Schutzkleidung, Schutzbrille und Handschuhe zu.
      4. Unterteilen Sie Proben in 5 mL Polypropylenröhrchen. Jede Probe sollte 100.000 – 200.000 Zellen enthalten und das Probenvolumen sollte ca. 100 µL 1 x Waschpuffer angepasst werden.
      5. Fügen Sie 2 µL Fluorochrom konjugiert p63-α FACS Antikörper (empfohlene Antikörper, siehe Tabelle der Ausrüstung und Materialien) in das Probenröhrchen. Lassen Sie eine Probe ungefärbten als negative Kontrolle dienen. Wirbel der Proben und inkubieren Sie für 1 h bei RT, vor Licht geschützt werden.
      6. Die Zellen zweimal mit 1 mL vorgekühlt 1 x Waschpuffer waschen und zu guter Letzt die Pellets mit 300 µL Puffer aufzuwirbeln. Speichern Sie die Rohre auf dem Eis, vor Licht geschützt werden.
    2. Analysieren Sie die Proben mit einem Durchflusszytometer. Verwenden Sie die ungefärbten negative Kontrollprobe für die Anspritzung der richtigen Zellenbevölkerung und für den Ausschluss der fluoreszierenden Hintergrundsignal. Analysieren Sie ein Minimum von 10.000 p63-α-Zellen befleckt. Detaillierte technische Umsetzung entnehmen Sie bitte der Bedienungsanleitung des gegebenen Durchflusszytometer.

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Ergebnisse

Von hPSCs, hPSC-LESCs

Der gesamte Prozess von Induktion Differenzierung der FF hPSCs, Cryostoring hPSC-LESCs dauert ca. 3,5 Wochen. Schematische Übersicht über die Differenzierung-Methode, die Hervorhebung der wichtigsten Schritte ist in Figur 1Apräsentiert. Abbildung 1 b zeigt typische Morphologien der Zell-Populationen in verschiedenen Phasen des Protokolls. Die vorgeleg...

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Diskussion

Das erwartete Ergebnis dieses Protokolls ist die erfolgreiche und robuste Generation der LESCs aus einer einzigen Zelle Aussetzung der FF hPSC innerhalb von ca. 3,5 Wochen. Hornhaut-Epithel von der Oberfläche Ektoderm29entwickelt, soll der erste Schritt des Protokolls Lenkung hPSCs gegenüber dieser Linie. Eine kurze 24 h Induktion mit Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β)-Antagonist SB-505124 und bFGF werden verwendet, um ektodermalen Differenzierung, gefolgt von 48 h mesodermalen BMP-4 Cue,...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Studie wurde unterstützt durch die Akademie von Finnland (Grant-Nummer 297886), das menschliche Ersatzteile-Programm von Tekes, Finnish Funding Agency für Technologie und Innovation, die finnische Augen- und Gewebe-Bank-Stiftung und der finnischen Kulturstiftung. Die Autoren danken die biomedizinischen Laboranten Outi Melin, Hanna Pekkanen und Emma Vikstedt Outi Heikkilä für hervorragende technische Unterstützung und Beitrag zur Zellkultur. Professor Katriina Aalto-Setälä ist anerkannt für die Bereitstellung der HiPSC Linie verwendet und BioMediTech Imaging Core Facility für die Bereitstellung von Ausrüstung für die Fluoreszenz-Bildgebung.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Material/Reagenz
1x DPBS mit Ca2+ und Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS ohne Ca2+ und Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm ZellkulturschaleCorning CellBIND#3296Kulturgefäßformat für adhärentes hPSC-LESC Differenzierung
12-Well-PlatteCorning CellBIND#3336Kulturgefäßformat für IF-Proben
24-Well-PlatteCorning CellBIND#3337Kulturgefäßformat für IF-Proben
2-MercaptoethanolGibco#31350-010
6-Well-Platte, Ultra-Low attachmentCorning Costar#3471Kulturgefäßformat für Induktion in Suspension Kultur
Alexa Fluor 488 Anti-Maus IgThermoFisher Scientific#A-21202Sekundärantikörper gegen IF
Alexa Fluor 488 Anti-KaninchenIg ThermoFisher Scientific#A-21206Sekundärantikörper gegen IF
Alexa Fluor 568 Anti-ZiegeIg ThermoFisher Scientific#A-11057Sekundärantikörper für IF
Alexa Fluor 568 Anti-Maus IgThermoFisher Scientific#A-10037Sekundärantikörper gegen IF
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, human)PeproTech Inc.#AF-100-18Btierversuchsfrei rekombinant humane FGF-basisch (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixierungs-/PermeabilisierungslösungBD Biosciences#554722Fixierungs- und Permeabilisierungslösung für die Durchflusszytometrie
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Waschpuffer für die Durchflusszytometrie
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Knochenmorphogenetisches Protein 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Cytokeratin 12 AntikörperSanta Cruz Biotechnology#SC-17099Primärer Antikörper für IF
Cytokeratin 14 AntikörperR& D Systems#MAB3164Primärer Antikörper für IF
Cytokeratin 15 AntikörperThermoFisher Scientific#MS-1068-PPrimärer Antikörper für IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Kulturmedium für adhärente hPSC-LESC Differenzierung
Kollagen Typ IV (human)Sigma-Aldrich#C5533Humanes Plazentakollagen Typ IV
CoolCell LX GefrierbehälterSigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure RöhrchenSarsted#72.3801,6 mL Kryoröhrchen für die Kryokonservierung von hPSC-LESC
Definierter Trypsin-InhibitorGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminin 521Biolamina#Ln521Humanes rekombinantes Laminin 521
Δ Np63α AntikörperBioCare Medical#4892Primärer Antikörper für IF
OCT3/4 AntikörperR& D Systems#AF1759Primärer Antikörper für IF
p63α AntikörperCell Signaling Technology#ACI3066APrimärer Antikörper für IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE-Konjugat)Zellsignaltechnologie#56687p63-α PE-konjugierter Antikörper für die Durchflusszytometrie
PAX6-AntikörperSigma-Aldrich#HPA030775Primärer Antikörper für IF
Penicillin/StreptomycinLonza#17-602E
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich#158127Zellfixiermittel für IF
ProLong Gold Antifade Eindeckmittel mit DAPIThermo Fisher Scientific#P36931DAPI Eindeckmittel für harte Halterung für IF
PSC KryokonservierungskitThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' s modifizierter Eagle" s MediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM nicht-essentielle AminosäurenGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Permeabilisierungsmittel für IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200DAPI Eindeckmittel für flüssige Einbettung für IF
strong>NameCompanyKatalognummer<>Kommentare
Equipment
Zytozentrifuge, z.B. CellSpin IITharmac
Durchflusszytometer, z.B. BD Accuri C6BD Biosciences
Fluoreszenzmikroskop, z.B. Olympus IX 51Olympus
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Referenzen

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