Method Article

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

DOI:

10.3791/58279

⸱

October 24th, 2018

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1BioMediTech Institute, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere, 2Department of Ophthalmology, SILK, Faculty of Medicine and Life Sciences, University of Tampere

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll stellt eine einfache zweistufige Methode zur Differenzierung von Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen unter Xeno und Feeder zellfreie Kulturbedingungen. Die Zelle Kulturmethoden hier vorgestellten ermöglichen kosteneffiziente, groß angelegte Produktion von klinische Qualität Zellen auf Hornhaut Zelle Therapie Verwendung anwendbar.

Abstract

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Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen (LESCs) sind verantwortlich für das Hornhaut-Epithel kontinuierlich erneuert und damit die Aufrechterhaltung Hornhaut Homöostase und visuelle Klarheit. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete LESCs bieten eine viel versprechende Zelle Quelle für Hornhaut Zellersatztherapie. Undefiniert, xenogene Kultur und Differenzierung Bedingungen verursachen Variation in Forschungsergebnisse und behindern die klinische Übersetzung hPSC abgeleitet Therapeutika. Dieses Protokoll bietet eine reproduzierbare und effiziente Methode für hPSC LESC Differenzierung unter Xeno und Feeder zellfreie Bedingungen. Erstens dient Monolayer Kultur der undifferenzierten hPSC auf rekombinante Laminin-521 (LN-521) und definierte hPSC Medium als Grundlage für stabile Produktion von qualitativ hochwertige Ausgangsmaterial für Differenzierungen. Zweitens ergibt eine schnelle und einfache hPSC LESC Differenzierung Methode LESC Populationen in nur 24 Tagen. Diese Methode beinhaltet eine viertägige Oberfläche ektodermalen Induktion in der Schwebe mit kleinen Molekülen, gefolgt von anhaftenden Kultur Phase auf LN-521/Kollagen IV Kombination Matrix in definierten Hornhaut epithelialen Differenzierung Medium. Cryostoring und erweiterte Differenzierung weiter reinigt die Zellpopulation und Banken der Zellen in großen Mengen für Zelle Therapie Produkte ermöglicht. Die daraus resultierende qualitativ hochwertige hPSC-LESCs bieten eine potenzielle neue Behandlungsstrategie für Hornhaut Flächenrückführung, limbisches Stammzell-Mangel (LSCD) zu behandeln.

Introduction

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Die durchsichtige Hornhaut an der Augenoberfläche ermöglicht Licht in die Netzhaut und die Mehrheit der Brechkraft des Auges. Die äußerste Schicht, die geschichtete Hornhaut-Epithel wird kontinuierlich vom limbischen epithelialen Stammzellen (LESCs) regeneriert. Die LESCs befinden sich in der basalen Schicht der limbischen Nischen an der Corneoscleral Kreuzung1,2. LESCs fehlen spezifische und einzigartige Marker, so dass ihre Identifikation eine umfassendere Analyse eines Satzes von vermeintlichen Marker erfordert. Epitheliale Transkription Faktor p63 und vor allem N-Terminal verkürzten Abschrift der alpha Iso....

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Protocol

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Universität Tampere hat die Genehmigung der Nationalbehörde für rechtsmedizinische Angelegenheiten Finnland (Dnro 1426/32/300/05), Forschung an menschlichen Embryonen zu betreiben. Das Institut hat auch unterstützende Aussagen der Ethik-Ausschuß des Landkreises Pirkanmaa Krankenhaus ableiten, Kultur, und differenzieren hESC Linien (Skottman/R05116) und HiPSC Linien in Augenheilkunde (Skottman/R14023) zu verwenden. Keine neuen Zell-Linien wurden für diese Studie abgeleitet.

Hinweis: Die beschriebenen Protokoll basiert auf speziellen, im Handel erhältlichen hPSC und Hornhaut-Epithel Differenzierung Medien. Entnehmen Sie bitte der Tabe....

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Results

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Von hPSCs, hPSC-LESCs

Der gesamte Prozess von Induktion Differenzierung der FF hPSCs, Cryostoring hPSC-LESCs dauert ca. 3,5 Wochen. Schematische Übersicht über die Differenzierung-Methode, die Hervorhebung der wichtigsten Schritte ist in Figur 1Apräsentiert. Abbildung 1 b zeigt typische Morphologien der Zell-Populationen in verschiedenen Phasen des Protokolls. Die vorgeleg.......

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Discussion

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Das erwartete Ergebnis dieses Protokolls ist die erfolgreiche und robuste Generation der LESCs aus einer einzigen Zelle Aussetzung der FF hPSC innerhalb von ca. 3,5 Wochen. Hornhaut-Epithel von der Oberfläche Ektoderm29entwickelt, soll der erste Schritt des Protokolls Lenkung hPSCs gegenüber dieser Linie. Eine kurze 24 h Induktion mit Umwandlung von Wachstumsfaktor-Beta (TGF-β)-Antagonist SB-505124 und bFGF werden verwendet, um ektodermalen Differenzierung, gefolgt von 48 h mesodermalen BMP-4 Cue,.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

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Die Studie wurde unterstützt durch die Akademie von Finnland (Grant-Nummer 297886), das menschliche Ersatzteile-Programm von Tekes, Finnish Funding Agency für Technologie und Innovation, die finnische Augen- und Gewebe-Bank-Stiftung und der finnischen Kulturstiftung. Die Autoren danken die biomedizinischen Laboranten Outi Melin, Hanna Pekkanen und Emma Vikstedt Outi Heikkilä für hervorragende technische Unterstützung und Beitrag zur Zellkultur. Professor Katriina Aalto-Setälä ist anerkannt für die Bereitstellung der HiPSC Linie verwendet und BioMediTech Imaging Core Facility für die Bereitstellung von Ausrüstung für die Fluoreszenz-Bildgebung.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Material/Reagenz
1x DPBS mit Ca2+ und Mg2+Gibco#14040-091
1x DPBS ohne Ca2+ und Mg2+Lonza#17-512F/12
100 mm ZellkulturschaleCorning CellBIND#3296Kulturgefäßformat für adhärentes hPSC-LESC Differenzierung
12-Well-PlatteCorning CellBIND#3336Kulturgefäßformat für IF-Proben
24-Well-PlatteCorning CellBIND#3337Kulturgefäßformat für IF-Proben
2-MercaptoethanolGibco#31350-010
6-Well-Platte, Ultra-Low attachmentCorning Costar#3471Kulturgefäßformat für Induktion in Suspension Kultur
Alexa Fluor 488 Anti-Maus IgThermoFisher Scientific#A-21202Sekundärantikörper gegen IF
Alexa Fluor 488 Anti-KaninchenIg ThermoFisher Scientific#A-21206Sekundärantikörper gegen IF
Alexa Fluor 568 Anti-ZiegeIg ThermoFisher Scientific#A-11057Sekundärantikörper für IF
Alexa Fluor 568 Anti-Maus IgThermoFisher Scientific#A-10037Sekundärantikörper gegen IF
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, human)PeproTech Inc.#AF-100-18Btierversuchsfrei rekombinant humane FGF-basisch (154 a.a.)
BD Cytofix/Cytoperm Fixierungs-/PermeabilisierungslösungBD Biosciences#554722Fixierungs- und Permeabilisierungslösung für die Durchflusszytometrie
BD Perm/Wash BufferBD Biosciences#554723Waschpuffer für die Durchflusszytometrie
BlebbistatinSigma-Aldrich#B0560
Knochenmorphogenetisches Protein 4 (BMP-4)PeproTech Inc.#120-05A
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-Aldrich#A8022-100G
Cytokeratin 12 AntikörperSanta Cruz Biotechnology#SC-17099Primärer Antikörper für IF
Cytokeratin 14 AntikörperR& D Systems#MAB3164Primärer Antikörper für IF
Cytokeratin 15 AntikörperThermoFisher Scientific#MS-1068-PPrimärer Antikörper für IF
CnT-30CELLnTEC Advanced Cell Systems AG#Cnt-30Kulturmedium für adhärente hPSC-LESC Differenzierung
Kollagen Typ IV (human)Sigma-Aldrich#C5533Humanes Plazentakollagen Typ IV
CoolCell LX GefrierbehälterSigma-Aldrich#BCS-405
CryoPure RöhrchenSarsted#72.3801,6 mL Kryoröhrchen für die Kryokonservierung von hPSC-LESC
Definierter Trypsin-InhibitorGibco#R-007-100
Essential 8 Flex Medium KitThermo Fisher Scientific#A2858501
GlutaMAXGibco#35050061
Laminin 521Biolamina#Ln521Humanes rekombinantes Laminin 521
Δ Np63α AntikörperBioCare Medical#4892Primärer Antikörper für IF
OCT3/4 AntikörperR& D Systems#AF1759Primärer Antikörper für IF
p63α AntikörperCell Signaling Technology#ACI3066APrimärer Antikörper für IF
p63-α (D2K8X) XP Rabbit mAb (PE-Konjugat)Zellsignaltechnologie#56687p63-α PE-konjugierter Antikörper für die Durchflusszytometrie
PAX6-AntikörperSigma-Aldrich#HPA030775Primärer Antikörper für IF
Penicillin/StreptomycinLonza#17-602E
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich#158127Zellfixiermittel für IF
ProLong Gold Antifade Eindeckmittel mit DAPIThermo Fisher Scientific#P36931DAPI Eindeckmittel für harte Halterung für IF
PSC KryokonservierungskitThermo Fisher Scientific#A2644601
TrypLE Select EnzymGibco#12563-011
KnockOut Dulbecco' s modifizierter Eagle" s MediumGibco#10829018
KnockOut SR XenoFree CTSGibco#10828028
MEM nicht-essentielle AminosäurenGibco#11140050
SB-505124Sigma-Aldrich#S4696
Triton X-100Sigma-Aldrich#T8787Permeabilisierungsmittel für IF
VectaShieldVector Laboratories#H-1200DAPI Eindeckmittel für flüssige Einbettung für IF
strong>NameCompanyKatalognummer<>Kommentare
Equipment
Zytozentrifuge, z.B. CellSpin IITharmac
Durchflusszytometer, z.B. BD Accuri C6BD Biosciences
Fluoreszenzmikroskop, z.B. Olympus IX 51Olympus
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Shanmuganathan, V. A., Powell-Richards, A. O., Tighe, P. J., Joseph, A. Limbal epithelial crypts: a novel anatomical structure and a putative limbal stem cell niche. The British Journal of Ophthalmology. 89 (5), 529-532 (2005).
  2. Yazdanpanah, G., Jabbehdari, S., Djalilian, A. R.

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Corneal Limbal Epithelial Stem CellsHuman Pluripotent Stem CellsDirected DifferentiationXeno Free CultureFeeder Cell FreeLaminin 521 Collagen IVEmbryoid Body FormationSurface Ectodermal InductionAdherent DifferentiationCryopreservation

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