Method Article

Kraft-Clamp Rheometrie zur Charakterisierung von Protein-basierten Hydrogele

DOI:

10.3791/58280

⸱

August 21st, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, University of Wisconsin-Milwaukee

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine neue Kraft-Clamp Rheometrie-Technik wird verwendet, um die mechanischen Eigenschaften von geringem Volumen Protein-basierten Hydrogel Proben zwischen ein Voice-Coil-Motor und einen Kraftsensor angebunden zu untersuchen. Ein analoges Proportional-Integral-Derivat (PID) System ermöglicht das Spannen der Kraft erfahren, um das gewünschte Protokoll.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir eine Kraft-Clamp Rheometrie Methode um die biomechanischen Eigenschaften des Protein-basierte Hydrogele zu charakterisieren. Diese Methode verwendet ein analoges Proportional-Integral-Derivat (PID)-System, kontrollierte Kraft Protokolle auf zylindrischen Protein-basierten Hydrogel Proben anwenden, die zwischen einem linearen Schwingspulen-Motor und ein Kraftaufnehmer angebunden sind. Während des Betriebs passt das PID System die Erweiterung der Hydrogel-Probe, eine vordefinierte Kraft-Protokoll zu folgen, durch die Minimierung des Unterschied zwischen der gemessenen und Sollwert. Dieser einzigartige Ansatz zur Protein-basierte Hydrogele ermöglicht das Anbinden der extrem leise Hydrogel Proben (< 5 µL) mit unterschiedlichen proteinkonzentrationen. Unter Kraft-Rampe Protokolle, wo die angelegten Spannung steigt und sinkt linear mit der Zeit, das System ermöglicht die Untersuchung von der Elastizität und Hysterese Verhaltensweisen im Zusammenhang mit der (un) Faltung von Proteinen und die Messung der standard elastisch und viskoelastische Parameter. Unter konstanter Kraft, wo Kraft Puls eine Schritt-ähnliche Form, die elastische Reaktion aufgrund der Änderung in Kraft, hat ist von der Viskoelastische Antwort, stammt aus Protein-Domäne Entfaltung und umfaltung entkoppelt. Aufgrund seiner geringen Stückzahlen Probe und Vielseitigkeit bei der Anwendung der verschiedenen mechanischen Störungen ist Kraft-Clamp Rheometrie optimiert, um das mechanische Verhalten von Proteinen unter Kraft mit einem Masse-Ansatz zu untersuchen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abgesehen von einzigartigen physikalischen Eigenschaften Versprechen Protein-basierte Hydrogele revolutioniert Kraft-Spektroskopie von ermöglichen mehrere Milliarden Moleküle in einem "pull", so dass die Untersuchung von Proteinen in überfüllten Umgebungen zu messen, ähnlich denen in Haut und anderen Geweben begegnet. Protein-Domains bleiben gefaltet innen Hydrogele, so dass die Studie ihrer biomechanischen Reaktion zu zwingen, Partner und chemischen Bedingungen verbindlich. Darüber hinaus gleicht die biomechanische Reaktion des Protein-Domänen innerhalb Hydrogele die Antwort mit der Kraft der Einzelmolekül-Spektroskopie Techniken gesehen. Z. B. verringern chemische Denaturierungsmittel und Oxidationsmitteln die Stabilität des zusammengeklappten Zustand, sowohl auf die einzelnen Proteins Domäne Ebene1,2,3 makroskopischen Ebene4,5 , 6 , 7. ebenso osmolyten erhöhen die Stabilität der einzelnen Proteine8,9, führt zu einem Rückgang der Viskoelastische Antwort der Hydrogele, für das gleiche Bedingungen7,10zwingen.

Mehrere Ansätze umgesetzt um synthetisieren Protein-basierte Hydrogele, entweder durch Verwendung von physikalischen Wechselwirkungen11,12 oder kovalente Vernetzung4,13. Kovalente Reaktionen ermöglichen festen Vernetzung Standorten und diese Hydrogele kann den ursprünglichen Zustand auf eine Entfernung von der mechanischen oder chemischen Störungen erholen. Ein erfolgreicher Ansatz für kovalente Vernetzung setzt auf bilden kovalente Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen zwischen exponierten Tyrosin Aminosäuren mit Ammonium Bleichen (APS) als Oxidationsmittel und Ruthenium (II) Salz als ein Initiator (Abbildung 1)14. Bei Kontakt mit weißem Licht kann eine Lösung der konzentrierten Proteine in einem Hydrogel verwandelt werden. Durch die Kontrolle bei der Reaktion beginnt, den Protein-APS-Mix in irgendeiner Form Gießen injiziert werden können erlaubt wie Polytetrafluorethylen (CF) Rohre (Abbildung 1 b und 1 C), die Verwendung von eine extrem kleine Lösung Band15. Darüber hinaus die Verwendung von weißem Licht die Vernetzungsreaktion auslösen führt zu einer begrenzten Bleichen von fluoreszierenden Proteinen und erlaubt die Formulierung von zusammengesetzten Hydrogele mit fluoreszierenden Marker (Abbildung 1). Andere Protein-basierten Hydrogel-Bildung-Methoden verwenden Vernetzung basierend auf dem SpyTag-SpyCatcher kovalenten Wechselwirkungen16, Amin Vernetzung über Glutaraldehyd13oder Biotin-Streptavidin Interaktionen17.

Dynamische mechanische Analyse (DMA) ist derzeit eine Technik intensiv genutzt, um Polymer-basierte Hydrogele13,18zu studieren. Während DMA Konstante Kraft Protokolle auf Biomaterialien anwenden kann, bedarf es Youngs Moduli über 10 kPa und große Probenvolumina von mehr als 200 µL19. Aufgrund dieser Einschränkungen sind in der Regel Protein Hydrogele zu weich, um durch diese Technik untersucht werden. Veränderter Polyproteins sind schwerer als Polymere zu synthetisieren, da sie ein lebendes System zu produzieren erfordern, sind solche hohen Volumina ineffizient, am besten4,15. Darüber hinaus sind die meisten biologischen Gewebe weicher als 10 kPa. Verschiedene Ansätze wurden für biologische Proben, vor allem in der Studie von Muskel Elastizität20,21entwickelt. Diese Techniken können auch arbeiten unter Feedback, um konstante Kraft anwenden, sondern sind optimiert für Proben mit kleinen Durchmessern (im Mikrometerbereich) erzwingen für sehr kurze Zeit ausgesetzt (in der Regel weniger als 1 s).

Protein-basierte Hydrogele wurden erfolgreich mit modifizierten Rheometrie Techniken untersucht. Das Hydrogel Gießen, in eine Ringform ermöglicht zum Beispiel die Verwendung von extensionalen Rheometrie, den Wandel in der erfahrene Kraft als Funktion der Erweiterung4,22messen. Andere Ansätze zur Untersuchung der rheologischen Eigenschaften der Protein-basierte Hydrogele verwenden kontrollierte Schubspannung Rheometrie. Diese Techniken können auch erreichen geringen Probenvolumen und weiche Materialien zu tolerieren. Allerdings zwingt diese Methoden fehlt die Fähigkeit, das ziehen zu imitieren, dass Ursache Protein entfaltet in Vivound Elastizitätsmodul errechnet sich anhand von komplexen Theorien, die verschiedene Annahmen und Korrekturen23erfordern.

Wir haben vor kurzem berichtet, einen neuen Ansatz, der eine kleine Menge von Proteinen, die im Inneren der Rohre mit Durchmessern polymerisiert nutzt < 1 mm. Unsere erste Umsetzung dieser Technik war im Dauer-Clamp-Modus Betrieb wo das Gel nach der gewünschten Protokoll15erweitert wurde. Bei dieser Methode erleben die Proteine eine kontinuierliche Veränderung im Erweiterung und Kraft, während die Domains entfalten, macht die Interpretation der Daten umständlich. Vor kurzem haben wir eine neue Kraft-Clamp Rheometrie Technik, berichtet, wo eine Feedback-Schleife Low-Volume Protein Hydrogele, eine vordefinierte Kraft Protokoll Nr.7 (Abbildung 2) verfügbar gemacht werden können. Ein analoges PID-System vergleicht die Kraft gemessen an dem Kraftsensor mit den Sollwert vom Computer gesendet und passt die Gel-Erweiterung durch die Bewegung der Schwingspule, den Unterschied zwischen den beiden Eingängen zu minimieren. Diese "spannen" der Kraft ermöglicht nun neue Arten von Experimenten, die Biomechanik des Proteins Hydrogele zu messen.

Eine gefesselte Protein Hydrogel Erfahrungen in der Kraft-Rampen-Modus eine Konstante Zunahme und Abnahme der Kraft mit der Zeit. Die PID kompensiert Viskoelastische Verformung durch die Erweiterung auf nichtlineare Weise, je nach Art des Proteins und Hydrogel Formulierung ändern. Der Hauptvorteil der Kraft Rampe ist, dass es erlaubt die Quantifizierung der Standardparameter wie des Elastizitätsmoduls und Energiedissipation durch eine Entfaltung und umfaltung von Protein-Domains.

In konstanter Kraft-Modus ändert die einwirkende Kraft in einem Schritt-wie Mode. In diesem Modus erstreckt sich das Gel und elastisch zusammenzieht, wenn die Kraft erhöht oder, beziehungsweise verringert, gefolgt von einer zeitabhängigen Verformung. Diese Viskoelastische Verformung, statt, während das Gel eine konstante Kraft Erfahrungen bezieht sich direkt auf Domäne Entfaltung/umfaltung. Diese Erweiterung ist auf vereinfachte Weise als das Äquivalent von mehreren Milliarden Einzelmolekül Spuren im Durchschnitt zusammen und auf einmal gemessen zu sehen. Konstanter Kraft Protokolle können verwendet werden, die kriechen und Entspannung des Proteins Hydrogele als Funktion der Zeit und Kraft zu studieren. Als Funktion der Kraft, für BSA-basierte Protein Hydrogele haben wir vor kurzem gezeigt, dass es eine lineare Abhängigkeit zwischen den elastischen und Viskoelastische Ausdehnung und Rückstoß mit dem angewandten Druck7.

Hier zeigen wir den Betrieb einer Kraft-Clamp-Rheometer mit zusammengesetzten Gele, hergestellt aus einer Mischung von Protein L (8 Domänen24, dargestellt als L-8) und ein Protein L-eGFP-Konstrukt (L-eGFP), wodurch die gesamte Hydrogel fluoreszierende und leicht zu zu demonstrieren.

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Protocol

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(1) Reagenzien Vorbereitung der Lösung

  1. Bereiten Sie ein Ausgangspunkt Proteinlösung durch Auflösen/verdünnen das Protein des Interesses auf die gewünschte Konzentration, mit einem Tris-Puffer [Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane 20 mM und 150 mM NaCl, pH 7.4].
    Hinweis: Die kleinste Proteinkonzentration für die Vernetzung führt Hydrogele hängt das Protein verwendet und ist in der Regel > 1 mM.
  2. Bereiten Sie Vorräte an Ammonium Bleichen (APS) (1 M) und tris(bipyridine)ruthenium(II)-chlorid ([Ru(bpy)3]2 +) (6,67 mM) Lösungen durch Auflösen von APS und [Ru(bpy)3]2 + Pulver in der Tris-Puffer.

(2) Protein-basierten Hydrogel Synthese

  1. Befestigen Sie 23 G Nadel auf eine 1 mL Spritze mit einer gedrückten Kolben.
  2. Geschnitten Sie ein 10 cm Polytetrafluorethylen (PTFE) Rohr (mit einem Innendurchmesser von 0,022 in und einen Außendurchmesser von 0,044 in), mit einer Rasierklinge. Legen Sie die Nadel und Spritze an einem Ende des PTFE-Schlauch.
  3. Legen Sie das zweite Ende des Rohres in einem Silan-Lösung und füllen Sie das Rohr durch zurückziehen des Spritzenkolbens. Lassen Sie den Schlauch für ~ 30 min.
  4. Die Silan-Lösung entfernen und das Rohr mit Druckluft trocknen.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle die Silan-Lösung getrocknet ist und keine Rückstände im Rohr gelassen wird.
  5. Mischen Sie die Proteinlösung mit APS und [Ru (MPJ) 3]2 + in einem 1,5 mL Röhrchen mit einem konstanten Volumen-Verhältnis [z. B.15:1:1 oder 15:0.5:0.5 (V: V: V)].
  6. Wirbel die photoaktiven Lösung, bis es vollständig vermischt ist.
  7. Zentrifugieren Sie die Mischung mit maximaler Geschwindigkeit (z.B. 14.000 x g), eventuell Luftblasen aus der Lösung zu entfernen.
  8. Stecken Sie das offene Ende des behandelten PTFE-Schlauch in die photoaktiven Mischung und zeichnen Sie die Lösung in das Rohr durch zurückziehen des Spritzenkolbens.
  9. Legen Sie die geladene Röhre ~ 10 cm entfernt von einer 100 W-Quecksilber-Lampe zu verhindern, erhitzen und halten ihn dort für bis zu 30 min bei Raumtemperatur (Abbildung 1 b).
    Hinweis: In einigen Fällen kann die Belichtungszeit um Licht werden so niedrig wie 30 S. kürzere Gelierung Mal hier für fluoreszierende Gele eingesetzt, um Immunofluoreszenz begrenzen.
  10. Entfernen Sie den Schlauch von der Nadel und Schnittkanten Sie die des Rohres in der Nähe der Hydrogel endet mit einer Rasierklinge.
  11. Verwenden Sie eine abgestumpften 24 G-Nadel um zu extrudieren Sie das Hydrogel in der Tris-Lösung (Abbildung 1).
    Hinweis: Stumpfen Nadeln sind zu vermeiden, Kerben oder Schäden an der Hydrogel-Probe verwendet.
  12. Überprüfen Sie die Gele für Mängel, die während der Extrusion oder durch Luftblasen bilden und die Gele mit Mängeln zu verwerfen.

(3) Protein-basierten Hydrogel Anhaftung und Kraft-Clamp Rheometer Set-up

  1. Starten Sie das Instrument-Kontroll-Programm. Schalten Sie die Voice-Coil-Motor. Setzen Sie die Spule Position auf einen Wert am Ende des Bereichs (z.B. 7,5 mm).
    Hinweis: Die Schwingspule Position empfiehlt sich gegen Ende des Bereichs maximale Bewegungsfreiheit, um eine mögliche Erweiterung der Hydrogel zu maximieren.
  2. Verdrängen die Haken in der Z-Richtung und richten Sie sie an der Biegung in X-Richtung (das ist die Zugkraft Koordinate; siehe Abb. 2 b). Zeichnen Sie die Werte der Mikrometer Schrauben für die X-Richtung.
  3. 2 sterile Fäden in Strängen gleicher Länge geschnitten (ca. 2-3 cm; siehe Abbildung 3A und B).
  4. Binden Sie eine lose doppelten Überhandknoten in jeden der Stränge und legen Sie die 2 Schlaufen auf der Kraftsensor (Abbildung 3 und 3D) verbunden.
  5. Füllen Sie die experimentelle Kammer mit Tris-Puffer und übertragen Sie die Hydrogel-Probe in die gefüllte Kammer Medizinische Pinzette zu.
  6. Die Schwingspule und Sensor-Haken in der Nähe der Oberfläche der Lösung zu erzwingen und Ausrichten der Haken in alle Richtungen mit dem X/y/Z-Positionierung Manipulatoren.
  7. Pinzette medizinische, hängen beide Seiten der Protein Hydrogel Probe auf die Haken verbunden, die Stimme Spule und Kraftsensor (Abbildung 3).
  8. 1 Naht Schleife um das Hydrogel-Sample auf den Voice Coil-Haken mit beidseitig der Naht-Schleife mit medizinischen Pinzette halten und ziehen sie gleichzeitig anziehen (Abbildung 3D).
  9. Wiederholen Sie Schritt 3,8 für die Schleife mit dem Kraftsensor (Abbildung 3D) verbunden.
    Hinweis: Vermeiden Sie eine extreme Verschärfung der Nähte zu strukturellen Schäden und transversalen Schneiden der Hydrogel Probe zu verhindern.
  10. Ziehen Sie die Naht-Schleifen in den Kurven der einzelnen Haken zu jedem Verrutschen zu verhindern; Verwendung dieser Kurven als Referenz verweist auf um die NULL Trennung zwischen den Haken im Schritt 3.2 zu finden. Schneiden Sie die Überlängen der Nähte mit medizinische Schere (Abbildung 3D).
  11. Verschieben Sie die angefügte Hydrogel mit Z-Manipulatoren entlang der Z-Achse in Richtung der experimentellen Kammer Hydrogel in der experimentellen Lösung eintauchen.
  12. Richten Sie die Hydrogel-Probe im y-Z die Manipulatoren verwenden, so dass das Gel nicht unter Stress.
  13. Den Kraftsensor auf NULL und trennen die beiden Haken mit dem X-Mikrometer inszeniert, bis das Gel beginnt zu Kraft zu erleben. Sobald dies geschieht, etwas zurückdrehen die Mikrometer-Schraube in X-Richtung.
  14. Erfassen Sie die Position der beiden Manipulatoren für die Voice-Coil-Motor und dem Sensor und des Unterschied zwischen diesen Werten und den in Schritt 3.2 gemessen um die genaue Trennung zwischen die Anbindehaltung Haken zu Beginn des Experiments zu berechnen.
  15. Legen Sie den Bereich für den slack Kurve, ~1.5 - 2 mm und Messen Sie die Gel-Flaute (Abb. 4A).
    Hinweis: Für jede schlaffe Messung versuchen Sie, Beginn des locker-Regimes in der Nähe der ersten Stimme Spule Position ermöglicht eine optimale Anzahl von Datenpunkten, die 2 Regime (Abb. 4A) passen. Die Gel-Länge ermittelt werden, mit einer Mikrometer Auflösung über die Trennung zwischen den Haken und den Schnittpunkt zwischen den 2 Regime in den Durchhang Kurve (siehe auch Punkt 5.1). Wie der Kraftsensor mit der Zeit aufgrund von Schwankungen in der experimentellen Bedingungen treiben könnte, die Teil der locker Kurve, wo das Gel nicht unter ist, zwingen Berichte über diese mögliche Drift. Das Programm steuert das Gerät gleicht automatisch für diesen Unterschied beim Senden des Sollwert Befehls an die PID-Schleife (Abbildung 4A Einschub).

(4) Protein-basierten Hydrogel Charakterisierung mittels Kraft-Rampe gesteuert und Konstante Kraftmessungen

  1. Kraft-Rampe Experimente
    1. Um einen Kraft-Rampe Zyklus durch die Erhöhung der Kraft auf die gewünschte raumbelastung (z.B. 0,01 mN/s), geben Sie die Ausgangs- und abschließenden Kräfte und die Dauer des Protokolls als umgedrehten "V". Dann halten Sie das Gel auf 0 mN (oder geringer Kraft) für > 200 s erlauben die Protein-Domänen, zurückfaltung und die Gel-Elastizität zu erholen.
    2. Speichern Sie die Ablaufverfolgung.
  2. Konstanter Kraft Experimente
    1. Ein konstanter Kraft-Protokoll durch eine geringe Kraft (z.B. 0,1 mN) für 30 s und erhöhen Sie dann die Kraft um eine konstante Kraft (z. B. 1 mN) für einen definierten Zeitraum hinweg durchführen (z.B.120 s), gefolgt von abschrecken die Kraft wieder zu den gleichen niedrigen Wert (z.B. 0,1 mN) für > 300 s erlauben die Protein-Domänen, zurückfaltung und die Gel-Elastizität zu erholen.
    2. Nach den ersten Impuls, die Einstellungen PID auf die Reaktionszeit des Feedbacks zu maximieren (siehe Abb. 2D)-Schleife.
      Hinweis: Für steife Gele für kleine Änderungen in Kraft, die Reaktionszeit der Schleife wird durch die Elektronik des Sensors Kraft und die Reaktionszeit der Spule begrenzt und kann so niedrig wie 5 ms7sein. Für weichere Gele und große Änderungen in Kraft wird die Reaktionszeit durch die Elastizität der Hydrogele (Abb. 2D) vorgeschrieben.
    3. Speichern Sie die Ablaufverfolgung.

(5) Datenanalyse

  1. Nutzen die gemessenen Trennung zwischen den Haken und die berechnete Spule Position, wenn das Gel beginnt zu erfahren Kraft (Δx in der Abbildung 4A einzufügen), die Gel-Länge L unter Verwendung der Gleichung zu berechnen:
    L = L0 + ∆x
    L0 ist hier die Trennung zwischen den Haken, gemessen von der Position der Mikrometer Schrauben vor dem Experiment (Schritt 3.14).
    Hinweis: Für Gele mit geringen proteinkonzentrationen, die nicht in eine vollständige Vernetzung führen, ändert sich die gemessene Länge von Spur zu Spur. Auch über lange Zeiträume hinweg könntet Proteine innen Hydrogele Aging Effekte25, führen eine allgemeine Verlängerung des Gels.
  2. Normalisieren Sie die gemessene Ausweitung auf die Gel-Länge, die Belastung zu erhalten.
  3. Normalisieren Sie die gemessene Kraft der transversalen Fläche mithilfe des Innendurchmessers des Rohres zur Polymerisation verwendet.

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Results

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Abbildung 1A zeigt das Schema der photoaktiven Reaktion verwendet, um die L-EGP/L8 Hydrogel zu synthetisieren. Abbildung 1 b zeigt die Hydrogel-Mischung in das PTFE-Rohr vor und nach der photoaktivierungen. Abbildung 1 zeigt die extrudierten L-eGFP-L8 Hydrogel innerhalb einer Tris-Lösung. Die Hydrogel-Probe ist keine strukturelle Mängel wie Kerben. Hydrogele mit deutlich sichtba...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir eine Kraft-Clamp Rheometrie-Technik um die biomechanischen Antwort von geringem Volumen Protein-basierte Hydrogele zu untersuchen. Darüber hinaus ist ein Protokoll zur Verfügung gestellt, um eine einheitliche zylindrische Low-Volume-Protein Hydrogel Probe zu synthetisieren. Ein Protokoll wird ebenfalls dargestellt, die beschreibt, wie man verschiedene Arten von Protein-basierten Hydrogele mit unterschiedlichen Elastizitäten zu binden, ohne dass mechanische Verformung oder Beschädigung des Protein-bas...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir anerkennen die finanziellen Unterstützung von Wachstum Forschungsinitiative (Award Nr. 101 X 340), National Science Foundation, großer Instrumentierung Forschungsprogramm (Grant Nr. PHY-1626450), größere Milwaukee-Stiftung (Shaw Award) und University of Wisconsin System (angewandte Forschung Grant).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SI-KG4A KraftaufnehmerWorld Precision Instruments (WPI)SI-KG4A
lineare SchwingspulenmotorenLFA2010
RinderserumalbuminRocky Mountain Biologicals (RMBIO)BSA-AAF-1XG / 100 G
TrizmaSigma-AldrichT1503-1KG
NatriumchloridSigma-AldrichS7653-1KG
AmmoniumpersulfatSigma-Aldrich248614-100G
Tris(bipyridin)ruthenium(II)-chloridSigma-Aldrich544981-1G
EXPRESS MEDICAL SUPPLIES  6-0 NYLON SUTURE 12/PKFisher ScientificNC0395626
nur 1 ml-Spritze, Luer-Lok-SpitzeBD309628
Silan, SigmacoteSigma-AldrichSL2-25ML
PTFE-Schlauch mit Mikrobohrung, 0,022" ID x 0,042" OD, 100 ft/RolleCole-ParmerEW-06417-21
Injektionsnadel, 23 Gaugefür die Gesundheitsversorgung Profis305194
Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dosierspitzen - 24 gaugeKIMCOJG24-1.5X
USH-103D USHIO 100W Kurzbogen QuecksilberlampeALBUSH-103D USHIO
Medical Pinzette
Medizinische Schere
Olympus
Der Computercode und die CAD-Konstruktion der Sonderteile können auf Anfrage dem entsprechenden Autor zur Verfügung gestellt werden.
Lösungen für

References

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