Das Schneiden und schwimmende Methode für Paraffin-eingebetteten Gewebe für Schneiden

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Verbesserung der Paraffin-Schnitt. Diese Methode verbindet schneiden und schweben mit einer einfachen thermostatischen Kammer, um den Transfer-Prozess erforderlich, nach der herkömmlichen Methode zu vermeiden. Infolgedessen wurden die Effizienz und die Anzahl der intakten Paraffin Abschnitte erheblich verbessert.

Abstract

Histologie und Pathologie ist das Schneiden von Paraffin-eingebetteten Gewebe verbreitet. Jedoch ist es langweilig. Um diese Methode zu verbessern, haben mehrere Handelsgesellschaften komplexer Abschnitt Transfersysteme mit fließenden Wasser entwickelt. Um diese Technologie zu vereinfachen, haben wir eine einfache Methode mit hausgemachten Ausrüstung, die schneiden und schwimmend in einem einfachen thermostatischen vereint; Geben Sie deshalb die Abschnitte automatisch das Wasserbad auf der Wasseroberfläche. Im Hippocampus von Erwachsenen mäusegehirnen, Erwachsenen Maus Nieren und embryonalen mäusegehirnen Erwachsenen Zebrafisch Augen wurden mit konventioneller Paraffin-Schnitt und die vorgestellte Methode zum Vergleich geschnitten. Statistische Analyse zeigt, dass unsere verbesserte Methode Zeitersparnis und höhere Qualität Teile produziert. Darüber hinaus ist es einfach für junior Operatoren, Paraffin-Schnitt einer ganzen Probe in kurzer Zeit.

Introduction

Morphologische Studie ist wichtig in der biologischen Forschung. Obwohl neuer Technologie Forscher beobachten ihre Ziele direkt aus dem gesamten Gewebe oder Organismen^1,2,3, schneiden die Probe in Dünnschliffen, gefolgt von Färbung erlaubt hat, bleibt die primäre Methode Fornot nur Gewebe Morphologie, sondern auch Protein targeting direkt im Gewebe. Lichtmikroskopie verwendet drei Schnitttypen: Paraffin, gefrorene und Ansät. Obwohl Kryoschneiden üblich ist, dass Gewebe Antigenität zu schützen und die Probenvorbereitung einfach ist, ist die einbehaltene Gewebe Morphologie Arm und ungeeignet für dünne Stationspunkte^4,5. Paraffin-Schnitt ist die am häufigsten verwendeten Methode für die Ausstellung von gut erhaltenen Morphologie. Die Exemplare sind völlig dehydriert und in Wachs eingebettet, können der Paraffin-Blöcke auf unbestimmte Zeit gespeichert werden. Darüber hinaus produziert die Paraffin-Schnitt dünne Abschnitte, die Verbesserung der biologischen Sonde Zugang in weiteren Experimenten und reduzieren Zelle Schicht Overlay in Z-Richtung.

Doch herkömmliche Paraffin-Schnitt ist mühsam und erfordert Betreiber können. Paraffin-Abschnitte durchlaufen Fixierung, Austrocknung, einbetten, schneiden und schweben. Wichtiger ist Abschnitt Bänder aus dem Messerhalter auf dem Wasserbad zu übertragen notwendig, aber schwierig für junior-Betreiber. Besonders bei trockener Luft die Abschnitt-Bänder werden durch statische Elektrizität drehen und sind schwierig, auf dem warmen Wasser entfalten. Zur Verbesserung der Abschnitt sind Qualität, Befeuchtung der exponierten Gewebeoberfläche zwischen Mikrotom Klinge Pässe, die Wachs-Blöcke, Eintauchen in eiskaltes Wasser, oder erhöht die Luftfeuchtigkeit mit einem Luftbefeuchter in der Nähe von Mikrotom Kühlung^6,7 empfohlen. . Neuere Methoden zur Verbesserung der Paraffin-Schnitt gehören Hybrid Paraffin einbetten, Kryoschneiden⁸und Handelsabteilung Transfer System Hilfe⁹. Obwohl diese Methoden teilweise Paraffin verbessern schneiden, Geschwindigkeit und Qualität, sie schneiden machen viel schwerfälliger und Handelsabteilung Transfersysteme sind teuer.

In diesem Protokoll führen wir flexible, einfache und billige Geräte Schritt für Schritt zu schaffen, die an den Klingenhalter ein rotary Mikrotom angeschlossen werden können. Dieses Gerät umfasst einen Abschnitt-Kanal, ein Wasserbad und eine Heizung mit Erkennung Temperaturschalter. Nach dem Schneiden, Dutzende von Abschnitte fließen in den Abschnitt Kanal und geben Sie das Wasserbad direkt, damit automatisch entfaltet. Dies verbessert die Effizienz der Paraffin-Schnitt und macht diese Technologie noch komfortabler. Mit Hilfe dieser Methode, mehr Erwachsene Maus hippocampal Abschnitte, Erwachsenen Maus Niere Abschnitte, embryonale 15,5 Tage alte (E15.5) Maus Gehirn Abschnitte und Erwachsenen Zebrafisch Auge Abschnitte wurden geerntet in kürzerer Zeit und morphologisch mehr intakt geblieben. Diese Methode kann auch für andere Gewebeproben, die erfordern beschleunigte Paraffin-Schnitt und verhindern, dass der Abschnitt Unterscheidung verwendet werden.

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Animal Care und Nutzung Ausschuss von Nanchang University genehmigt.

1. Montieren Sie das Gerät und schließen Sie das Mikrotom

1. Entwerfen Sie den Parameter gemäß den Anforderungen (ergänzende Abbildung 1).
2. Einreichen des Parameters zu einer Fabrik zur Herstellung von Acryl-Boards.
3. Montieren Sie alle Teile in der Reihenfolge: Verwenden Sie Chloroform, um 7 gewerbliche Acryl Boards in einen Tank mit einem Abschnitt Kanal und Wasser Bad (Abbildung 1) zu kombinieren.
   Achtung: Chloroform produziert giftige Substanzen trifft es Licht und Sauerstoff. Montieren Sie das Gerät in einer Dampfhaube.
4. Installieren Sie die röhrenförmigen elektrisches Heizelement durch das Loch in Acryl Board #1 (Abbildung 2A, Pfeilspitze).
5. Um die Temperatur-Controller zu installieren, erstellen Sie ein kleines Loch auf der #2 Acryl Board mit einer elektrischen Bohrmaschine, und installieren Sie den Temperatur-Detektor (Abbildung 2A, Pfeil). Installieren Sie ein digitales Thermostat auf dem Tank (Abbildung 2A).
   Hinweis: Die Temperatur-Detektor sollte innerhalb 1 cm unterhalb der Wasseroberfläche liegen.
6. Um Kraft zugreifen, passen Sie die Spannung unter 24 V bevor Sie das Gerät einschalten.
7. Entfernen Sie die Schnittabfallwanne aus Mikrotom.
8. Verknüpfen Sie die Abschnitte-Kanal mit dem Mikrotom-Klingenhalter mit neutraler Silikondichtstoff (Abb. 2 b).
   Hinweis: Schmieren Sie jede neutrale Silikon-Dichtstoff über der Spitze des Messers nicht, so dass die alte Klinge leicht ersetzt wird.
9. Trocknen Sie über Nacht um die Chloroform und neutral Silikon-Dichtstoff Zeit zu erstarren lassen.
10. Installieren Sie die Klinge auf der Klingenhalter. Gießen Sie Wasser in das Wasserbad (Abbildung 2). Die Wasseroberfläche sollte nur den oberen Bereich des Blatts (Abb. 2D, Pfeilspitze) berühren.

(2) Paraffin-Schnitt

Hinweis: Trümmer oft an den oberen oder unteren Kanten des Wachs-Blocks und der Wasseroberfläche ansammeln. Diese Ablagerungen sollten regelmäßig gelöscht werden.

1. Durchführen Sie herkömmliche Paraffin¹⁰-Schnitt.
   1. Klemmen Sie das Paraffin-eingebetteten Exemplar auf einer rotierenden Mikrotom und setzen Sie das Messer in einem Messerhalter.
   2. Drehen Sie das Handrad und Abschnitt der Probekörpers.
   3. Übertragen Sie das Paraffin geschnittene Band auf 38,5 ° C warmen Wasserbad.
   4. Holen Sie ab, die in den Abschnitten auf das Mikroskop von der Wasseroberfläche nach Entfaltung zu schieben.
   5. Trocknen Sie die Folien in einem Ofen bei 42 ° C über Nacht.
2. Verbesserte Paraffin-Schnitt (Abb. 3)
   1. Schliessen Sie das Gerät.
   2. Öffnen Sie das Heizgerät mit Temperaturschalter Erkennung und stellen Sie gezielte Temperatur zwischen 38,0 ° C bis 40,0 ° C für 1 h im voraus, um das Wasser warm ein.
   3. Ändern Sie den paraffinblock erworben durch das Paraffin einbetten; dann das Mikrotom Kassette Klemme der paraffinblock aufsetzen und einrasten.
      Hinweis: Die superior und inferior Grenzen der paraffinblock sollten horizontal geändert werden, um zu verhindern, dass die Abschnitt Multifunktionsleiste aus bilden einen Bogen und nicht mehr durch den schmalen Abschnitten Kanal fließen.
   4. Schnell Ansatz der Probenmaterials durch Schneiden dicker Abschnitte.
   5. Passen Sie auf eine geeignete Schnittdicke (10 µm Erwachsener Mäuse Köpfe, Erwachsenen Maus Nieren und Embryo mäusegehirnen, 4 µm für Zebrafisch Augen). Drehen Sie das Handrad und die Abschnitten treten automatisch die Abschnitte Kanal und Bad.
   6. Abschnitt der Probe in eine langsame und gleichmäßige schneiden Schlaganfall (Abb. 3A).
      Hinweis: Thethickness des ersten Abschnitts wird geändert werden, nachdem das Handrad für ein paar Minuten gestoppt wurde. Die klingen sollten ersetzt werden, wenn die Abschnitte in Folge Kratzer haben.
   7. Führen Sie die Abschnitte in die Badewanne Kammer in einer Linie (Abb. 3 b, 3 C) zu schweben.
      Hinweis: Wenn das Kopfteil an der Kammerwand hält, verwenden Sie eine Bürste Anleitung schwimmend weiterhin.
   8. Abschnitte auf Objektträger zu halten. Entfalten Sie nach den Abschnitten voll im Wasserbad, separate mehrere Abschnitte mit einer Pinzette. Dann holen sie aus dem Wasserbad auf den Objektträger (Abbildung 3D).
      Hinweis: Abschnitte sollten aus dem Hinterteil des Wasserbades, abgeholt werden wie in den Abschnitten-Kanal und der vorderen des Wasserbades noch nicht voll entfaltet werden.
   9. Trocknen Sie die Folien werden, indem sie in einem 42 ° C Ofen über Nacht. Die Folien können dann auf unbestimmte Zeit bei Raumtemperatur gelagert werden.
3. Verwenden Sie Färbung Hämatoxylin-Eosin (HE) aus Gründen der Bewertung der verbesserten Methode⁸.

Results

Die verbesserte Methode stieg die Zahl der intakten Paraffin Abschnitte. Wir haben diese neue Methode auf Erwachsenen Maus hippocampal Gewebe, Erwachsenen Maus Nieren und embryonalen mäusegehirnen Zebrafisch Augen getestet. Wasser wurde hinzugefügt, um den Tank, und die Wassertemperatur war zwischen 38,0 ° C bis 40,0 ° c gehalten Sie waren nach einem seriell Vorbereitung der Gewebeproben, geschnitten und im Vergleich zu herkömmlichen schneiden. Die neue Methode Abschnitt Verlust zu vermei...

Discussion

Zur Verbesserung von Paraffin Abschnitt Morphologie und lösen das Problem der verschwendete Zeit während konventioneller Paraffin-Schnitt, haben wir eine verbesserte Paraffin-Schnitt-Methode, die schneiden und Entfaltung verbindet. Diese verbesserte Methode beruht auf einfache Geräte, die einen Abschnitt-Kanal, ein Wasserbad und eine Heizung mit Erkennung Temperaturschalter umfasst. Der Abschnitt Band betritt das Wasserbad durch den Abschnitt Kanal und entfaltet sich automatisch beim Schneiden. Daher verbessert diese Met...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inkubator	Boekel Scientific	133000-2
Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Deckel	64-17-5
Xylol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Deckel	1330-20-7
Paraplast	Leica	39601006
Beheiztes Paraffin-Einbettungsmodul	Leica
Kommerzielle Acrylplatte
Trichlormethan	Sinopharm Chemical Reagent Co., Deckel	67-66-3
Röhrenförmiges elektrisches Heizelement (12 V 200 W)
Temperaturregler (12 V 120 W)	Mingsuo	XH-W3002
Rotationsmikrotom	Leica
Neutral Silikondichtstoff			Verbinden Sie den Wasserkanal mit dem Mikrotom-Messerhalter
Spannungswandler	Dearll	S-250-12
Einwegklinge	Accu-Edge	4689
Hämatoxylin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Eosin	Baso Diagnostics Inc.	BA-4025
Microslide	Sail Marke	7105
Neutraler Balsam	Sinopharm Chemisches Reagenz Co., Deckel	10004160
Deckglas	Citoglas	10212424C
Mikroskop	Carl Zeiss
Salzsäure	Xilong Chemical	7647-01-0
Wasserbad für Paraffinschnitte	Leica
HistoCore Arcadia C - Kühlplatte	Leica
Paraffinabwehrspray	Thermo Scientific	9990420