TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Summary

Wir beschreiben eine Schritt für Schritt Protokoll für Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), die es die Analyse der Zelle-typspezifischen genomweite Histon-Modifikation ermöglicht.

Abstract

Epigenetischen Regulation spielt zentrale Rolle in der Genexpression. Da Histon Änderungen in den 1960er Jahren entdeckt wurde, haben seine physiologischen und pathologischen Funktionen ausgiebig studiert. Das Aufkommen der Tiefe Sequenzierung der nächsten Generation und Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) über spezifische Histon Modifikation Antikörper hat in der Tat, unsere Sicht der epigenetischen Regulation über das Genom revolutioniert. Umgekehrt Gewebe bestehen typischerweise aus verschiedenen Zelltypen und ihre komplexe Mischung stellt analytische Herausforderungen an das Epigenom in einem bestimmten Zelltyp zu untersuchen. Um den Zellstatus typspezifische Chromatin in einer genomweiten Weise zu begegnen, haben wir vor kurzem entwickelt Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), basiert auf die selektive Reinigung von Chromatin von tagged Kern Histonproteine von Zelle Arten von Interesse, gefolgt von ChIP-seq. Das Ziel dieses Protokolls ist die Einführung von best Practices der tChIP-seq. Diese Technik bietet ein vielseitiges Werkzeug für gewebespezifischen Epigenom Untersuchung in verschiedenen Histon-Modifikationen und Modellorganismen.

Introduction

Gewebe von Tieren bestehen aus unterschiedlichen Zelltypen. Die Genregulation in jeder Zelle definiert die Zelltyp. Chromatin Modifikationen - DNA-Methylierung und Histon Modifikation - unterliegen die Zelltyp Spezifität der Genexpression. So, die Messung der epigenetischen Regulation in jeden Zelltyp wurde gewünscht, aber es war eine technische Herausforderung.

Um die Epigenetik in einem bestimmten Zelltyp zu untersuchen, war Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq) neu entwickelte ()Abbildung 1()¹. In tChIP drückt sich Epitop-Tags....

Protocol

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Abteilung Sicherheit des RIKEN (H27-EP071) genehmigt und mit entsprechenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

(1) Gewebe Dissektion

1. Sezieren das Gewebe von Interesse in kleine Stücke (ca. < 3 mm²) mit einer feinen Feder Schere.
   Hinweis: Größere Gewebefragmente länger zu frieren, und kleinere Stücke tragen über größere Mengen des Puffers, die die Ergebnisse beeinflussen können.
2. Einen sauberen Behälter mit flüssigem Stickstoff gefüllt seziert Gewebefragmente hinzu und sammle sie in 2 mL Röhrchen (1 Stück pro Röhre) mit flüssigem Stickstoff gefüllt.
   Hi....

Results

Hier beschreiben wir Gewebe Dissektion, Fixierung, Zelle Lysis Tandem Reinigung von Chromatin und DNA-Bibliothek Vorbereitung für nächste Generation Sequenzer. Im Verlauf der Verfahren kann man die Qualität der DNA, testen, das ist der Schlüssel für erfolgreiche Sequenzierung in mehreren Schritten (Abbildung 2). Da ein einzelnes Nukleosom in der Regel 147 bp DNA ^{4 umgeben ist}sollte geschert DNA nicht kürzer als dieser Größe sein. Sofor.......

Discussion

Unser Protokoll wurde für die Nervenzellen des Mausgehirns optimiert, der Ausdruck der Flagge markiert H2B durch Tamoxifen Injektion induziert wird. Promotoren verwendet für H2B Ausdruck, Ausgangsstoffe Gewebe und die Menge des Gewebes sind entscheidende Parameter für erfolgreiche tChIP-seq. Die Optimierung dieser Faktoren sollte somit für jeden Zelltyp des Interesses betrachtet werden.

Ein entscheidender Schritt zu den Verfahren, die in diesem Protokoll verwendeten ist die DNA Scheren um eine.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protein LoBind Röhrchen, 2 mL	Eppendorf	Nr.  0030108132	Für die Zelllyse
Protein LoBind Röhrchen, 1,5 mL	Eppendorf	Nr.  0030108116	Für ChIP und Bibliotheksvorbereitung
DNA-LoBind-Röhrchen, 1,5 mL	Eppendorf	Nr.  0030108051	Für ChIP und Bibliotheksvorbereitung
8-Streifen-PCR-Röhrchen	BIO-BIK	3247-00	Für ChIP und Bibliotheksvorbereitung
SK Mill	TOKKEN	SK-200	Handliche Kryomühle zur Herstellung von Zellpulver für die Fixierung
Metallkugel	TOKKEN	SK-100-DLC10	Zubehör von SK Mill
2 mL Edelstahlröhrchen	TOKKEN	TK-AM5-SUS	Eine Option für Zelle Lyse
2 mL Edelstahl-Röhrchenhalter	TOKKEN	SK-100-TL	Eine Option für die Zelllyse
16% Formaldehyd (w/v), methanolfrei	Pierce	28906	Zur Fixierung von Zellen. Bereiten Sie vor Gebrauch eine 1%ige Lösung vor.
Glycin	Nacalai Tesque	17109-35	Vorbereiten 2,5 M Vorrat
D-PBS (-)(1x)	Nacalai Tesque	14249-24	Zum Waschen von Lysat und gereinigter DNA
HEPES	Nacalai Tesque	02443-05	Zum Lysepuffer 1. Bereiten Sie 1 M, pH 7,5 Brühe vor.
5 M NaCl, molekularbiologische Qualität	Nacalai Tesque	06900-14	für Lysepuffer 1, Lysepuffer 2, ChIP-Elutionspuffer und Tris-EDTA-NaCl-Puffer
0,5 M EDTA, molekularbiologische Qualität	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	311-90075	Für Lysepuffer 1, Lysepuffer 2, ChIP-Elutionspuffer und Tris-EDTA-NaCl-Puffer
Glycerol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	072-04945	Für Lysepuffer 1
NP-40	Nacalai Tesque	25223-75	Für Lysepuffer 1
Triton X-100, Molekularbiologie	Nacalai Tesque	12967-32	Für Lysepuffer 1
Tris	Nacalai Tesque	35406-91	Für Lysepuffer 2, ChIP-Elutionspuffer und Tris-EDTA-NaCl-Puffer. Bereiten Sie 1 M, pH 8,0 Brühe vor.
0,1 M EGTA pH-neutral	Nacalai Tesque	08947-35	Für Lysepuffer 2
Proteaseinhibitor-Cocktail (100x)	Nacalai Tesque	25955-24	Zur Blockierung des Proteinabbaus
RIPA-Puffer	Thermo Fisher Scientific	89900	Für die Zelllyse und das Waschen
milliTUBE 1 mL AFA-Faser	Covaris	520130	Sonicator-Röhrchen. Zubehör des fokussierten Ultraschallgeräts
Fokussierter Ultraschallgerät	Covaris	S220 oder E220	Zum Verdau von DNA in eine angemessene Größe für ChIP-Seq
UltraPure 10% SDS	Thermo Fisher Scientific	15553-027	Für ChIP-Elutionspuffer
RNase A	Nacalai Tesque	30141-14	Zur Aufreinigung von DNA aus Lysat
Proteinase K, rekombinant,	PCR-Qualität Sigma-Aldrich	3115887001	Zur Reinigung von DNA aus
Lysat-Ethanol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	054-07225	Herstellung eines 70%igen
Lösung Monoklonaler Anti-FLAG M2-Antikörper, der in der Maus hergestellt	wurde Sigma-Aldrich	F1804	Zur Reinigung von Chromatin, das in interessierenden Zellen exprimiert wird
Dynabead M-280 Schaf Anti-Maus IgG	Thermo Fisher Scientific	11201D	Dies kann für Anti-FLAG IP und Anti-H3K4me3 IP
Anti-Trimethyl-Histon H3 (K4), monoklonaler Maus-Antikörper	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	301-34811	Jeder andere Antikörper, der für die ChIP-Analyse geeignet ist, funktioniert
10x Blockierungsreagenz	Sigma-Aldrich	11096176001	Zur Blockierung während der Affinitätsreinigung
Denhardt' Lösung	Nacalai Tesque	10727-74	Zur Blockierung während der Affinitätsreinigung
Glykogen (5 mg/ml)	Thermo Fisher Scientific	AM9510	Zur Aufreinigung von DNA aus Lysat
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q32866	Zur Quantifizierung isolierter DNA
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	Zur Quantifizierung von isolierter DNA
0,5 mL Röhrchen	Axygen	10011-830	Zur Quantifizierung mittels Qubit
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1)	Nacalai Tesque	25970-56	Zur Aufreinigung von DNA aus Lysat
AMPure XP Kügelchen	Beckman Coulter	A63881	SPRI Magnetische Kügelchen für die Bibliotheksvorbereitung
Metalleisregal	Funakoshi	IR-1	Zum Einfrieren
des ZelllysatsProbenkühler	New England Biolabs	T7771S	Hilft bei der Fixierung von Zellen mit minimalem Schaden
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939BA	Zur Überprüfung der Qualität isolierter DNA-Fragmente. Ein anderer Fragmentanalysator kann verwendet werden.
Bioanalyzer 2100 Expert Software	Agilent Technologies	G2946CA	im Lieferumfang enthalten ist das Bioanalyzer
High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies	5067-4626	Zur Überprüfung der Qualität der isolierten DNA-Fragmente
KAPA LTP Library Preparation Kit	Roche	07961898001	Geliefert mit 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase und PEG/NaCl Lösung
NEXTflex DNA Barcodes	BIOO Scientific	NOVA-514101	Adapter für die Bibliotheksvorbereitung. Lieferung mit DNA-Barcode-Adaptern und Primer-Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification Kit	Roche	07959028001	Lieferung mit 2x KAPA HiFi HS Real-Time PCR Master Mix, PCR Primer Mix und Fluoreszenzstandards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Roche	KM2602	Für die Bibliotheksvorbereitung. Darüber hinaus kann dieses Enzym für das KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EB	Qiagen	19086	10 mM Tris-Cl, pH 8,5 für die Elution von DNA
386-Well-qPCR-Platte	benötigt werden Thermo Fisher Scientific	4309849	Für die Echtzeit-PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher	Scientific 4485701	Zur Quantifizierung von DNA
MicroAmp Optischer Klebefilm	Thermo Fisher	Scientific 4311971	Für Echtzeit-PCR
MicroAmp Durchsichtige Klebefolie	Thermo Fisher Scientific	4306311	Für die Plattenversiegelung
Endreparatur-Mastermix			Kombinieren Sie 1,4 & Mikro; L von 10x KAPA End Repair Buffer, 1 & Mikro; L des KAPA End Repair Enzyme Mix und 1,6 µ L H2O
A-taling Mastermix			Combine 1 & micro; L KAPA A-Tailing-Puffer, 0,6 &μ; L des KAPA A-Tailing Enzyms und 8,4 µ L H2O
Ligationspuffermischung			Kombinieren Sie 2 & micro; L von KAPA-Ligationspuffer und 6 µ L H2O
Real-time PCR Mastermix			Kombinieren Sie 5 & Mikro; L von 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0,35 & Mikro; L PCR Primer Mix (10 & Mikro; M jeweils von Forward Primer AATGATACGGCGACCGAG und Reverse Primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG) und 3.15 µ L H2O
PCRMastermix			Kombinieren Sie 10 & Mikro; L von 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0,9 & Mikro; L PCR-Primer-Mix und 0,6 & Mikro; L von H2O
Integrative Genomics Viewer	Broad Institute	IGV_2.3.88	Genombrowser zur Visualisierung von Sequenzierungsdaten
DNA Olgionukleotid: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′	Eurofins Genomics		Ein Primer zur Amplifikation der Promotorregion von GAPDH-DNA
Olgionukleotid: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′	Eurofins Genomics		Ein Primer zur Amplifikation der Promotorregion von GAPDH
SYBR Premix Ex Taq	Takara	RR420L	Zur Quantifizierung der DNA, die der GADPH-Promotorregion entspricht
Thermocycler Dice	Takara	TP870	Zur Quantifizierung der DNA, die der GADPH-Promotorregion entspricht