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Methodenartikel

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

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DOI:

10.3791/58298

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23. Januar 2019

 ,  ,  , 
1RNA Biology Laboratory, RIKEN, 2RNA Systems Biochemistry Laboratory, RIKEN Cluster for Pioneering Research, 3Laboratory for Phyloinformatics, RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, 4RNA Biology Laboratory, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 5Department of Computational Biology and Medical Sciences, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Schritt für Schritt Protokoll für Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), die es die Analyse der Zelle-typspezifischen genomweite Histon-Modifikation ermöglicht.

Zusammenfassung

Epigenetischen Regulation spielt zentrale Rolle in der Genexpression. Da Histon Änderungen in den 1960er Jahren entdeckt wurde, haben seine physiologischen und pathologischen Funktionen ausgiebig studiert. Das Aufkommen der Tiefe Sequenzierung der nächsten Generation und Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) über spezifische Histon Modifikation Antikörper hat in der Tat, unsere Sicht der epigenetischen Regulation über das Genom revolutioniert. Umgekehrt Gewebe bestehen typischerweise aus verschiedenen Zelltypen und ihre komplexe Mischung stellt analytische Herausforderungen an das Epigenom in einem bestimmten Zelltyp zu untersuchen. Um den Zellstatus typspezifische Chromatin in einer genomweiten Weise zu begegnen, haben wir vor kurzem entwickelt Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), basiert auf die selektive Reinigung von Chromatin von tagged Kern Histonproteine von Zelle Arten von Interesse, gefolgt von ChIP-seq. Das Ziel dieses Protokolls ist die Einführung von best Practices der tChIP-seq. Diese Technik bietet ein vielseitiges Werkzeug für gewebespezifischen Epigenom Untersuchung in verschiedenen Histon-Modifikationen und Modellorganismen.

Einleitung

Gewebe von Tieren bestehen aus unterschiedlichen Zelltypen. Die Genregulation in jeder Zelle definiert die Zelltyp. Chromatin Modifikationen - DNA-Methylierung und Histon Modifikation - unterliegen die Zelltyp Spezifität der Genexpression. So, die Messung der epigenetischen Regulation in jeden Zelltyp wurde gewünscht, aber es war eine technische Herausforderung.

Um die Epigenetik in einem bestimmten Zelltyp zu untersuchen, war Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq) neu entwickelte ()Abbildung 1()1. In tChIP drückt sich Epitop-Tags Kern Histon Protein H2B aus einer Zelle-Typ-spezifischen Promotor. Dieses Feature ermöglicht die Isolierung des Chromatins aus den Zellen von Interesse, obwohl das Material aus einer Mischung von verschiedenen Zelltypen beginnt. Folgende ChIP-Seq-Chromatin Reinigung über einen geändert-Histon Mark und Tiefe Sequenzierung der nächsten Generation der isolierten DNA – wir können den epigenetischen Status des gezielten Zelltyps in einer genomweiten Weise überwachen.

Mit dieser Technik, untersuchten wir vor kurzem Neuron-spezifische Trimethylation von Histon H3-Proteins an Lysin 4 (H3K4me3) markiert. In dieser Studie entwickelten wir eine Knock-in-Maus in die C-unheilbar Flagge markiert H2B Protein bei der Cre-vermittelten Rekombination (Rosa26CAG Floxed-pA H2B-FLAG) zum Ausdruck kam. Durch Kreuzung mit einer Maus besitzen das Cre-endoplasmic Reticulum (ER)-gen unter der Kontrolle des CamK2a-Promotors induziert der erhaltenen Mauslinie H2B-FLAG in aktiven Neuronen auf Tamoxifen Injektion (Camk2aH2B-FLAG)1. Das Gehirn der etablierten Mauslinie ab, führten wir tChIP-Seq mit Anti-H3K4me3 Antikörper. Da H3K4me3 Marken oft Förderer Regionen entsprechen, konnten wir Hunderte von mRNAs konkret ausgedrückt in Neuronen1entdecken.

Hier beschreiben wir eine typische tChIP-Seq-Methode, die die Schritte vom Gewebe Dissektion bis Bibliotheksbau ()Abbildung 1() umfasst. Das Endziel dieses Protokolls ist, unsere best Practices für die Leistung der tChIP-Seq und die künftige Anwendung dieser Methode zu anderen Zelltypen und Histon-Modifikationen zu teilen.

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Protokoll

Alle hier beschriebene Methoden wurden von der Abteilung Sicherheit des RIKEN (H27-EP071) genehmigt und mit entsprechenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

(1) Gewebe Dissektion

  1. Sezieren das Gewebe von Interesse in kleine Stücke (ca. < 3 mm2) mit einer feinen Feder Schere.
    Hinweis: Größere Gewebefragmente länger zu frieren, und kleinere Stücke tragen über größere Mengen des Puffers, die die Ergebnisse beeinflussen können.
  2. Einen sauberen Behälter mit flüssigem Stickstoff gefüllt seziert Gewebefragmente hinzu und sammle sie in 2 mL Röhrchen (1 Stück pro Röhre) mit flüssigem Stickstoff gefüllt.
    Hinweis: Für diesen Schritt sind Rohre mit einer hydrophilen Oberfläche empfohlen.
  3. Legen Sie die Rohre bei-80 ° C > 5 min. mit dem Deckel offen für den restlichen flüssigen Stickstoff verdampft.
    Hinweis: Nach dem Schließen der Kappe, können Gewebefragmente bei-80 ° C für einen Monat vor dem Gebrauch gespeichert werden.

(2) Zelle Fixierung

Hinweis: Wir ein handliches kryogenen Wandler benutzt, für diesen Schritt. Eine alternative Vorrichtung kann verwendet werden.

  1. Statt der 2 mL-Proteinbindung niedrigen Röhren die Gewebeproben auf einem Gestell Metall Eis in flüssigem Stickstoff gekühlt.
  2. Legen Sie eine Metall-Kugel in eine 1,5 mL-Tube und Chill mit flüssigem Stickstoff. Legen Sie es auf das Metall Eis-Rack.
  3. Öffnen Sie der 2-mL-Tube und legen Sie die prechilled Metall-Kugel in die Röhre. Schließen Sie den Deckel, Schlauchhalter ein handliches kryogenen Mühle eingelassen Sie 2 mL-Röhrchen und sofort Tauchen Sie die montierten Rohrhalter in flüssigem Stickstoff für 1 min.
  4. Legen Sie die gefrorenen Rohrhalter in die äußere Kassette der handliche kryogenen Mühle und kräftig schütteln 60mal für 30 s.
  5. Zerlegen Sie der Rohrhalter, entfernen Sie die Metall Kugel, und statt der 2 mL-Tube auf einer Stichprobe Kühler prechilled bei-20 ° C.
  6. Legen Sie die Probe Kühler bei-20 ° C für 15 min zum Einfrieren von das Fixiermittel im nächsten Schritt zu verhindern.
  7. Bringen Sie die Probe Kühler auf die Bank, öffnen Sie den Deckel des Rohres und sofort Tropfen Sie 900 µL 1 % Formaldehyd hinein. Nach dem Pipettieren mehrmals, übertragen Sie die Aussetzung in neuen 2 mL-Röhrchen mit 900 µL 1 % Formaldehyd und Fix für 10 min mit sanften Drehung in einem Inkubator gesetzt bei 23 ° C.
    Achtung: Formaldehyd ist giftig und schädlich.
  8. Um die Fixierung Reaktion zu stoppen, hinzu kommen 100 µL 2,5 M Glycin jedes Rohr und Zentrifuge für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C. Verwerfen Sie den überstand.
  9. Fügen Sie 1 mL eiskaltes Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Zentrifuge für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C und verwerfen Sie den überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal (3 Wäschen insgesamt).
    Hinweis: Feste Proben können Blitz von flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c gelagert werden
  10. Hinzufügen von 500 µL Lysis Puffer 1 (50 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-Säure (HEPES)-KOH (pH 7,5), 140 mM NaCl, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) (pH 8,0), 10 % w/V Glycerin, 0,5 % w/V NP-40, 0,25 % w/V Triton X-100 und 0,1 X Protease-Inhibitor Cocktail), Pellets, Pipettieren mehrmals, und drehen für 10 min bei 4 ° C.
    Hinweis: Lysis Puffer 1 sollte gefiltert und bei 4 ° C vor dem Gebrauch gespeichert werden.
  11. Für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen.
  12. Fügen Sie 1 mL Lyse Puffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0), 0,5 mM EGTA, und 0,1 x Proteaseinhibitor cocktail) zum Pellet, Wirbel, und drehen für 10 min bei 4 ° C.
    Hinweis: Lysis Puffer 2 sollte gefiltert und bei 4 ° C vor dem Gebrauch gespeichert werden.
  13. Für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen.
  14. Das Pellet 800 µL des Tests (RIPA) Testpuffer mit 1 X Proteaseinhibitor cocktail hinzufügen und Aufschwemmen der Pellets durch pipettieren.
  15. Für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen.
  16. 500 µL RIPA Puffer mit 1 X Proteaseinhibitor cocktail hinzufügen.
  17. Für 5 min bei 3.000 x g bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand verwerfen.
  18. Fügen Sie 1 mL RIPA Puffer mit 1 X Proteaseinhibitor cocktail. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.

(3) Chromatin Scheren

  1. Auf einem Sonikator Rohr übertragen Sie der lysate und dann legen Sie das Rohr auf einer Ultrasonicator.
  2. Scheren Sie das Chromatin mit den folgenden Einstellungen: Temperatur: 4 ° C; einfallende Spitzenleistung: 175 W; Einschaltdauer: 10 %; Zyklen/Burst: 200; und Zeit: 2.400 s.
  3. Übertragen der Probenmaterials auf eine 1,5 mL-Protein niedrig Bindung Rohr- und Zentrifuge für 5 min bei 20.000 x g bei 4 ° C.
  4. Den Überstand in ein neues Protein niedrig Bindung Rohr zu sammeln.
    Hinweis: Die Probe kann Blitz in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c gelagert

(4) Qualitätsprüfung von DNA (Reverse Vernetzung)

  1. Mix-20 µL der lysate und 180 µL ChIP Elution Buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 300 mM NaCl, 5 mM EDTA (pH 8,0) und 1 % w/V Sodium Dodecyl Sulfat (SDS)) in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Röhre. Inkubation der Probe bei 65 ° C in einem Thermocycler für 6 h mit dem Thermocycler Deckel geöffnet. Halten Sie den Deckel des geöffneter Thermocycler, übermäßige Denaturierung zu vermeiden.
    Hinweis: Sollte der ChIP Elution Buffer gefiltert und vor Gebrauch bei Raumtemperatur gelagert. Diese Inkubation kann erweitert werden, um über Nacht.
  2. Fügen Sie 1 µL von 10 mg/mL RNase A, Wirbel, und bei 37 ° C für 30 min inkubieren.
  3. Fügen Sie 6,5 µL von 15 mg/mL Proteinase K, Wirbel, und bei 55 ° C für 60 min inkubieren.
  4. Übertragen Sie die Reaktion auf eine niedrige DNA-Bindung-Röhre zu, fügen Sie 4 µL von 5 mg/mL Glykogen und Wirbel. Fügen Sie 200 µL Phenol/Chloroform/Isoamyl Alkohol (25:24:1) und Zentrifuge für 5 min bei 18.000 x g bei Raumtemperatur.
  5. Übertragen Sie den Überstand auf eine neue DNA niedrige Bindung Rohr. Fügen Sie 200 µL Tris-EDTA-NaCl-Puffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (pH 8,0) und 200 mM NaCl), die restlichen Phenol/Chloroform/Isoamyl Alkohollösung und Zentrifuge für 5 min bei 18.000 x g bei Raumtemperatur. Den Überstand zu sammeln und mischen mit der ersten überstand.
  6. Fügen Sie 900 µL eiskaltes Ethanol und 1 h bei-20 ° c inkubieren
    Hinweis: Diese Inkubation kann auf 4 - 6 h verlängert werden.
  7. Zentrifuge für 30 min bei 18.000 x g bei 4 ° C.
  8. Verwerfen Sie den überstand. Fügen Sie 1 mL eiskaltem 75 % Ethanol in die Pellet und Zentrifuge für 30 min bei 18.000 x g bei 4 ° c Wiederholen Sie diesen Schritt (zwei Wäschen insgesamt).
  9. Den Überstand gänzlich zu verwerfen und für 1 min bei Raumtemperatur trocknen.
  10. Fügen Sie 50 µL Tris-EDTA (TE)-Puffer und lösen Sie die DNA durch Inkubation es bei Raumtemperatur für 30 min oder bei 4 ° C über Nacht auf. Vermeiden Sie aufschütteln oder pipettieren. Halten Sie diese DNA als "Input" und Vorbereitung der Bibliothek zu verwenden Sie, wenn nötig.
  11. Die DNA-Konzentration zu messen, mit einem Fluorometer nach Anweisungen des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien) und überprüfen Sie die Größenverteilung mit einer mikrofluidischen Elektrophorese-Maschine (siehe repräsentative Daten in Abbildung gezeigt 2a). Verwendung 10 ng oder weniger DNA für diesen Test.
    Hinweis: Fragmente von 100 – 500 Basenpaaren (bp) sollte mindestens 50 % der DNA bilden.

5. Affinitätsreinigung von Anti-FLAG Antikörper

Hinweis: Für Neuron tChIP-Seq, Hirngewebe aus 8 Mäuse sind in der Regel verwendet für eine Probe von tChIP-Seq 2 vorbereiten ng gereinigte DNA durch Tandem immun-Reinigung (siehe Schritt 7.1). In unseren Händen 0,1 ng DNA noch zur Verfügung gestellt qualitativ hochwertige DNA-Bibliotheken für ChIP-Seq (Kadota, unveröffentlicht). So kann theoretisch ein einziger Mausklick durchzuführen Neuron tChIP-FF ausreichen Die erforderliche Menge sollte für die Gewebe- und Art des Interesses optimiert werden. Für die negativ-Kontrolle des Experiments Imumuno-Reinigung sollte Hirngewebe lysate von Mäusen ohne jede H2B-FLAG Ausdruck vorbereitet und verwendet werden.

  1. Die magnetische Beads konjugiert, Schafe Anti-Maus-Immunglobulin G (IgG) in eine geringe Proteinbindung Rohr 200 µL Pipette.
  2. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten Sie 1 min für den Überstand klar zu werden. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS und Wirbel. Wiederholen Sie diesen Schritt (zwei Wäschen insgesamt).
  3. Fügen Sie 20 µL 1 mg/mL Anti-FLAG Antikörper und drehen für 5 h bei 4 ° C.
    Hinweis: Diese Inkubation kann erweitert werden, um über Nacht.
  4. Waschen Sie die Perlen nach Schritt 5.2. Legen Sie die Perlen in eine 15-mL-Tube.
  5. Aufschwemmen Sie die Perlen in 1110 µL RIPA Puffer und fügen Sie dann 900 µL 10 x blocking Reagenz, 180 µL 50 x Denhardt Lösung 10 µL 100 x Proteaseinhibitor cocktail und 6,8 mL lysate in Schritt 3 erstellt. Diese Mischung in 5 Protein niedrig Bindung Rohre aufgeteilt. 6 h bei 4 ° c drehen
    Hinweis: Diese Inkubation kann erweitert werden, um über Nacht.
  6. Legen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und warten Sie 1 min für den Überstand klar zu werden. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL RIPA Puffer und mischen Sie vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Schritt 5 Mal (6 Wäschen insgesamt). Bündeln Sie alle Perlen in ein einziges Protein niedrig Bindung Rohr.
  7. Fügen Sie 200 µL ChIP Elution Buffer und drehen für 15 min bei Raumtemperatur. Überprüfen Sie die Qualität der DNA, wie in Schritt 4.11 beschrieben (siehe repräsentative Daten, dargestellt in Abbildung 2 b und C). Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.

6. Affinitätsreinigung von Anti-H3K4me3-Antikörper und umgekehrte Vernetzung

Hinweis: Die folgenden Wulst Vorbereitung, die Schritte (6.1-6.4) vor Schritt 5.7 durchgeführt werden sollte.

  1. Magnetische Beads konjugiert, Schafe Anti-Maus IgG in einer 2 mL-geringe Proteinbindung Rohr 40 µL Pipette.
  2. Legen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und warten Sie 1 min für den Überstand klar zu werden. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL eiskaltem PBS und mischen Sie vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Schritt (zwei Wäschen insgesamt).
  3. Fügen Sie 4 µL 1 mg/mL Anti-H3K4me3 Antikörper und drehen für 6 h bei 4 ° C.
  4. Waschen Sie die Perlen nach Schritt 6.2. Legen Sie die Perlen in einer 2 mL-geringe Proteinbindung Röhre.
  5. Aufschwemmen Sie die Perlen in 1558 µL RIPA Puffer und fügen Sie dann 200 µL 10 x blocking Reagenz, 40 µL 50 x Denhardt Lösung 2 µL 100 x Proteaseinhibitor cocktail und 200 µL das Eluat in Schritt 5.7 vorbereitet. Drehen Sie über Nacht bei 4 ° C.
    Hinweis: Die SDS im ChIP Elution Puffer wurde mehr als 10 Mal in diese Inkubation verdünnt.
  6. Legen Sie das Rohr auf die Magnetstativ und warten Sie 1 min für den Überstand klar zu werden. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 1 mL RIPA Puffer und mischen Sie vorsichtig. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 Mal (5 Wäschen insgesamt). Übertragen Sie nach der letzten Wäsche die Perlen in einer DNA niedrige Bindung Röhre, und verwerfen Sie den überstand.
  7. Fügen Sie 200 µL ChIP Elution Buffer und drehen für 15 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie das Eluat auf eine neue DNA niedrige BindingTube.
    Hinweis: Das Eluat kann bei-80 ° c aufbewahrt werden
  8. Folgen Sie Schritt 4 für Decrosslinking der DNA. Die gereinigte DNA in 20 µL TE-Puffer aufzuwirbeln.
  9. Überprüfen Sie die Qualität der DNA, wie in Schritt 4.11 beschrieben (siehe repräsentative Daten gezeigt in Abb. 2D). (optional) Anreicherung Analyse mittels quantitativer PCR durchführen wie zuvor beschrieben2. Um das Zehnfache oder mehr Bereicherung beachtet werden.

(7) Bibliotheksbau

  1. Berechnen Sie für jeden Eingang und ChIP DNA-Probe des Anteils der DNA im Bereich von 100 – 500-bp mit Abstrich-Analyse-Funktion der Software für die Mikrofluidik Elektrophorese Maschine. Schätzen das Probenvolumen erforderlich 2 ng von 100 – 500 bp DNA. Verwenden Sie 20 ng DNA im Bereich von 100 – 500-bp als "input" Probe.
  2. Pipette DNA-Proben in 8 Streifen PCR Tubes und H2O, das Gesamtvolumen auf 10 µL. (optional) zu bringen, übersteigt die Menge an DNA 10 µL, proportional skalieren die folgende Reparatur-Ende-Reaktion und die Größenauswahl.
  3. Ende-Reparatur-master-Mix vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien). Die DNA 4 µL Ende-Reparatur-master-Mix hinzu und inkubieren Sie für 30 min bei 20 ° C.
  4. Fügen Sie 36 µL 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 und 0,6 X Volumen (30 µL) der festen phase reversible Immobilisierung (SPRI) magnetische Beads und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten Sie, bis der Überstand klar wird.
  6. Übertragen Sie den Überstand auf einen neuen Schlauch, fügen Sie 1,2 X Mengen (60 µL) des SPRI magnetische Beads und inkubieren Sie 5 min bei Raumtemperatur.
  7. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten Sie, bis der Überstand klar wird.
  8. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 200 µL von 80 % EtOH, hält das Rohr noch auf den Magneten.
  9. Zentrifugieren Sie kurz den Schlauch zu sammeln den Rest EtOH unten und legen Sie es zurück auf den Magneten. Entfernen Sie der Rest EtOH gründlich.
  10. Lassen Sie den Schlauch Deckel offen für 1-2 min erlauben die EtOH zu verdampfen.
  11. Schließen Sie den Deckel und halten Sie das Rohr auf dem Eis.
    Hinweis: Jetzt haben Sie Bildgröße DNA von 100 – 500 bp an den Perlen erhalten. Weitere Details zu doppelter Größenauswahl finden Sie auf der Website des Herstellers (www.beckman.com).
  12. Vorbereitung A-Tailing Meister mischen (siehe Tabelle der Materialien).
  13. Aufschwemmen der Perlen (aus Schritt 7.10) mit 10 µL des A-Tailing-master-Mix und inkubieren Sie für 30 min bei 30 ° C.
  14. Volumen 1,8 X (18 µL) von Polyethylenglykol (PEG) / NaCl-Lösung und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  15. Führen Sie die Schritte 7,7-7.11 um die DNA zu reinigen.
  16. Ligatur Puffer Mischung vorbereiten (siehe Tabelle der Materialien).
  17. Pipette 8 µL Ligatur-Puffer-Mix auf die Perlen (aus Schritt 7,14), 1 µL 1 µM-Adapter hinzufügen und erneut die Perlen. Verwenden Sie 1 µL 5 µM-Adapter für das Eingabesample. Verwenden Sie verschiedene Adapter für jede Probe für multiplexing.
  18. 1 µL DNA Ligase hinzufügen und 15 min. bei 20 ° c inkubieren
  19. 1,0 X Volumen (10 µL) von PEG/NaCl-Lösung hinzufügen, die Perlen Aufschwemmen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  20. Führen Sie die Schritte 7,7-7.10 um die DNA zu reinigen.
  21. Pipette 25 µL 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in das Rohr und die Perlen aufzuwirbeln.
  22. 1,0 X Volumen (25 µL) von PEG/NaCl-Lösung hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  23. Führen Sie die Schritte 7,7-7.10 um die DNA zu reinigen.
  24. Pipette 11 µL 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in das Rohr und die Perlen aufzuwirbeln.
  25. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten Sie, bis der Überstand klar wird.
  26. Sammeln des Überstands in ein neues 8-Streifen PCR-Röhrchen.
  27. Bereiten Sie Echtzeit-PCR-master-Mix (siehe Materialien für Details).
  28. Pipette 8,5 µL des Real-Time PCR-master-Mix in einem 384-Well quantitative PCR (qPCR) Teller und fügen Sie 1,5 µL des Adapters DNA (aus Schritt 7,26) ligiert.
  29. Pipette 10 µL jeder fluoreszierende Norm in leeren Brunnen.
  30. Real-Time PCR mit dem folgenden Programm ausführen: (98 ° C für 45 s) x 1 Zyklus (98 ° C für 15 s, 60 ° C für 30 s, 72 ° C für 30 s) x 20 Zyklen und (72 ° C für 60 s) x 1 Zyklus.
  31. Bestimmen Sie die Anzahl der PCR-Zyklen benötigt, um die Fluoreszenzintensität der Fluoreszenz Standard 2 zu erreichen.
  32. Vorbereiten den PCR Master mix (siehe Tabelle der Materialien).
  33. Pipette 11,5 µL des PCR-master-Mix in die verbleibenden Adapter ligiert DNA (aus Schritt 7,26) und PCR durchzuführen, wie in Schritt 7.30 Uhr mit der PCR-Zyklen im Schritt 7.31 bestimmt.
  34. 1,0 X Volumen (20 µL) von PEG/NaCl-Lösung hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  35. Führen Sie die Schritte 7,7-7.10 um die DNA zu reinigen.
  36. Pipette 20 µL 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 in das Rohr und die Perlen aufzuwirbeln.
  37. Legen Sie das Rohr auf einem Magnetstativ und warten Sie, bis der Überstand klar wird.
  38. Sammeln Sie den Überstand in einen neuen Schlauch 1,5 mL-DNA niedrige Bindung.
  39. Überprüfen Sie die Qualität der Bibliothek, wie in Schritt 4.11 beschrieben (siehe repräsentative Daten, dargestellt in Abbildung 2E und F). Verwenden Sie 1 µL der Bibliothek DNA Probe. (optional) Durchführen Sie Anreicherung Analyse durch qPCR wie zuvor beschrieben 2. Um das Zehnfache oder mehr Bereicherung beachtet werden.

(8) Sequenzierung

  1. Reihenfolge der Bibliotheken in einer nächsten Generation Sequenzer (siehe repräsentative Daten, siehe Abbildung 3).
    Hinweis: Die Reihenfolge Tiefe ausreichend für die Datenanalyse variieren je nach der Genomgröße des Organismus3. Für Mensch und Maus, wir empfehlen eine mindestens 20 Millionen Einend-mal gelesen. Nach der Ausbeute an liest könnte Multiplexen kostengünstig sein.

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Ergebnisse

Hier beschreiben wir Gewebe Dissektion, Fixierung, Zelle Lysis Tandem Reinigung von Chromatin und DNA-Bibliothek Vorbereitung für nächste Generation Sequenzer. Im Verlauf der Verfahren kann man die Qualität der DNA, testen, das ist der Schlüssel für erfolgreiche Sequenzierung in mehreren Schritten (Abbildung 2). Da ein einzelnes Nukleosom in der Regel 147 bp DNA 4 umgeben istsollte geschert DNA nicht kürzer als dieser Größe sein. Sofor...

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Diskussion

Unser Protokoll wurde für die Nervenzellen des Mausgehirns optimiert, der Ausdruck der Flagge markiert H2B durch Tamoxifen Injektion induziert wird. Promotoren verwendet für H2B Ausdruck, Ausgangsstoffe Gewebe und die Menge des Gewebes sind entscheidende Parameter für erfolgreiche tChIP-seq. Die Optimierung dieser Faktoren sollte somit für jeden Zelltyp des Interesses betrachtet werden.

Ein entscheidender Schritt zu den Verfahren, die in diesem Protokoll verwendeten ist die DNA Scheren um eine...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir danken allen Mitgliedern des Iwasaki Labor für kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (#26113005, S.N. und JP17H05679, s.i.); eine Beihilfe für den wissenschaftlichen Nachwuchs (A) (JP17H04998, s.i.) vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft, Sport und Kultur Japans (MEXT); und die Pioneering Projekte "Zelluläre Evolution" und alle RIKEN Projekt "Krankheit und Epigenom" von RIKEN (zu S.N. s.i.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Protein LoBind Röhrchen, 2 mLEppendorfNr.  0030108132Für die Zelllyse
Protein LoBind Röhrchen, 1,5 mLEppendorfNr.  0030108116Für ChIP und Bibliotheksvorbereitung
DNA-LoBind-Röhrchen, 1,5 mLEppendorfNr.  0030108051Für ChIP und Bibliotheksvorbereitung
8-Streifen-PCR-RöhrchenBIO-BIK3247-00Für ChIP und Bibliotheksvorbereitung
SK MillTOKKENSK-200Handliche Kryomühle zur Herstellung von Zellpulver für die Fixierung
MetallkugelTOKKENSK-100-DLC10Zubehör von SK Mill
2 mL EdelstahlröhrchenTOKKENTK-AM5-SUSEine Option für Zelle Lyse
2 mL Edelstahl-RöhrchenhalterTOKKENSK-100-TLEine Option für die Zelllyse
16% Formaldehyd (w/v), methanolfreiPierce28906Zur Fixierung von Zellen. Bereiten Sie vor Gebrauch eine 1%ige Lösung vor.
GlycinNacalai Tesque17109-35Vorbereiten 2,5 M Vorrat
D-PBS (-)(1x)Nacalai Tesque14249-24Zum Waschen von Lysat und gereinigter DNA
HEPESNacalai Tesque02443-05Zum Lysepuffer 1. Bereiten Sie 1 M, pH 7,5 Brühe vor.
5 M NaCl, molekularbiologische QualitätNacalai Tesque06900-14für Lysepuffer 1, Lysepuffer 2, ChIP-Elutionspuffer und Tris-EDTA-NaCl-Puffer
0,5 M EDTA, molekularbiologische QualitätWako Pure Chemical Industries, Ltd.311-90075Für Lysepuffer 1, Lysepuffer 2, ChIP-Elutionspuffer und Tris-EDTA-NaCl-Puffer
GlycerolWako Pure Chemical Industries, Ltd.072-04945Für Lysepuffer 1
NP-40Nacalai Tesque25223-75Für Lysepuffer 1
Triton X-100, MolekularbiologieNacalai Tesque12967-32Für Lysepuffer 1
TrisNacalai Tesque35406-91Für Lysepuffer 2, ChIP-Elutionspuffer und Tris-EDTA-NaCl-Puffer. Bereiten Sie 1 M, pH 8,0 Brühe vor.
0,1 M EGTA pH-neutralNacalai Tesque08947-35Für Lysepuffer 2
Proteaseinhibitor-Cocktail (100x)Nacalai Tesque25955-24Zur Blockierung des Proteinabbaus
RIPA-PufferThermo Fisher Scientific89900Für die Zelllyse und das Waschen
milliTUBE 1 mL AFA-FaserCovaris520130Sonicator-Röhrchen. Zubehör des fokussierten Ultraschallgeräts
Fokussierter UltraschallgerätCovarisS220 oder E220Zum Verdau von DNA in eine angemessene Größe für ChIP-Seq
UltraPure 10% SDSThermo Fisher Scientific15553-027Für ChIP-Elutionspuffer
RNase ANacalai Tesque30141-14Zur Aufreinigung von DNA aus Lysat
Proteinase K, rekombinant,PCR-Qualität Sigma-Aldrich3115887001Zur Reinigung von DNA aus
Lysat-EthanolWako Pure Chemical Industries, Ltd.054-07225Herstellung eines 70%igen
Lösung Monoklonaler Anti-FLAG M2-Antikörper, der in der Maus hergestelltwurde Sigma-AldrichF1804Zur Reinigung von Chromatin, das in interessierenden Zellen exprimiert wird
Dynabead M-280 Schaf Anti-Maus IgGThermo Fisher Scientific11201DDies kann für Anti-FLAG IP und Anti-H3K4me3 IP
Anti-Trimethyl-Histon H3 (K4), monoklonaler Maus-AntikörperWako Pure Chemical Industries, Ltd.301-34811Jeder andere Antikörper, der für die ChIP-Analyse geeignet ist, funktioniert
10x BlockierungsreagenzSigma-Aldrich11096176001Zur Blockierung während der Affinitätsreinigung
Denhardt' LösungNacalai Tesque10727-74Zur Blockierung während der Affinitätsreinigung
Glykogen (5 mg/ml)Thermo Fisher ScientificAM9510Zur Aufreinigung von DNA aus Lysat
Qubit 2.0 FluorometerThermo Fisher ScientificQ32866Zur Quantifizierung isolierter DNA
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32851Zur Quantifizierung von isolierter DNA
0,5 mL RöhrchenAxygen10011-830Zur Quantifizierung mittels Qubit
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1)Nacalai Tesque25970-56Zur Aufreinigung von DNA aus Lysat
AMPure XP KügelchenBeckman CoulterA63881SPRI Magnetische Kügelchen für die Bibliotheksvorbereitung
MetalleisregalFunakoshiIR-1Zum Einfrieren
des ZelllysatsProbenkühlerNew England BiolabsT7771SHilft bei der Fixierung von Zellen mit minimalem Schaden
2100 BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939BAZur Überprüfung der Qualität isolierter DNA-Fragmente. Ein anderer Fragmentanalysator kann verwendet werden.
Bioanalyzer 2100 Expert SoftwareAgilent TechnologiesG2946CAim Lieferumfang enthalten ist das Bioanalyzer
High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626Zur Überprüfung der Qualität der isolierten DNA-Fragmente
KAPA LTP Library Preparation KitRoche07961898001Geliefert mit 10x KAPA End Repair Buffer, KAPA End Repair Enzyme Mix, KAPA A-Tailing Buffer, KAPA A-Tailing Enzyme, KAPA Ligation Buffer, KAPA DNA Ligase und PEG/NaCl Lösung
NEXTflex DNA BarcodesBIOO ScientificNOVA-514101Adapter für die Bibliotheksvorbereitung. Lieferung mit DNA-Barcode-Adaptern und Primer-Mix.
KAPA Real-Time Library Amplification KitRoche07959028001Lieferung mit 2x KAPA HiFi HS Real-Time PCR Master Mix, PCR Primer Mix und Fluoreszenzstandards
2x KAPA HiFi HotStart ReadyMixRocheKM2602Für die Bibliotheksvorbereitung. Darüber hinaus kann dieses Enzym für das KAPA Real-Time Library Amplification Kit
Buffer EBQiagen1908610 mM Tris-Cl, pH 8,5 für die Elution von DNA
386-Well-qPCR-Plattebenötigt werden Thermo Fisher Scientific4309849Für die Echtzeit-PCR
QuantStudio 7 Flex Real-Time PCR SystemThermo FisherScientific 4485701Zur Quantifizierung von DNA
MicroAmp Optischer KlebefilmThermo FisherScientific 4311971Für Echtzeit-PCR
MicroAmp Durchsichtige KlebefolieThermo Fisher Scientific4306311Für die Plattenversiegelung
Endreparatur-MastermixKombinieren Sie 1,4 & Mikro; L von 10x KAPA End Repair Buffer, 1 & Mikro; L des KAPA End Repair Enzyme Mix und 1,6 µ L H2O
A-taling MastermixCombine 1 & micro; L KAPA A-Tailing-Puffer, 0,6 &μ; L des KAPA A-Tailing Enzyms und 8,4 µ L H2O
LigationspuffermischungKombinieren Sie 2 & micro; L von KAPA-Ligationspuffer und 6 µ L H2O
Real-time PCR MastermixKombinieren Sie 5 & Mikro; L von 2x KAPA HiFi HS real-time PCR Master Mix, 0,35 & Mikro; L PCR Primer Mix (10 & Mikro; M jeweils von Forward Primer AATGATACGGCGACCGAG und Reverse Primer CAAGCAGAAGACGGCATACGAG) und 3.15 µ L H2O
PCRMastermixKombinieren Sie 10 & Mikro; L von 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0,9 & Mikro; L PCR-Primer-Mix und 0,6 & Mikro; L von H2O
Integrative Genomics ViewerBroad InstituteIGV_2.3.88Genombrowser zur Visualisierung von Sequenzierungsdaten
DNA Olgionukleotid: 5′-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3′Eurofins GenomicsEin Primer zur Amplifikation der Promotorregion von GAPDH-DNA
Olgionukleotid: 5′-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3′Eurofins GenomicsEin Primer zur Amplifikation der Promotorregion von GAPDH
SYBR Premix Ex TaqTakaraRR420LZur Quantifizierung der DNA, die der GADPH-Promotorregion entspricht
Thermocycler DiceTakaraTP870Zur Quantifizierung der DNA, die der GADPH-Promotorregion entspricht
verwendet werden.

Referenzen

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  4. Becker, P. B., Workman, J. L. Nucleosome remodeling and epigenetics. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).
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  10. Zhao, Y., Garcia, B. A. Comprehensive catalog of currently documented histone modifications. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).
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