Wir beschreiben ein Protokoll für die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen mit quantitativen Phase Bildgebung und ein maschinelles lernen-Algorithmus. Messungen der 3D Brechungsindex Schichtbilder von Lymphozyten präsentieren 3D morphologische und biochemische Informationen für einzelne Zellen, die dann mit einem Computerlernen Algorithmus zur Identifizierung von Zelltypen analysiert wird.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Markierungsfreie Identifikation von Lymphozyten-Subtypen mit dreidimensionale Quantitative Phase Bildgebung und maschinelles lernen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir beschreiben hier ein Protokoll für die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen mit quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles lernen. Identifizierung von Lymphozyten-Subtypen ist wichtig für das Studium der Immunologie sowie Diagnostik und Behandlung von verschiedenen Krankheiten. Standard-Methoden zur Klassifizierung von Lymphozyten Arten setzen derzeit, auf Kennzeichnung bestimmte Membranproteine über Antigen-Antikörper-Reaktionen. Diese Kennzeichnung Techniken tragen jedoch die möglichen Risiken der Zellfunktionen zu verändern. Das hier beschriebene Protokoll überwindet diese Herausforderungen durch die Ausnutzung der intrinsischen optische Kontraste durch 3D quantitativen Phase Bildgebung und eine Maschine Lernalgorithmus gemessen. Messung der 3D Brechungsindex (RI) Schichtbilder von Lymphozyten liefert quantitative Informationen über 3D Morphologie und Phänotypen der einzelnen Zellen. Die biophysikalischen Parameter aus der gemessenen 3D RI Schichtbilder extrahiert werden dann mit einem Algorithmus für maschinelles lernen, die markierungsfreie Identifizierung der Lymphozyten-Typen auf eine einzelne Zelle Ebene ermöglichen quantitativ analysiert. Wir messen die 3D RI Schichtbilder von B, T CD4 + und CD8 + T-Lymphozyten und identifiziert ihre Zelltypen mit über 80 % Genauigkeit. In diesem Protokoll beschreiben wir die einzelnen Schritte zum Lymphozyten isoliert, 3D quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles Lernen zur Ermittlung Lymphozyten Typen.
Einleitung
Lymphozyten lassen sich einteilen in verschiedene Subtypen einschließlich B, Helfer (CD4 +) T, zytotoxische (CD8 +) T und regulatorischen T Zellen. Jeder Lymphozyten-Typ hat eine andere Rolle in der adaptiven Immunsystems; zum Beispiel produzieren B-Lymphozyten Antikörper, wobei T-Lymphozyten spezifische Antigene erkennen, Beseitigung von abnormen Zellen und B-Lymphozyten zu regulieren. Lymphozyten Funktion und Regulation ist fest geregelt und im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs1, Autoimmunerkrankungen2und Virusinfektionen3. So ist die Identifizierung von Lymphozyten....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Tierbetreuung und experimentelle Verfahren wurden unter Zustimmung des institutionellen Tier Pflege und Nutzung Ausschuss KAIST (KA2010-21, KA2014-01 und KA2015-03) durchgeführt. Alle Versuche in dieser Studie wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt.
(1) Lymphozyten Isolation aus Maus Blut
- Sobald eine Maus C57BL/6J durch CO2 Einatmen eingeschläfert, 26 G Nadel ins Herz Maus und 0,3 mL Blut zu sammeln. Direkt ins Blut ein Rohr mit 100 U/mL Heparin-Lösung mit 1 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) verdünnt.
Hinweis: Alternativ können Lymphozyten aus der Milz isoliert werden. - Zentrifug....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt schematisch das gesamte Protokoll. Bei der hier vorgestellten Verfahren wir isolierte B (n = 149), CD4 + T (n = 95), und CD8 + T (n = 112) Lymphozyten. Um Phase und Amplitude Informationen in verschiedenen Winkeln der Beleuchtung zu erhalten, wurden mehrere 2D Hologramme von einzelnen Lymphozyten gemessen durch Veränderung des Winkels der Beleuchtung (von-60 ° bis 60 ° c). In der Regel 50 Hologramme können verwendet werden, um eine 3D RI.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Wir präsentieren Ihnen eine Protokoll, die die markierungsfreie Identifizierung von Lymphozyten-Typen, die Nutzung von 3D quantitativen Phase Bildverarbeitung und maschinelles Lernen ermöglicht. Wichtige Schritte dieses Protokolls sind quantitative Phase Bildgebung und Feature-Auswahl. Für die optimale holographische Bildgebung sollte die Dichte der Zellen kontrolliert werden, wie oben beschrieben. Mechanische Stabilität der Zellen ist auch wichtig, eine genaue 3D RI-Verteilung zu erhalten, weil frei verschiebbar oder Sc.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Prof. Y. Park, Y.-Jo, Y. S. Kim und S. Lee haben finanzielle Interessen in Tomocube, Inc., ein Unternehmen, das vertreibt optische Beugung Tomographie und quantitativen Phase imaging Instrumente und ist einer der Sponsoren des Werkes.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der KAIST BK21 + Programm, Tomocube, Inc., und der National Research Foundation of Korea (2015R1A3A2066550, 2017M3C1A3013923, 2018 K 000396) unterstützt. Y. Jo erkennt Unterstützung seitens der KAIST Presidential Fellowship und Asan Stiftung biomedizinische Wissenschaft Stipendium.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Maus | Daehan Biolink | C57BL/6J Mäuse | Geschlecht und Alter, 6 & 8 Wochen |
| Falcon konisches Zentrifugenröhrchen | ThermoFisher Scientific | 14-959-53A | 15 mL |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung | Sigma-Aldrich | 806544-500ML | |
| Ammoniumchlorid-Kalium-Lysing-Puffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Fötales Rinderserum | ThermoFisher Scientific | 10438018 | |
| Antikörper | BD Biosciences | 553140 (RRID:AB_394655) | CD16/32 (Klon 2.4G2) |
| Antikörper | BD Biosciences | 555275 (RRID:AB_395699) | CD3ε (Klon 17A2) |
| Antikörper | Biolegnd | 100734 (RRID:AB_2075238) | CD8α (Klon 53-6.7) |
| Antikörper | BD Biosciences | 557655 (RRID:AB_396770) | CD19 (Klon 1D3) |
| Antikörper | BD Biosciences | 557683 (RRID:AB_396793) | CD45R/B220 (Klon RA3-6B2) |
| Antikörper | BD Biosciences | 552878 (RRID:AB_394507) | NK1.1 (Klon PK136) |
| Antikörper | eBioscience | 11-0041-85 (RRID:AB_464893) | CD4 (Klon GK1.5) |
| DAPI | Roche | 10236276001 | 4,6-Diamidino-2-phenylindol |
| Durchflusszytometrie | BD Biosciences | Aria II oder III | |
| Bildgebungskammer | Tomocube, Inc. | TomoDish | |
| Holotomographie | Tomocube, Inc. | HT-1H | |
| Holotomographie-Bildgebungssoftware | Tomocube, Inc. | TomoStudio | |
| Image-Software | MathWorks | Matlab R2017b |
Referenzen
- Alizadeh, A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 403 (6769), 503(2000).
- Von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology<....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
