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Methodenartikel

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

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DOI:

10.3791/58307

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3. Oktober 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Wesleyan University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für anaerobe Proteinreinigung, anaerobe Proteinkonzentration und anschließende kinetischen Charakterisierung mittels einer Sauerstoff-Elektrode-System. Die Methode wird anhand des Enzyms DesB, ein Dioxygenase Enzym, das ist stabiler und aktiv, wenn gereinigt und in einer anaeroben Umgebung gespeichert.

Zusammenfassung

Sauerstoffempfindlichen Proteine, einschließlich jene Enzyme, die Sauerstoff als Substrat, nutzen können Stabilität wenn gereinigt mit traditionellen aerobic Reinigungsverfahren reduziert haben. Diese Handschrift zeigt die technischen Details der anaeroben Reinigungsprozess, einschließlich der Vorbereitung der Puffer und Reagenzien, die Methoden für die Säulenchromatographie in einem Handschuhfach und die Entsalzung des Proteins vor Kinetik beteiligt. Ebenfalls beschrieben sind die Methoden für die Erstellung und Verwendung einer Sauerstoffelektrode zur kinetischen Charakterisierung eines Enzyms, Verwendung von Sauerstoff. Diese Methoden werden anhand der Dioxygenase Enzym DesB, ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6.

Einleitung

Enzyme, die Eisen oder anderen Metallen Sauerstoff aktivieren nutzen sind oft anfällig für Inaktivierung während des Reinigungsprozesses aufgrund ihrer Entfernung von den reduzierenden Umgebung einer Zelle. Daher diese Proteine als Zelle Lysates verwendet werden müssen, externe Reduktionsmittel ausgesetzt werden oder anaerob gereinigt werden, um sicherzustellen, dass sie optimale enzymatische Aktivität1,2,3,4. Für diese Enzyme, die sind ist sauerstoffempfindlichen (speziell Eisen-haltige Enzyme), all den Schritten Aufreinigung und Charakterisierung unter Beibehaltung der anaerobe Bedingungen notwendig, sie vollständig zu charakterisieren. Dies hat dazu geführt, Forscher, gesamte Labor Aufbauten innerhalb der Grenzen des anaeroben Kammern für Studien von Protein-Expression durch Kristallographie5,6,7,8 bis hin zu entwickeln .

Hier berichten wir über Methoden zur anaeroben Reinigung und kinetischen Charakterisierung des Enzyms DesB mit einem Sauerstoff-Elektrode-System. DesB ist ein Gallat Dioxygenase aus dem Bakterium Sphingobium SP. Stamm SYK-6, die mit LigAB, eine Protocatecuate-Dioxygenase aus dem gleichen Organismus zusammenhängt. Beide Enzyme gehören zu den Typ II Protocatechuate Dioxygenase (PCAD)-Superfamilie, die bis Datum9, wahrscheinlich teilweise durch Enzyme dieser Superfamilie wird anfällig für Inaktivierung wenn gereinigt, mit Standard-aerobic nicht umfassend untersucht worden Protein-Reinigungsverfahren. Da einige der PCAD Enzyme Substrat Promiskuität angezeigt, während andere Substrat-spezifische2,10, muss weitere Charakterisierung dieser Superfamilie Spezifität Determinanten identifizieren. Wie in mehreren Enzym Superfamilies11,12,13,14,15festgestellt wurde, können kleine Moleküle Aktivität über direkte wettbewerbsfähig Hemmung oder die Bindung von ändern Moleküle zu trennen allosterische Taschen, wodurch eine Zunahme oder Abnahme der Enzymaktivität16. Während Kinetik allein die bindende Lage ein Modulator unterscheiden kann, ist das Bestimmen der Größe der Änderung einer Aktivität wichtig für das Verständnis der Auswirkungen. Als solcher, Methoden zur kinetischen Charakterisierung von native DesB Tätigkeit und seine Tätigkeit in Gegenwart von 4-Nitrocatechol (4NC), eine Substanz, die häufig verwendet, um zu charakterisieren und hemmen Dioxygenase Enzyme2,17, 18, werden angezeigt.

DesB ist in der Lage zu brechen in welcher Ring Eröffnung katalysiert wird mit Sauerstoff als einem der Substrate10,19Gallat, eine Lignin-abgeleitete aromatische Verbindung, über eine Extradiol-Dioxygenase (EDO)-Reaktion. Diese enzymatische Reaktion tritt im Rahmen der den Abbau von Lignin, einem aromatischen Heteropolymer gefunden in der Zellwand von Pflanzen. Lignin depolymerisiert werden kann, einer Vielzahl von aromatischen Verbindungen, die nachgeben kann weiter unterteilt werden in zentralen Metaboliten3,20,21,22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Extradiol Dioxygenases (EDO) katalysieren einen Ring Eröffnung Reaktion auf Dihydroxylated aromatischen Verbindungen, wo Spaltung angrenzend an ein Metall koordiniert Diol auftritt; im Gegensatz dazu Spalten Intradiol Dioxygenases analoge aromatische Verbindungen zwischen den beiden Hydroxylgruppen (Abbildung 1). EDOs, wie viele andere mechanistische haben eine zweiwertige Metallzentrum für koordinierende Fe(II), bestehend aus einem zwei-Histidin, eins-carboxylat Triade9,34,35. Diese mechanistische werden entweder durch Autoxidation oder Mechanismen basierenden Inaktivierung, oxidiert, während das Enzym inaktiv2,36,37,38gerendert wird.

In der experimentellen Verfahren, die in dieser Handschrift beschrieben nutzen wir DesB, ein Mitglied der PCAD-Superfamilie aus dem Bakterium Sphingobium SP. SYK-6, um die Zufuhr von Sauerstoff über die C4-C5-Anleihe der Gallat (Abbildung 2A) katalysieren. Die Regiochemistry der dieser Spaltung ist analog zum LigAB, ein Protocatechuate-4,5-Dioxygenase (Abb. 2 b). Bisher gehören Untersuchungen zu diesem Gallat Dioxygenase keine Berichte von Verbindungen, die DesB10,19,39hemmen. Mit dem Einsatz von aeroben Reinigungsverfahren ausgestellt DesB schwankende Aktivität, während wir mit dem Einsatz von anaeroben Methoden konsequent Protein mit reproduzierbaren Aktivität erhalten konnten. Die kinetischen Untersuchungen beschrieben hier zeigen die Methoden für die anaerobe Reinigung von DesB, kinetischen Charakterisierung von der Reaktion des DesB mit Gallat und die Hemmung der DesB von 4-Nitrocatechol (4NC).

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Protokoll

1. Allgemeine Materialien und Methoden

  1. Bereiten Sie die erforderlichen Medien, wie in Tabelle 1beschrieben. Autoklaven bei 120 ° c für 15 min. Steril filtern die SOC-Lösung nach Zugabe von MgCl2 und Glukose, indem man es durch einen 0,2 µm-Filter. Stellen Sie den pH-Wert des Müllers Lysogeny Brühe (LB Medien) Lösung vor dem Autoklavieren. Ergänzen Sie die LB-Amp-Media-Lösung nach dem Autoklavieren mit sterilen Lösungen von 0,2 mM L-Cystein, dann 0,1 mM Eisen Ammoniumsulfat, Proteinexpression und Löslichkeit zu verbessern.
  2. Bereiten Sie die Laemmli-Puffer und laufenden Puffer für Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE), wie in Tabelle 2beschrieben. Einstellen Sie den pH-Wert der Lösungen (mit 1 M HCl und Tris-Basis Vorbereitung Puffer) vor der Verdünnung zu ihrer letzten Bände Komponenten.
  3. Bereiten Sie die Puffer für Proteinreinigung, wie in Tabelle 3beschrieben. Einstellen Sie den pH-Wert der Lösungen (mit 1 M HCl und Tris-Basis Vorbereitung Puffer) vor der Verdünnung zu ihrer letzten Bände Komponenten.
  4. Übertragen Sie die vorbereiteten Puffer auf eine Flasche, die mit einem ein-Loch-Gummistopfen verschlossen werden und enthält ein Glasrohr.
    1. Verwenden Sie einen Schlauch um das Glasrohr in der Stopper zu einer Vakuumquelle verbinden. Lassen Sie die Lösung unter Unterdruck ca. 30 Minuten unter ständigem Rühren bei mittlerer Geschwindigkeit zu entgasen.
    2. Brechen Sie das Vakuum, das Siegel des Vakuums zuerst, dann deaktivieren. Als nächstes stechen Sie durch den Gummistopfen mit zwei 20G Nadeln (eine, die ist lang genug, um den Boden der Flasche und einer kürzeren Nadel, die als eine Entgasungsöffnung entweichen verwendet werden kann erreichen). Blase in einen stetigen Strom von Stickstoff unter Rühren bei mittlerer Geschwindigkeit für 30 Minuten.
    3. Entfernen Sie die Nadeln zu, und wiederholen Sie die Entgasung und sprudelnden in Stickstoff für insgesamt drei Zyklen. Wenn Sie fertig sind, richtig Dichtung die Flasche mit einem Vollgummi-stopfen. Weiter sichern Sie den Stopper mit Paraffin Film- und Kupferdraht (20G), und legen Sie sie in das Handschuhfach.
      Hinweis: Alle Materialien sind in das Handschuhfach gelegt und 3 Zyklen der Vorkammer, gefolgt von Staubsaugen, Sauerstoff und Stickstoff Nachfüllen Reinigung unterzogen. Puffer zur Reinigung und Konzentration werden begrenzt und im Handschuhfach auf unbestimmte Zeit gespeichert.
  5. Bereiten Sie die Natrium Dithionate Lösung durch Auflösen von etwa einem Spatel (0,31 "x 2", das kleinere Ende einer doppelseitigen Mikro-konisch Edelstahl-Spachtel) voll von Natrium Dithionate in etwa 1 mL entgastem Wasser in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch . Versiegeln Sie das Rohr mit Paraffin-Film vor der Entnahme aus dem Handschuhfach.
    Hinweis: Bewahren Sie solide Natrium Dithionate im Handschuhfach um Oxidation zu verhindern.

2. Vorbereitung der Amylose Spalte Proteinreinigung

  1. Machen Sie eine Aufschlämmung aus high-Flow Amylose Harz (15 mL) in Kombination mit 5 Bänden in Spalte (75 mL) von Amylose Spalte Puffer. Die Harz-Slurry in zwei 50 mL Serum Flaschen zu übertragen und jede Flasche mit einem gummiseptum verschließen. Punktion einer 20G, 305 mm Nadel durch die Septen und Blase Stickstoff in der Gülle für ca. 1 Minute, Sauerstoff aus der Suspension zu entfernen. Übertragen Sie der Harz und Protein-haltigen Lösung in der Glove-Box.
  2. Gießen Sie im Handschuhfach das Harz in einer 2 x 30 cm Borosilikat-Spalte mit einer einfachen Absperrhahn, ermöglicht das Harz zu begleichen, und erstellen Sie eine Ebene Bett ausgestattet. Ablassen der Spalte Puffer und equilibrate die Spalte mit 3 Spalte Bände (~ 30 mL gesamt) entgast Amylose Spalte Puffer mit unter Druck stehendem Stickstoffgas, schieben Sie den Puffer durch das Harz bei ca. 1 Tropfen/s oder 5 mL/min, bis das Lösungsmittel oberhalb der Harzbett.
    Hinweis: Nachdem das Protein eluiert (siehe Punkt 3.5 unten), die Amylose Spalte Harz wird durch Waschen mit 1 Spalte Volumen (10 mL) Wasser, dann 1 Spalte Volumen von 1 % Natrium-Dodecyl-Sulfat (SDS) und zu guter Letzt 3 Spalte Wassermengen (30 mL) regeneriert. Dieser Schritt kann außerhalb der Glove-Box ausgeführt werden. Die Spalte Harz ist bei 4 ° C in 20 % Ethanol gespeichert und kann bis zu 5 Mal regeneriert werden.

(3) Proteinexpression und anaeroben Reinigung von DesB

Hinweis: Das DesB-Gen wurde kommerziell synthetisiert in Haustier-15 b, Haustier-32a und pMAL c5x Vektoren mit den NdeI und BamHI Einschränkung Klonen Websites gelegt.

  1. Füllen Sie die Protein Ausdruck Assays nach Richtlinien des Herstellers zu ermitteln, die richtigen Bedingungen für groß angelegte Ausdruck (kurz unten beschrieben).
    1. Verwandeln die DesB-haltigen Plasmide in kommerziell hergestellt, chemisch kompetente E. Coli BL21 (DE3) Zellen, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, die Zellen für 10 min auf Eis Auftauen, fügen ca. 10-50 ng Plasmid DNA in der Zelle Mischung, Hitzeschock der Zellen bei 42 ° C für 10 s, und inkubieren sie auf Eis für eine zusätzliche 5 min. hinzufügen SOC Medien zu einem Endvolumen von 1 mL erhalten und ermöglichen die Zellen (~ 200 u/min) bei 37 ° C für 60 min schütteln. Auf eine LB-Amp-Platte hinzufügen und 100 µL der Zelle Lösung zu verbreiten und über Nacht bei 37 ° c inkubieren
    2. Wählen Sie eine einzelne Kolonie-bildende Einheit von der Platte nach der Inkubation über Nacht und dieser Kolonie 10 mL LB-Amp Medien impfen. Wachsen Sie die Zellen über Nacht, mit Zittern (~ 200 u/min) bei 37 ° C.
    3. Bis 10 mL der Medien fügen Sie 100 µL der Lösung über Nacht Wachstum, und schütteln Sie die neuen Medien wie unter Schritt 3.1.2 bei 37 ° C. Wenn die Extinktion bei 600 nm (OD600) ist zwischen 0,4-0,8, fügen Sie Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside (IPTG), eine endgültige Lösung-Konzentration von 1 mM zu erhalten.
    4. Sofort eine Aliquote 1 mL der Lösung zu entfernen und überträgt es auf einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit beschrifteten Zeit = 0 Stunden. Drehen Sie das Rohr auf 15.000 x g für 10 min. zu die Zellen zu Pellets. Entfernen Sie nach dem Spinnen den überstand zu und Lagern Sie die Zellen bei 4 ° c
    5. Entfernen Sie zusätzliche Aliquote (1 mL) in zeitlichen Intervallen nach der Zugabe von IPTG (in der Regel bei 5, 10, 12, 18 und 24 h). Wie in Schritt 3.1.4 beschrieben, Zentrifugieren Sie jedes Röhrchen, abgießen Sie überstand und speichern Sie die Zellen bei 4 ° c
    6. Sobald alle erhalten die aliquoten, Aufschwemmen der Zellen von jeder Timepoint in 30 µL bakterielle Protein Extraktionslösung, 10-15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und Zentrifugieren der Rohre bei 15.000 × g für 5 min um die löslichen und unlöslichen zu trennen Proteine.
    7. Übertragen Sie die lösliche Protein-Lösung zu einem neuen Microcentrifuge Schlauch und aufzuwirbeln Sie die übrigen unlöslichen Pellets mit 30 µL bakterielle Protein Extraktionslösung.
    8. 30 µL jeder Lösung (lösliche und unlösliche Lösungen für jede Timepoint) mit einem gleichen Volumen von Laemmli-Puffer zu kombinieren, dann auf einem SDS-PAGE Gel40visualisieren. Wählen Sie Bedingungen entspricht die Fahrspuren, die richtige Größe-Bands in der löslichen Fraktion für groß angelegte Proteinexpression und Reinigung enthalten.
      Hinweis: Da minimal lösliches Protein mit oben genannten Bedingungen zunächst generiert wurde, wurden verschiedene Ergänzungen hinzugefügt, um Auswirkungen auf die lösliche Protein-Expression mit 0,2 mM L-Cystein und 0,1 mM Eisen Ammoniumsulfat zeigen verbesserte Protein testen Ausdruck. Laut diesem Protein Ausdruck Bildschirm war ein angemessener Ausdruck Vektor für lösliche Produktion von DesB pMAL c5x Vektor.
  2. Folgenden Umwandlung in Escherichia coli BL21 (DE3), machen Sie einen Vorrat an DesB/pMal-c5x durch die Kombination von 900 µL Bakterienkultur (Erwachsene Übernachtung mit schütteln bei 200 u/min und 37 ° C) mit 100 µL von 80 % Glycerin. Speichern Sie die Aktie bei-80 ° C in einem Kryo Röhrchen.
    Hinweis: Stellen Sie ein neues Lager etwa alle 6-8 Monate eingefroren.
  3. Verwenden Sie eine PIPETTENSPITZE zum kratzen Zellen aus dem gefrorenen bestand und starten eine Bakterienkultur wächst über Nacht in 5 mL LB-Amp Medien bei 37 ° C mit schütteln. 1,5 Liter LB-Amp Medien in eine 2 L Flasche bei 37 ° C und 200 u/min, mit der über Nacht gewachsenen Bakterienkultur zu impfen.
    Hinweis: Aufgrund der beobachteten Empfindlichkeit des Proteins zu Sauerstoff, dass reduzierte Gasraum in der Küvette und mäßigem schütteln Geschwindigkeiten verbesserte Proteinausbeute für groß angelegte Ausdruck ergab.
  4. Proteinexpression auslösen wenn die Extinktion bei 600 nm (OD600) liegt zwischen 0,4-0,8 mit 1 mM IPTG und ergänzt mit 0,2 mM L-Cystein und 0,1 mM Eisen Ammoniumsulfat. Senken Sie die Inkubationstemperatur auf 30 ° C und bei 200 u/min schütteln. Spin-down der Zellen durch Zentrifugation nach 24 h nach Induktion bei 4.700 x g für 10 min und entsorgen Sie verbrauchten Medien.
  5. Aufzuwirbeln Sie die Zelle-Pellets in 20 mL Amylose Spalte Puffer pro jedes 1,5 L von Wachstum, gefolgt durch die Zugabe von 1 mg Lysozym. Rühren Sie für 20 Minuten auf Eis.
    Hinweis: Weitere Puffer kann wenn die Lösung zu zähflüssig ist, als Protein-Lösungen, die zu zäh sind homogenisierende Folgeschritt stören können hinzugefügt werden.
  6. Lösen Sie die resuspendierte Zelle Lösung per Hochdruck Homogenisierung mit 3-5 Pässe bei ca. 15.000 Psi. Das Protein an eine 50 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und der Gasraum mit Stickstoff für 1 min spülen. Zentrifugieren Sie dann die Zelle lysate bei 20.000 x g 40 min, die unlösliche Ablagerungen zu entfernen.
    Hinweis: Erfolgreiche Homogenisieren bewirkt, dass das Protein Micellen Form wie es durch das Rohr in die sammelflasche fließt, und die Lösung als eine transluzente grau-braune Farbe erscheint. Halten Sie das homogenisierte Protein auf dem Eis während des Prozesses.
  7. Nach Zentrifugation cap Übertragung der Überstand in ein 50 mL Röhrchen (mehr als eine möglicherweise notwendig), das Rohr mit einer gummiseptum und ein 20-Gauge-Nadel, langsam Blase Stickstoffgas durch die Lösung für 2 min, Sauerstoff zu verdrängen. Wickeln Sie das Septum mit Paraffin Film weiter mit Kupferdraht zu sichern Sie und bringen Sie den überstand in der Glove-Box zusammen mit den Säulenmaterialien.
  8. Equilibrate die Spalte (siehe Punkt 2.3) und laden Sie das Protein überstand auf die Säule. Sammeln Sie die Durchströmung in 5 mL Fraktionen unter mäßig unter Druck stehenden Stickstoff (1 Tropfen/Sekunde oder ca. 5 mL/min). Anschließend waschen Sie die Spalte mit einer anderen 3-Spalten-Bände der Amylose Spalte Puffer und manuell erfassen Sie 3 mL Fraktionen in Glas Reagenzgläsern unter mäßig unter Druck stehenden Stickstoff (ca. 5 mL/min). Eluieren Sie das Protein mit 5 Spalte Volumen (~ 50 mL) von Elution Buffer und manuell sammeln Sie 3 mL Fraktionen unter moderaten Stickstoffdruck (ca. 5 mL/min).
    Hinweis: Die Brüche können alternativ mit Schwerkraft Filtration gesammelt werden. Ca. 12 Elution Fraktionen sollten gesammelt werden.
  9. Sammle 30 µL-Aliquots der Fraktionen und entfernen Sie sie aus der Glove-Box ermöglicht die Visualisierung von Protein-haltigen Brüche durch SDS-PAGE-Analyse.
    Hinweis: Die gesammelten Fraktionen bleiben im Handschuhfach für die Dauer dieses Tests. Gereinigten DesB elutes in der Regel aus der Spalte in Sekundenbruchteilen 3 bis 5.

4. anaerobe Protein Konzentration/Buffer Tausch

  1. Montieren Sie den unter Druck stehenden, gerührten Zelle Konzentrator mit 76 mm rekonstituierte Zellulose Membranfilter (10 kDa cutoff). Fügen Sie eine ausreichende Menge von 20 % Ethanol in der Konzentrator zu halten die Membran nass wie der montierte Konzentrator in der Glove-Box übertragen wird.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass es keine Risse in der Membran gibt und o-Ring nicht zerknittert ist.
  2. Waschen Sie nach der gerührten Zelle Konzentrator in das Handschuhfach zu bringen, die Ethanol-Lösung aus der Membran mit Wasser. Kappe und die gerührte Zelle, reinigen Sie die Schläuche und die Membran der überschüssiges Wasser unter Druck zu setzen.
  3. Fügen Sie alle Fraktionen mit Eiweiß wie der Konzentrator durch SDS-PAGE (Abbildung 3) bestimmt. Fügen Sie ausreichend Austausch Puffer 150 mL Gesamtprotein Lösung Volumen ergeben.
  4. Die gerührten Zelle Kammer mit einer Amtsleitung N2 unter Druck zu setzen und das Protein, 50 mL mit moderater Geschwindigkeit rühren zu konzentrieren.
    Hinweis: Erreichen einer Konzentration von 50 mL ca. 20 min dauert.
  5. 100 mL Puffer Austausch mit 0,1 mM Dithiothreitol (DTT) und 0,1 mM Eisen Ammoniumsulfat zu ergänzen, der gerührten Zelle die Lösung hinzu, und das Protein auf ein Gesamtvolumen von 50 mL mit einer moderaten Geschwindigkeit rühren zu konzentrieren.
  6. Nachdem die Lösung erreicht ein Volumen von 50 mL hat, einmal mehr im Puffer ergänzt Exchange hinzufügen, aber die Lösung auf ein Gesamtvolumen von 10 mL mit moderater Geschwindigkeit rühren konzentrieren.
  7. Filtern Sie das konzentrierte Protein mit einem 0,45 µm Pore Größe Spritze Filter und Aliquot in einzelnen 0,2 mL Polymerase-Kettenreaktion (Pcr) Rohre (jeweils ca. 150 µL der Proteinlösung). Entfernen Sie die angeschnittene Ärmel Aliquote aus dem Handschuhfach und sofort Blitz einfrieren mit flüssigem Stickstoff. Speichern der Aliquote bei-80 ° C.

(5) DesB Entsalzung

  1. Spülen Sie Glove Bags mit Stickstoffgas ca. 1,5 Stunden vor Gebrauch.
  2. Eine 150 µL Aliquote des gereinigten DesB Protein innerhalb der Glove Bags auf Eis Auftauen.
  3. Während das Protein Taut, bereiten Sie eine kleine Schwerkraft, Entsalzung Spalte enthält 3 mL Sephadex G-25 groben Entsalzung Gel in einer 9 mL Borosilikat-Spalte. Waschen Sie die Spalte mit 2 Spalte Volumen (~ 6 mL) von entgast Entsalzen Puffer.
    Hinweis: Ersetzen der Entsalzung Gels, wenn es eine Änderung im Gel Farbe von weiß bis gelb (nach ca. 7 Mal verwendet).
  4. Laden Sie die aufgetauten DesB auf die Säule über einen Schwerkraft-gesteuerten Prozess. Entsorgen Sie den Durchfluss. Eluieren Sie das Protein mit ca. 5 mL Puffer Entsalzung.
    Hinweis: Der Druck von der Gas-Tank kontinuierlich füllen der Handschuh Tasche die Rate wirken an der die Lösungen aus der Spalte tropft.
  5. Sammeln Sie für anfängliche Bestimmung von Protein Elution aus der Spalte 12 Fläschchen/Elutions (mit 3 Tropfen pro Fläschchen). Mit einer gummiseptum versiegelt, entfernen Sie sie aus der Glove Bags und Test für das Vorhandensein von Protein entweder direkt (durch SDS-PAGE Gelanalyse) oder indirekt (durch Untersuchung der Tätigkeit der einzelnen Fraktionen).
    Hinweis: In der Regel werden die Fraktionen einzeln auf Aktivität geprüft wie unter Punkt 7.1, mit der größten Aktivität entspricht den Bruch mit der größten Konzentration von aktiven Proteinen beschrieben. DesB elutes in der Regel ab der 7. Tropfen, nach dem die folgenden 9 Tropfen des entsalzten Protein gesammelt werden. Protein-Aliquote Lagern auf Eis während der Kinetik-Messungen (Schritte 7.1-7.4).

6. Vorbereitung der Sauerstoff-Elektrode

  1. Polieren Sie die silberanode Ring und Platin Kathode Elektrode Reiniger mit einem feuchten Wattestäbchen bis gibt es keine sichtbaren Anzeichen von schwarzen Oxid Einlagen.
  2. Mit einer Schere Schnitt etwa ein 1,5-Zoll-Quadrat Abstandhalter Papier (oder rollenden Zigarettenpapier, die gleichermaßen so gut funktioniert). Dann schneiden Sie (1) kleine Dreiecke auf jede Fläche des Quadrats und des 2) Schlitze in die Ecken, Umhüllung der Elektrode zu unterstützen.
  3. Fügen Sie 5 Tropfen einer 50 %-KCl-Lösung auf die silberanode groove und verbinden sie, so sie einen kontinuierlichen Ring-Lösung bilden hinzu. 2 Tropfen der KCl-Lösung 50 % an die Spitze der Platin-Elektrode. Vorsichtig legen Sie das Distanzstück Papier auf der Platin-Elektrode und das Distanzstück Papier glätten Sie, damit keine Luftblasen vorhanden sind.
    Hinweis: Verwenden Sie Vorsicht, um zu vermeiden, die Abstandhalter Papier reißen.
  4. Schneiden Sie ein Stück der S4 30m PTFE (Polytetrafluorethylen) Membran, die ungefähr 2 Zoll lang ist, und legen Sie es auf die Abstandhalter-Papier. Die Kanten der Membran geschnitten Sie ab, so dass sie mit dem äußeren Ring der Elektrode ausgerichtet sind.
  5. Mit dem o-Ring-Applikator, schieben Sie den kleinen o-Ring über die Elektrode, die Abstandhalter Papier und Membran auf die Elektrode zu sichern. Die größeren o-Ring auf die kreisförmige Nut der Elektrode, Gewährleistung gibt es findet keine Membran darunter. Schieben Sie die obere Kammer der Elektrode auf den Boden und Schrauben Sie die beiden zusammen.
    Hinweis: Die beiden sind richtig, wenn keine Luft Luftblasen halten Sie sich die Seiten der Kammer aufgeschraubt.
  6. Platzieren Sie die montierte Elektrode auf seiner Unterlage und verbinden Sie die Elektrode an das monitoring-System. Das Steuerungsprogramm Elektrode zu initiieren und Kalibrieren der elektrodendurchmessers durch Ausführen der Flüssigphase Kalibrierung Protokoll (Abb. 4A). Die Variable Temperatur sollte die Temperatur des Raumes, in dem das Experiment durchgeführt wird, und die Umgebungsdruck Variable ist abhängig von der Region und die aktuellen Wetterbedingungen.
    Hinweis: Umgebungsdruck erhalten Sie bei einen Wetterbericht für die Region.
  7. Die elektrodenkammer 1 mL 25 mM Tris-Puffer hinzu, legen Sie den Kolben, beginnen Sie die Kalibrierung einer Sauerstoff gesättigte Lösung, und einstellen Sie die Rührer-Geschwindigkeit bis 100. Nachdem die Elektrode stabilisiert, den Kalibrierung-Sollwert für den Sauerstoff gesättigter Lösung ermittelt (Abbildung 4 b).
  8. Ohne den Kolben zu entfernen, verwenden Sie eine 1,2 x 40 mm Nadel und 1 mL Spritze etwa 1 mL Natrium Dithionite Lösung in der Kammer zu injizieren, vorsichtig zu vermeiden, indem eventuell vorhandene Luftbläschen (Abbildung 4). Verwenden Sie einen Gummistopfen, um die elektrodenkammer sofort nach Natrium Dithionite Zugabe zu versiegeln.
  9. Lassen Sie die Kalibrierung fortgesetzt, bis der Sauerstoff ausgenutzt wird und das Programm zu beenden und speichern die Kalibrierung (Abbildung 4). Die Lösung aus der Kammer anzusaugen und 5-6 Mal die Kolben und Kammer mit entionisiertem Wasser spülen um vollständige Entfernung von Natrium Dithionite zu gewährleisten. Beim abspülen, verwenden Sie ein Kunststoffrohr mit einer PIPETTENSPITZE verbunden mit einem Seitenarm Thermoskanne ausgestattet. Beschädigung der Membran zu vermeiden.

(7) kinetic Assays mit der Sauerstoff-Elektrode

  1. Identifizieren Sie das entsalzte Aliquote enthält aktives Protein durch Tests seriell 1 µL Enzymlösung für Aktivität in einer Lösung von 25 mM Tris-Puffer mit pH 7,5 und 100 µM Gallat enthalten. Verwenden Sie die Aliquot(s) mit der größten beobachteten Tätigkeit für die verbleibenden Versuche. (Siehe Schritt 5.5.1)
  2. Bestimmen Sie die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion durch die Messung der O2 -Verbrauch mit einem O-2-sensible Clark-Typ-Elektrode mit Computer-Integration über die Elektrode-Steuereinheit.
    1. Für jeden Kinetik Punktmessung von DesB, die elektrodenkammer 1 mL 25 mM Tris-Puffer (pH 7,5) hinzufügen. Der Tris-Puffer für die Erreichung der gewünschten endgültigen Substratkonzentration (0,05-25 mM) fügen Sie einem berechneten Volumen von 25 mM-Stammlösung von Gallat hinzu.
      Hinweis: Bereiten Sie täglich frische Stammlösungen Gallat und hemmende Verbindungen mit Wasser und nachstellen Sie den pH-Wert auf 7,5 mit dem Zusatz von 0,1 mM NaOH, ggf..
    2. Nach 10 s unter ständigem Rühren zu lassen für das Mischen der Lösung, die Kammer mit den Kolben langsam zu versiegeln und Schraube von oben nach unten. Einem sauberen Tuch kann verwendet werden, um die überschüssige Flüssigkeit aufsaugen, die aus der Kammer verdrängt wird. Lassen Sie die Elektrode zu equilibrate, wo es eine stabile Messung der Sauerstoffkonzentration in der Lösung für mindestens 1 Minute bevor Sie mit dem Zusatz des Enzyms (Hintergrund O2 Verbrauch von ± 0,5 µM/min) zu produzieren.
    3. Die elektrodenkammer durch den Kolben mit einer Gas knapp 10 µL Spritze, ca. 1 µL Enzym (ca. 3 bis 7 µM Enzym) hinzufügen.
      Hinweis: Die Menge des Enzyms kann erhöht oder verringert in Reaktion auf die beobachteten Aktivität der spezifischen aliquoten Reaktionsgeschwindigkeiten ausreichend ermöglichen.
    4. Berechnen Sie die Reaktion Geschwindigkeit basierend auf der Piste die ersten 30 s lineare Daten nach zurückgekühlt und korrekt für Hintergrund-O2 -Verbrauch mit der 30 s Daten unmittelbar vor zurückgekühlt. Die Rate der Katalyse ist gleich der O2 Verbrauch (Abb. 5A).
    5. Nach der Entnahme der Tarifdaten für einen bestimmten Substratkonzentration, leeren die elektrodenkammer durch Aspiration mithilfe ein Kunststoffrohr an einem Seitenarm Isolierflasche und Spülen mit Wasser für 4 bis 6 Zyklen wiederholt. Richten Sie die Lösung in der Elektrode wie im Schritt mit einem neuen Substratkonzentration 7.2.1 beschrieben.
    6. Substrat-Konzentrationen in einer ungeordneten Weise variieren und replizieren im Laufe des Experiments um Rückgang der Enzym-Aktivität mit der Zeit (Abbildung 5 b) zu berücksichtigen.
      Hinweis: Wenn Wiederholungen einer bestimmten Konzentration laufen und mehr als eine 30 % Rückgang der Rate im Vergleich zu einer früher laufen zeigen, sollte keine zusätzliche Tests mit diesem Batch Enzyms durchgeführt werden. In der Regel nach 30-40 läuft zeigt das Enzym eine 30 % Abnahme der Aktivität.
    7. Bestimmen Sie die kinetischen Parameter kKatze (die katalytische Konstante für die Umwandlung von Substrat in Produkt) und Km (Michaelis-Konstante, operativ definiert als die Substratkonzentration, an dem die erste Rate ist die Hälfte der maximalen Geschwindigkeit), durch eine kleinste-Quadrate-passende Daten aus jeder der Substrat-Konzentrationen in der Michaelis−Menten Gleichung (Abbildung 6) mit GraphPad Prism.
  3. Fügen Sie 4-Nitrocatechol (4NC) um ihre Auswirkungen auf die Dioxygenation Kinetik zu testen und festzustellen, die Hemmung-Konstante (Kich) mit DesB hinzu. Für jede Bedingung Reaktion auf Lager Lösungen von Tris (50 mM), Gallat (25 mM) und 4NC (25 mM) werden kombiniert und verdünnt mit Wasser zu eine 2 mL Lösung von 25 mM Tris-Puffer (pH 7,5) mit 1 mM Gallat Ausbeute und unterschiedlichen Konzentrationen von 4NC. Das Volumen der 4NC wurde variiert, um die gewünschte endgültige inhibitorkonzentration (0,05-20 mM) zu erreichen.
    1. Nach 10 Sekunden rühren, Mischen der Lösung zu ermöglichen, setzen Sie den Kolben langsam in die Kammer und Schraube von oben nach unten. Einem sauberen Tuch kann verwendet werden, um die überschüssige Flüssigkeit aufsaugen, die aus der Kammer verdrängt wird. Lassen Sie die Elektrode zu equilibrate und eine stabile Messung des Sauerstoffkonzentration in der Lösung für mindestens 1 Minute bevor Sie mit dem Zusatz des Enzyms (Hintergrund O2 Verbrauch von ± 0,5 µM/min) zu produzieren.
    2. Wie bereits beschrieben, fügen Sie das Protein (Schritt 7.2.3), bestimmen die Geschwindigkeit der Reaktion (Schritt 7.2.4) und Zurücksetzen der Elektrode für die nächste Bedingung.
    3. Als Teil dieser Serie von Experimenten bestimmen Sie die Reaktionsgeschwindigkeit bei fehlender Inhibitor mehrere Male. Die Hemmung durch die Standardisierung von der Sauerstoffverbrauch in Anwesenheit von verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen mit 1 mM Substrat und das Fehlen von Hemmer (V/Vo) zu bestimmen.
    4. Passen Sie die Hemmung der Gallat Dioxygenation Gleichung 7.3A und anschließend die Hemmung Daten Gleichung 7.3B mit einem Grafik-Programm (Abbildung 7).
  4. Bestimmen Sie die genaue Enzym Konzentration für jedes Experiment durch Ausführen einer Bradford-Tests nach Abschluss aller kinetische läuft.
    Hinweis: Alle Preise wurden für Enzym Konzentration korrigiert. Dieser Schritt muss nicht in einem Handschuhfach oder Glove Bags erfolgen.

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Ergebnisse

Gezeigt wird die SDS-PAGE Gelanalyse der einzelnen Fraktionen von Reinigung des DesB-Maltose Binding Protein (MBP) Fusion Konstrukts (Abbildung 3). Das Gel zeigt, dass das Protein pur (MW = 91.22 kDa), mit Ausnahme der Anwesenheit von DesB (MW = 49.22 kDa) und MBP Protein-Domäne (42 kDa) voneinander gespalten. Brüche-E2 und E3 wurden für Konzentration (Schritt 4.2) ausgewählt.

Reproduzierbare Ergebn...

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Diskussion

Die entscheidenden Schritte bei der Beschaffung von aktiven, gereinigten DesB Protein beinhalten die Bildung und Aufrechterhaltung der reduzierten Fe(II) aktiven Seite im Enzym. Als solche korrigieren Leistung von Induktion, Reinigung, Konzentration und Entsalzung Schritte sind unerlässlich, um aktives Enzym erfolgreich zu erhalten. Induktion der Proteinexpression in Anwesenheit von Eisen Ammoniumsulfat 1 mM sorgt dafür, dass Fe(II) aktiven Seite des DesB korrekt eingebaut ist. Diese Methode orientiert sich an Studien wi...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt finanzielle oder sonstige Interessenkonflikte.

Danksagungen

Wir möchten Dr. Camille Keller der Wesleyan University für technische Unterstützung zu danken. Besonderer Dank geht an Professor Lindsay D. Eltis sowie Jenna K. Capyk von der University of British Columbia und Christian Whitman von der University of Texas at Austin, für ihre Beratung über anaerobe Protein Reinigungsverfahren und die Verwendung von einem O2 -empfindliche Elektrode.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranodiseGold Bio TechnologiesI2481C50
Coomassie Brilliant Blue R-250Bio-Rad161-0400
AmmoniumpersulfatBio-Rad161-0700
30% AcrylamidBio-Rad161-0158
N,N'Tetramethyl-ethylendiaminBio-Rad161-0801
Amylose-Harz High FlowNew England BiolabsE8022S
BL21 (DE3) kompetente Escherichia coli-ZellenNew England BiolabsC2527I
L-CysteinSigma AldrichC7352
GallussäureSigma AldrichG7384
4-NitrocatecholSigma AldrichN15553
Eisen AmmoniumsulfatMallinckrodt5064
NatriumdithionitAlfa Aesar33381-22
Wheaton SerumflaschenFisher Scientific06-406G
25 mm Acrodisc PF Spritzenfilter mit Supor MembranePall Corportation4187
400 mL Amicon RührzellenkonzentratorEMD MilliporeUFSC40001
76 mm Millipore Ultracel 10 kDa Cutoff-Filter für rekonstituierte ZellulosemembranEMD MilliporePLGC07610
DL-DithiothreitolGold Bio TechnologiesDTT50
Sephadex G-25 GrobentsalzungssäuleGE Healthcare17-0033-01
2-ml-BördelfläschchenFisher Scientific03-391-38
Oxygraph Plus ElektrodensteuergerätHansatech InstrumentsOXYG1 Plus
Sauerstoff-EletrodenkammerHansatech InstrumentsDW1
ElektrodenscheibeHansatech InstrumentsS1
PTFE (0,0125 mmX25mm) 30m RolleHansatech InstrumentsS4
ElektrodenreinigungssetHansatech InstrumentsS16
AbstandspapierZick-Zackan jeder Tankstelle
He-Serie Dri-Lab HandschuhfachVakuum/Atmosphären Unternehmen
HE-493 Dri-TrainVakuum/Atmosphären Unternehmen
Doppelseitiger mikrokonischer EdelstahlspatelFisher Scientific21-401-10
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Säule Economy SäuleFisher Scientifick420400-1530
10 μ L, Modell 701 N SYR, Zementiert NDL 26s ga, 2 in, point stlye 2Spritze Hamilton80300
DWK Life Sciences Kimble Kontes Flex Column Economy SäuleFisher ScientificK420401-1505
Emulsiflex-C5 Hochdruck-HomogenisatorAvestin
zur vollständigen bakteriellen ProteinextraktionThermo Fisher Scientific89821
Lysozym aus HühnereiweißSigma Aldrich12650-88-3
NatriumdodecylsulfatThermo Fisher Scientific151-21-3
AmpicillinSigma Aldrich7177-48-2
TryptonFisher ScientificBP-1421-500
HefeextraktFisher ScientificBP1422-2
NatriumchloridFisher ScientificS271-10
KaliumchloridFisher ScientificP217-3
MagnesiumchloridFisher ScientificM33-500
DextroseFisher ScientificD16-3
NatriumhydroxidFisher ScientificS318-1
TrishydrochloridFisher ScientificBP153-500
MaltoseFisher ScientificBP684-500
GlycinFisher ScientificG46-500
erhältlich B-PER Reagenz

Referenzen

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Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung
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