Methodenartikel

Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid eine Ultrafiltration Zentrifugation Technik

DOI:

10.3791/58310

⸱

9. November 2018

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Pulmonary and Critical Care, Women's Guild Lung Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Medicine, Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier beschreiben wir zwei extrazellulären Vesikel Isolierung Protokolle, Ultrafiltration Zentrifugation und Ultrazentrifugation mit Dichte Steigung Zentrifugierung, extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Flüssigkeitsproben zu isolieren. Die extrazelluläre Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid durch beide Methoden abgeleitet werden quantifiziert und charakterisiert.

Zusammenfassung

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind neu entdeckte subzelluläre Komponenten, die in vielen biologischen Funktionen während physiologische und pathologische Zustände signalisieren eine wichtige Rolle spielen. Die Isolation der EVs nach wie vor eine große Herausforderung in diesem Bereich aufgrund von Einschränkungen für jede Technik. Die differentielle Ultrazentrifugation mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung-Methode ist eine häufig verwendete Ansatz und gilt als der Goldstandard-Verfahren für EV Isolation. Dieses Verfahren ist jedoch zeitaufwendig, arbeitsintensiv, und in der Regel führt zu niedrigen Skalierbarkeit, die möglicherweise nicht geeignet für kleinvolumige Proben wie alvéolaire Lavage-Flüssigkeit. Wir zeigen, dass eine Ultrafiltration Zentrifugierung isoliert Methode einfach ist und doch Zeit und Arbeit-effiziente eine hohe Rückgewinnung Ausbeute und Reinheit bietet. Wir schlagen vor, diese Isolationsmethode ein alternativer Ansatz sein könnte, der sich für EV Isolation, besonders für kleinvolumige biologischen Proben eignet.

Einleitung

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Exosomen sind die kleinste Teilmenge des EFD, 50 – 200 nm im Durchmesser, und haben mehrere biologische Funktionen über eine Vielzahl von Prozessen1,2,3,4,5-Signalisierung. Sie regieren Mobilfunk- und Gewebe Homöostase in erster Linie durch Erleichterung der interzellulären Kommunikation durch Ladung Moleküle wie Lipide, Proteine und Nukleinsäuren6,7,8,9 . Ein entscheidender Schritt in der EV-Forschung ist die Isolierung-Prozess. Differenzielle Ultrazentrifugation (UC), mit oder ohne Dichte Gradienten Zentrifugation (DGC), gilt als des Goldstandard Ansatzes, aber diese Methode trägt wesentliche Einschränkungen, wie ineffizient EV Wiederfindungsraten und geringe Skalierbarkeit10 , 11 , 12, einschränken, seine beste Auslastung zu größeren Volumen Proben, wie Zelle Kultur überstand oder hohe Exosom Produktion Proben. Die vor- und Nachteile von anderen Methoden, wie z. B. Größe Ausgrenzung durch Ultrafiltration oder Chromatographie, Immunoaffinitäts Isolierung von Perlen oder Spalten und Mikrofluidik, sind gut beschrieben und moderne ergänzende Verfahren wurden entwickelt, um einen zu überwinden Sie und minimieren Sie technische Einschränkungen in jedem Ansatz11,12,13,14,15. Andere haben gezeigt, dass eine Ultrafiltration Zentrifugation (UFC) mit einem nanoporösen Membran in der Filtereinheit ist eine alternative Technik, die vergleichbare Reinheit eine UC-Methode16,17,18liefert. Diese Technik könnte als eine der alternativen Isolierung Methoden betrachtet werden.

Alvéolaire Lavage-Flüssigkeit (BALF) enthält EVs, die zahlreiche biologische Funktionen in verschiedenen Atemwegserkrankungen19,20,21,22besitzen. Studieren BALF abgeleitet EVs bringt einige Herausforderungen aufgrund der Invasivität der Bronchoskopie Verfahren beim Menschen, sowie eine begrenzte Anzahl von Lavage Fluid Erholung. Im kleinen Labortiere wie Mäuse nur wenige Milliliter im normalen Lungenerkrankungen zurückgewonnen werden, noch weniger entzündeten oder fibrotische Lungen23. Infolgedessen kann das Sammeln einer ausreichenden Menge an BALF EV Isolation durch eine differenzierte Ultrazentrifugation für downstream-Anwendungen nicht möglich sein. Richtige EV Bevölkerung zu isolieren ist jedoch ein entscheidender Faktor für das Studium EV biologischer Funktionen. Das empfindliche Gleichgewicht zwischen Effizienz und Effektivität nach wie vor eine Herausforderung in etablierten EV Isolationsmethoden.

In dieser aktuellen Studie zeigen wir, dass ein zentrifugale Ultrafiltration Ansatz, unter Verwendung einer 100 kDa Molekulargewicht Cut-Off (MWCO) Nanomembrane Filtereinheit, für kleinvolumige biologische Proben wie BALF geeignet ist. Diese Technik ist einfach, effizient und sorgt für hohe Reinheit und Skalierbarkeit zur Unterstützung der Studie des EFD BALF abgeleitet.

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Protokoll

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Die Nutzung von Tieren und alle tierischen Verfahren wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse (IACUC) am Cedars-Sinai Medical Center (CSMC) genehmigt.

(1) murinen alvéolaire Lavage Fluid (BALF) Sammlung und Aufbereitung

  1. BALF Sammlung
    1. Einschläfern Sie Mäuse mit einem Cocktail von Ketamin (300 mg/kg) und Xylazin (30 mg/kg) über die intraperitoneale Route gefolgt von zervikale Dislokation.
    2. Legen Sie eine 22 G Angiocatheter in der Luftröhre. Fügen Sie eine Insulin-Spritze mit 1 mL (mL) der eiskalten sterile Dulbecco Phosphat Puffer Kochsalzlösung (DPBS) und vermitteln Sie 1 mL DBPS in beiden Lungen durch die Angiocatheter zu.
    3. Ziehen Sie langsam den Spritzenkolben zum Abrufen von BALF und die BALF in ein 50 mL konische Röhrchen zu verzichten. Halten Sie die BALF auf Eis.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 und 1.1.3 3 x (4 X insgesamt in jedem Mausklick).
      Hinweis: Etwa 0,8 mL wird in der Regel pro Milliliter Instillation abgerufen. Auch die folgenden Schritte können für individuelle Mäuse (d.h.3 mL BALF) durchgeführt werden, aber die Isolierung eines größeren Batches von EVs aus Konsistenzgründen in nachgeschalteten Experimente ermöglicht Bündelung mehrerer BALF Proben.
  2. BALF Vorbereitung
    1. Bündeln Sie BALF aus 25 Mäuse zu und teilen sie in zwei gleiche Sätze (~ 35 mL pro aliquoten).
    2. Zentrifugieren Sie BALF bei 400 X g bei 4 ° C für 5 min, um Zellen und anderen zellularen Rückstand zu entfernen und den Überstand zu sammeln.
    3. Zentrifugieren des Überstands bei 1.500 x g bei 4 ° C für 10 min, um Zelle Ablagerungen zu entfernen. Sammeln Sie den Überstand zu und fahren Sie mit der EV-Isolierung-Schritten.

2. Isolierung der extrazellulären Vesikel aus murinen alvéolaire Lavage Fluid

Hinweis: In dieser Studie, zwei EV Isolierungstechniken verwendet nämlich UFC und Ultrazentrifugation mit lebhaften, EVs aus BALF zu isolieren. Das ausführliche Protokoll der einzelnen Methoden wird nachfolgend beschrieben.

  1. Ultrafiltration Zentrifugation (UFC) Bereicherung Methode
    Hinweis: Diese Methode wurde von einem zuvor beschriebenen Protokoll10geändert.
    1. Filtern Sie den Überstand von Schritt 1.2.3 durch einen 0,2 μm sterile Spritze Filter und halten Sie die gefilterten BALF auf Eis.
      Hinweis: Dies ist eine Abstufung der Ausgrenzung wobei nur Bläschen kleiner als 200 nm werden gesammelt.
    2. Equilibrate 100 kDa MWCO zentrifugale Filtereinheit mit sterilen DPBS für 10 min. Zentrifugen zentrifugale Einheit bei 1.500 x g für 10 min bei 4 ° C um die DPBS zu verwerfen.
      Achtung: Sobald die Membran in das Filter-Gerät mit DPBS equilibriert, muss die Membran gehalten werden nass in alle Zeit, bis das Gerät verwendet wird.
    3. Füllen Sie die Filtereinheit mit 15 mL BALF Probe aus Schritt 2.1.1 und Zentrifuge bei 3.000 x g für 30 min bei 4 ° C. Durchströmten BALF kann verworfen oder in einem separaten kanonische Rohr gesammelt und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung gespeichert.
    4. Wiederholen Sie Schritt 2.1.3 für die verbleibenden 0,2 µm filtriert BALF.
      Hinweis: Es hat drei Wiederholungen des Centrifugations BALF EVs aus dem ursprünglichen Start Volumen von 35 mL ausreichend zu konzentrieren. Dies führte zu 1 – 1,5 mL Retentat.
    5. Waschen Sie das Retentat mit 14 mL sterile DPBS durch ein sanft Pipettieren wiederholt. Zentrifugieren Sie die Filtereinheit an 3.000 x g bei 4 ° C für 30 min, des DPBS entfernen und die EV Retentat konzentrieren.
    6. Sammeln Sie die konzentrierte BALF abgeleitet EVs aus dem Filter-Gerät durch Einfügen einer Pipette in die Unterseite des Geräts Filter und Aberkennung der Probe mit einer Seite zur anderen geschwungenen Bewegung um totale Erholung zu gewährleisten.
    7. Aliquot der EVs BALF abgeleitet und bei-80 ° C für weitere Teilchen Quantifizierung und Charakterisierung (siehe Schritt 3) zu speichern.
  2. Ultrazentrifugation (UC) mit Dichte Gradienten Zentrifugation (DGC)
    Hinweis: Das folgende Protokoll wurde aus dem zuvor beschriebenen Protokoll24geändert.
    1. Den Überstand von Schritt 2.1.1 in ein 37-mL Ultrazentrifugen Rohr übertragen und Zentrifugieren der Probe bei 10.000 x g für 30 min bei 4 ° C mit Ultrazentrifugen. Sammeln Sie die überstand und Zentrifuge bei 100.000 x g bei 4 ° C für 60 Minuten. Während die EV-Pellets zentrifugiert werden, bereiten Sie Schritt 2.2.3 unterschiedliche Konzentrationen der Dichte-Gradienten-Puffer (Tabelle 1).
    2. Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie der EV-Pellets in 200 μl des DPBS.
    3. Mischen Sie die EV-Aufhängung mit 300 μl Arbeitslösung 50 % Iodixanol (Tabelle 1) und auf 15 mL Ultrazentrifugen Rohr übertragen. Auf die 50 % Iodixanol-EV Mischung Suspension, sequenziell Schicht folgende Pufferlösung in der Reihenfolge von unten nach oben: 30 % Iodixanol (4,5 mL), 25 % des Iodixanol (3 mL), 15 % Iodixanol (2,5 mL) und 5 % Iodixanol (6 mL). Zentrifuge bei 100.000 x g bei 4 ° C für 230 min..
      Hinweis: Die Dichte-Gradienten basiert auf den Prozentsatz der Iodixanol Skalierung mit der höchsten Konzentration (50 %) an der Unterseite, die niedrigste Konzentration (5 %) an der Spitze. Um unterschiedliche Konzentrationen von Iodixanol zu erzeugen, wurden verschiedene Mengen von Homogenisierung Medium (Tabelle 1) mit funktionierende Lösung (50 % Iodixanol) gemischt.
    4. Sammeln Sie die 15 % und 25 % Anteil und in sterilen DPBS bringen die Lautstärke auf 15 mL zu verdünnen. Übertragen Sie sie auf eine neue kleine Ultrazentrifugen Rohr- und Zentrifuge bei 100.000 x g bei 4 ° C für 60 Minuten.
    5. Verwerfen Sie den Überstand und Aufschwemmen Sie der EV-Pellets in 50 μL der sterilen DPBS zur weiteren Charakterisierung.

(3) extrazelluläre Vesikel Quantifizierung

Hinweis: BALF abgeleitet EVs Erholung Ertrag ist mit zwei Metriken quantitated.

  1. Nanopartikel, die tracking-Analyse (NTA) Messung
    1. Die EV-Probe bei 1: 200 verdünnen – 1: 500 in 1 mL des DPBS und Belastung der Probe in einer Insulin-Spritze. Legen Sie eine Probe-Spritze auf eine Spritzenpumpe und zur Messung der Partikelanzahl und Größe (siehe Tabelle der Materialien) beginnen.
    2. 1 für alle Probemessungen der Kameraebene 14 und der Nachweisgrenze festgesetzt. Fünf sich wiederholende Messungen mit 1.500 Bilder in 30 s wurden für jede Probe mit einer Verzögerung von 20 s zwischen mal gelesen. Verbinden und die Daten für endgültige Konzentration und Größe Berichte im Durchschnitt.
      Hinweis: Für die genaue Erfassung aller Teilchen, der Pegel Kamera gegebenenfalls alle Partikel zu visualisieren und ähnliche Einstellungen für alle Probemessungen in jedem Experiment.
  2. Protein Quantifizierung
    Hinweis: Die Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay diente zur Messung der Proteinkonzentration der EVs BALF abgeleitet.
    1. Lösen Sie die EV-Proben in 1 X Lyse Puffer.
    2. Quantifizieren Sie die Menge an Protein in BALF abgeleitet EVs pro BCA Standardprotokoll mit kolorimetrischen Erkennung durch Messung der Extinktion bei 560 nm in einem Teller-Reader.

4. Nachweis von BALF abgeleiteten extrazellulären Vesikel

Hinweis: Allgemein bekannten Exosom Oberfläche Marker-Proteine (TSG101, CD63, CD81 und CD9) wurden zur EV Rückforderungen zu überprüfen durch SDS-PAGE und Immunoblotting und Flow Cytometry Analyse.

  1. SDS-PAGE und immunoblotting
    1. Auflösen einer gleichen Menge von EV Proteine jeder Probe mit ein Blot-Puffer (Lithium-Dodecyl-Sulfat) und 50 mM Dithiothreitol (DTT) in einem 1,6 mL Röhrchen werden geladen. Erwärmen Sie die Proben bei 70 ° C für 10 min.
    2. Die Proben aus 4.1.1 Schritt zu einem 4 – 12 % Bis-Tris Plus Acrylamid Gel laden und Ausführen von Elektrophorese (150 Volt, 35 mA) für 35 Minuten.
    3. Transfer-Proteine auf eine Nitrocellulose-Membran mit einer trockenen Transfermethode.
    4. Blockieren Sie die Membran mit 5 % Magermilch für 60 min bei Raumtemperatur (RT) rocken.
    5. Inkubieren Sie die Membran mit einem Antikörper zu einer EV Oberfläche Protein Marker, Tumor Anfälligkeit gen 101 (TSG101), 1: 500 Verdünnung in 5 % BSA in Tris gepufferte Kochsalzlösung Tween-20 (TBST) bei 4 ° C über Nacht rocken.
    6. Am nächsten Tag waschen die Membran 3 x 10 min jeweils in TBST Puffer, waschen und mit Anti-Kaninchen IgG, ein HRP-linked Antikörper bei 1:5,000 Verdünnung für 60 min bei RT inkubieren
    7. Waschen Sie die Membran 3 x 10 min jeweils waschen in TBST Puffer. Entwickeln Sie die Membran mit Chemilumineszenz HRP Antikörper-Erkennung-Reagenz und Bild (siehe Tabelle der Materialien für imaging-System).
  2. Durchflusszytometrie
    1. Verdünnen Sie BALF abgeleitet EVs in 49 μL der PEB Färbung Puffer (PBS + 5 mM EDTA + 0,5 % BSA, gefiltert durch eine Spritze-Filtermembran 0,1 μm).
    2. Jedes der folgenden Antikörper in jeder einzelnen Probe hinzufügen: 1) Ratte-Anti-Maus-PE CD63-Antikörper (100 ng pro Reaktion); (2) Ratte Anti-Maus PE CD81 (500 ng); (3) Ratte Anti-Maus FITC CD9 (200 ng). Bei 4 ° C, Schaukeln für 60 Minuten im Dunkeln inkubieren.
    3. Verdünnen Sie die Proben mit 450 μL der Membran gefiltert PEB Färbung Puffer und Proben zu Flow-Zytometrie-Analyse zu unterziehen (siehe Tabelle der Materialien)25.
    4. Passen Sie die Flow Cytometer Einstellungen wie folgt: 1) stellen alle Kanäle auf hyper-Protokoll (Hlog); (2) setzen Sie den Trigger auf SSC 4; (3) Schalten Sie die sekundäre Auslöser. Die Proben in eine langsame Einstellung laufen und mindestens 10.000 Veranstaltungen in jeder Probe zu erwerben.
    5. Niedrige Zytometrie Datenanalyse in jeder Probe mit Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien).

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Ergebnisse

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Wir führten EV Isolation aus Maus BALF Methoden UFC und UC-DGC Isolierung am selben Tag. Die UFC-Methode benötigt ca. 2,5-3 h, während die UC-DGC-Technik 8 h Verarbeitungszeit erforderlich. Dies beinhaltete nicht Puffern und Reagenz Vorbereitungszeit. Es sei darauf hingewiesen, dass einige andere Aufgaben während der Zentrifugation lange Perioden durchgeführt werden konnte. Die gesamte Prozedur dauerte jedoch fast einen ganzen Tag für die UC-DGC-Isolierung-Technik.

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Diskussion

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In den letzten Jahrzehnten haben Wissenschaftler die Bedeutungen der EVs in zelluläre Homöostase entwirrt. Noch wichtiger ist, spielen die EVs Hauptrollen in vielen Krankheitsprozessen durch Modulation der benachbarten und weit entfernten Zellen durch ihre Ladung bioaktiven Moleküle1,21,22,26,27 , 28 ,

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

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Die Arbeit wird von der NHLBI/NIH räumt HL103868 (P.C.) und HL137076 (für PC), American Heart Association Beihilfe (für PC) und Samuel erste umfassende Cancer Institute (SOCCI) Lung Cancer Research Award (für PC) unterstützt. Wir möchten unsere große Smidt Heart Institute im Cedars-Sinai Medical Center danken, die uns eine Nanosight Maschine für EV Nanopartikel tracking-Analyse bietet.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Material
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfilter Ultracel-100KSigma-Millipore, St. Louis, MOUFC910024
Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung (DPBS)Corning Cellgro, Manassas, VA21-031-CV
SaccharoseSigma-Millipore, St. Louis, MOEMD8550
HEPESResearch Products International, Prospect, IL75277-39-3
EDTACorning Cellgro, Manassas, VA46-034-CI
NatriumchloridSigma-Millipore, St. Louis, MOS3014-1KG
OptiPrepSigma-Millipore, St. Louis, MOMKCD9753Density Gradient Medium
KetaminVetOne, Boise, ID13985-702-10
XylazineAkorn Animal Health, Lake Forest, IL59399-110-20
Spritze 1 mLBD Spritze, Franklin Lakes, NJ309656
Angiokatheter 20 gBD Spritze, Franklin Lakes, NJ381703
Zentrifugenröhrchen 15 mLVWR, Radnor, PA89039-666
Zentrifugenröhrchen 50 mLCorning Cellgro, Manassas, VA430828
Bicinchonsäure (BCA)-Protein-AssayPierce, Thermo Fischer Scientific, Rockford, IL23235
Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper TSG101 AbCam, Cambridge, MAAB125011
Ratte Anti-Maus PE-CD63 AntikörperBiolegend, San Diego, CA143904
CD81
CD9
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener AntikörperCell Signaling Technology, Danvers, MA7074S
4x LDS
10x Reduktionsmittel (Bolt)
10x Lysepuffer (Bolt)Cell Signaling Technology, Danvers, MA
Bolt 4-12% Bis-Tris Plus Acrylamid GelInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MANW04120
iBlot 2 Nitrozellulose-Mini-StacksInvitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MAIB23002
Chemilumineszenz-HRP-Antikörpernachweisreagenz HyGLODenville Scientific, Holliston, MAE2400
Ultrazentrifugenröhrchen 17 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA337986
Ultrazentrifugenröhrchen 38,5 mLBeckman Coulter, Pasadena, CA326823
Corning SFCA Spritzenvorsatzfilter 0,2 &Mikro; m poreThermo Fisher Scientific, Waltham, MA09-754-13
Equipment
CentrifugeEppendorf, Hamburg,
Beckman Coulter, Pasadena,CA-Nanosight
(NS300)Malvern, Worcestershire,UK-ZurMessung der Partikelgrößenverteilung und Partikelkonzentration
MACSQuant Analyzer 10 DurchflusszytometerMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach,Deutschland-iBlot
Transfer ApparaturThermo Fischer Scientific, Waltham, MA-Bio-Rad
ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad, Hercules, CA
FlowJo v. 10Analysesoftware
Deutschland-Ultrazentrifuge

Referenzen

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