Summary
Formålet med denne algoritme er at løbende måle afstanden mellem to 2-dimensionelle kanter ved hjælp af seriel billede dilations og pathfinding. Denne algoritme kan anvendes til en lang række felter såsom hjerte strukturbiologi, vaskulære biologi og Civilingeniør.
Abstract
En nylig beskrevet ekstracellulære nanodomain, betegnes perinexus, har været impliceret i ephaptic kobling, som er en alternativ mekanisme for elektriske overledning mellem cardiomyocytes. Den nuværende metode til kvantificering af dette rum af manuel segmentering er langsom og har lav rumlige opløsning. Vi udviklede en algoritme, der bruger serielle billede dilations af en binær disposition til at tælle antallet af pixels mellem to modsatrettede 2 dimensionelle kanter. Denne algoritme kræver færre mandetimer og har en højere spatial opløsning end den manuelle metode samtidig bevare reproducerbarhed af den manuelle proces. Faktisk oplevede og novice efterforskere var i stand til at sammenfatte resultaterne af en tidligere undersøgelse med denne nye algoritme. Algoritmen er begrænset af menneskelige input, der kræves til manuelt skitsere perinexus og datakraft hovedsagelig belastet af en allerede eksisterende pathfinding algoritme. Algoritmen høj overførselshastighed kapaciteter, høj rumlige opløsning og reproducerbarhed gør det dog et alsidigt og robust måling værktøj til brug på tværs af en bred vifte af applikationer, der kræver måling af afstanden mellem enhver 2-dimensional (2D ) kanter.
Introduction
Følgende algoritme blev udviklet til at måle intermembrane afstanden mellem to strukturelt koblede cardiomyocytes på det punkt, de adskilt fra hinanden ved kanten af mindepladen gap junction i en nanodomain, kaldet den perinexus1, som har været impliceret i ephaptic kobling2,3,4,5. Ved at analysere hundredvis af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) billeder af perinexi ved hjælp af en manuel segmentering metode i en tidligere undersøgelse6, blev behovet identificeret for en højere overførselshastighed metode, der udtages perinexal bredde i højere rumlige opløsning samtidig bevare nøjagtigheden af den tidligere manuelle segmentering proces under manuel segmentering, linjer trækkes 15 nm mellemrum ca ortogonale i forhold til centerlinien, for at måle perinexal bredde. Den nye algoritme tager en én pixel tyk binære kontur af to parallelle linjer og bruger serielle billede dilations til at tælle antallet af pixels mellem to membraner. Mens billedet dilations er almindeligt brugt i et utal af image processing applikationer, bruger herunder kontur eller kant påvisning7,8, denne algoritme dilations som en optælling mekanisme. Centerlinien er så derefter isoleret ved hjælp af en pathfinding algoritme9 og perinexal bredde måles med en opløsning langs længden af perinexus lig med opløsning af billedet. Forskellen i opløsning i dette tilfælde er 1 måling pr. 15 nm for manuel segmentering og 1 måling pr. 0,34 nm med den nye algoritme, en 44-fold stigning i rumlige sampling hyppighed. Desuden, denne øgede samplingfrekvensen opnås i ca 1/5th den nødvendige tid til manuel segmentering.
Denne algoritme bruges i sin nuværende form til at måle perinexal bredde på de konventionelle 0-150 nm fra kanten af en gap junction plaque5 (GJ) samt inden for et bestemt område af interesse, hvor perinexus plateauer mellem 30 og 105 nm2 , 3 , 10. øget samplingfrekvensen reducerer variationen i individuelle perinexus målinger i forhold til manuel segmentering og betydeligt forkorter analyse tid, giver mulighed for effektiv behandling af store datamængder. Dog, dette program er ikke begrænset til nanoskala TEM billeder af cardiac indtrængere diske. Den samme tilgang kan bruges til at kvantificere vaskulære diameter, ventrikulær uddrivningsfraktion eller endog ikke-biologiske fænomener som floden erosion eller oversvømmelse. Denne algoritme er passende for kvantificering af afstanden mellem de to næsten parallelle kanter.
Protocol
Bemærk: Software kræves er ImageJ (eller lignende software, billede-redigering) og Matlab R2015. Brugeren kan støde på problemer med kompatibilitet med andre versioner af Matlab.
1. forbehandling billeder
- For enhver gråtonebillede, sikre den maksimale intensitet værdi af enhver given pixel er < 255. Dette gøres typisk ved at trække værdien 1 fra billedet i den brugerdefinerede Matlab program "ImageSub.m", medtages i supplerende fil S1.
2. skitserer Perinexus
- Skitsere perinexus i ImageJ eller andre billedbehandling software.
- Sikre, at dispositionen er én pixel tyk og er indstillet til den højeste værdi i intensiteten i et billede (255 i et gråtonebillede fra 0 til 255).
- Identificere GJ ved sin pentalaminar struktur11,12, og definere begyndelsen af perinexus som det punkt, hvor de to modsatrettede cellemembranen dobbeltlag afviger, som vist i figur 1A. Begynd ~ 200 nm fra kanten af GJ, spore langs den indre membran i den første celle og tilbage langs den indre membran i den anden celle. I ImageJ, frigive pen for at automatisk lukke dispositionen. Denne kunstige lukning vil blive beskåret senere.
Bemærk: Det er afgørende at skitsere perinexus med stor omhu ved så høj en forstørrelse som muligt, da selv små mis applikationer i dispositionen kan resultere i flere nanometer af fejl i den sidste måling.
3. opsætning af algoritme og vælge Perinexus af interesse
Bemærk: Pathfinding algoritme kræver autograf, kant, graf, Node og Pathfinding funktioner9 at være i samme mappe som MembraneSepDist m-fil. Alle filer kan findes i supplerende fil S1.
- Vælg Gem placering af data og tal. Disse er de i øjeblikket hard-kodet ind i m-filen.
Bemærk: Den første linje i programmet er en funktion til at klare alle variabler, Luk alle vinduer og klare kommandovinduet. Gem alle ønskede variabler eller tal før du kører filen m.
Bemærk: Software screenshots er inkluderet i supplerende fil S2 for alle hard-kodet værdier. - Kør programmet "MembraneSepDist.m".
- Indstille parametre.
Bemærk: En GUI vil affyre oppe hos standardparametre for gradient tærskel, skala, region af interesse, og manuel start. Standardværdierne kan ændres i filen m, eller de kan ændres for hver enkelt billede.- Sæt rumlige afledte gradient tærskel.
Bemærk: Højere værdier resulterer i flere punkter, der udvælges i midterlinjen isolation. Værdier, der er for høj eller for lav (uden for en række ca 3.0-7,9) kan resultere i computational ineffektivitet eller en upræcis udvælgelse af midterlinjen punkter giver upræcise midterlinjen isolation (Se figur 2A-C). - Angive skala i pixels/skalaenheder.
- Angiv de rumlige nedre og øvre grænser for det pågældende område.
Bemærk: Vores laboratorium konventionen, den definerede region af interesse er mellem 30 og 105 nm fra kanten af GJ2,3,10. - Indstille automatisk/manuel start. I fleste tilfælde registrerer algoritmen præcist udgangspunkt hvor gap junction ender og perinexus begynder. Dog i nogle tilfælde af uregelmæssigt formet perinexi, skal brugeren identificere startpunktet manuelt. Indstil denne værdi til 0 for automatisk, 1 for manual.
- Sæt rumlige afledte gradient tærskel.
- Vælg ønskede billede.
Bemærk: Vælg filmappe kan ændres i filen m. - Beskære billedet for at vælge perinexus af interesse.
- Når billedet kommer, ændres markøren automatisk til et trådkors. Beskære billedet ved at trække en boks omkring perinexus af interesse (Se figur 3). Beskæringsområdet kan justeres ved hjælp af kvadraterne på hjørnerne og siderne til at gøre den større eller mindre.
- Når beskæring, sikre den "åbne" ende af perinexus (længst væk fra GJ, se figur 3) er beskåret således at to membran konturer når kanten af det beskårne billede.
Bemærk: Det anbefales at gøre billedet fuld skærm til lettere se perinexus af interesse og beskære korrekt.
- Vælg den endelige beskæring ved at dobbeltklikke på med curser mellem modsatrettede kanterne skal måles.
Bemærk: Det er afgørende, at Dobbeltklik udføres inde i perinexus. Hvis programmet ikke kan identificere en midterlinjen, genstarte programmet og sørg for at klikke sker inden for perinexus. - Observere den endelige midterlinjen efter alle dilations og erosioner affyre oppe nemlig en slutbrugeren evaluering af programmets effektivitet.
Bemærk: En dialogboks vil vises på skærmen, mens programmet kører for at informere brugeren Matlab er ude af stand til at behandle eventuelle yderligere kommandoer, indtil programmet er færdig. Hvor længe denne proces tager, afhænger af Arraystørrelsen (billedet) og computer processorkraft. - Hvis manuel startpunktet er aktiveret, observere billedet af midterlinjen pop op over det oprindelige anatomiske billede, sammen med et kryds-hår markøren (Se figur 2E). Vælg et punkt uden for perinexus nær det ønskede startpunkt.
Bemærk: Programmet vil finde midterlinjen punkt tættest til den markerede pixel og bruge det som startpunktet. - Postdataene.
Bemærk: Når programmet er afsluttet, programmet vil returnere en tilknyttet midterlinjen, plot af perinexal bredde som funktion af afstanden fra kanten af GJ. Derudover programmet vil returnere den gennemsnitlige perinexal bredde op til 150 nm fra kanten af GJ samt gennemsnit fra inden for de definerede region af interesse fra Matlab-kommandolinjen. WPedersen værdier og afstande fra GJ gemmes i variablen "WpList" eller brugeren kan manuelt registrere dem særskilt.
4. algoritme fejlfinding
- Hvis centerlinien ikke er korrekt identificeret (fig. 2A), åbne figur "Gmag" og bruge indekset til at identificere en passende gradient tærskel (figur 2C).
- Hvis startpunktet ikke er korrekt identificeret, indstille startpunktet manuelt (se protokollen 3.8).
Representative Results
Statistiske metoder: Sammenligningerne blev foretaget mellem eksperimentelle grupper ved hjælp af Student's t-test. En p-værdi < 0,05 betragtes som væsentlig og alle værdier er repræsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse.
Manuel segmentering. Kvantificering af den GJ-tilstødende perinexus nanodomain bredde (Wp) opnås typisk ved manuel segmentering. Denne proces med manuel segmentering er vist i figur 1A og var tidligere beskrevet6. Observatøren identificerer kanten af GJ (figur 1, rød prik), måler 5nm langs midten af perinexus og måler afstanden mellem membraner på det tidspunkt. Processen gentages derefter på 10, 15, 30 og hver 15 nm op til 150 nm. Denne teknik, mens effektiv, har begrænsninger af tid og rumlige under prøvetagning langs længden af perinexus.
Betyde Wp målinger fra tidligere undersøgelser kan variere fra ca. 10 til 20 nm2,3,10, og 3 nm synes at være den gennemsnitlige forskel skulle påvise Statistisk signifikans, hvilket er langt over den rumlige Nyquist hyppighed på 0,7 nm pr måling baseret en interpixel løsning på 0,34 nm. Derfor, mens manuel segmentering er tidskrævende, metoden er tilstrækkelige til at måle forskelle i WPedersen tilknyttet en intervention eller sygdom stat.
Seriel billede Dilations. For at måle perinexus i en hurtigere og reproducerbar måde med passende rumlige opløsning, udviklede vi et program baseret på serie billede dilations tælle pixel mellem to manuelt spores membraner, der kan ses i figur 1B .
Den serielle dilatation proces er illustreret i figur 4. Som den binære billed er forstørrede (figur 4A-4D), at dilatation derefter omvendt og føjes til en fungerende billede - binære form af den oprindelige skitse (figur 4E-4 H). Processen gentages indtil dispositionen er helt udfyldt (figur 4D). På dette tidspunkt er det endelige arbejde billede (figur 4H) en optælling af antallet gange en særlig pixel forblevet un-forstørrede. Som sådan er værdier nær omridset af cellemembraner meget lav, mens værdier på center er højest. Ved at tælle antallet af dilations at fylde området ved hvert punkt, kan afstanden mellem membran kanter beregnes. Den næste udfordring er at identificere og isolere midterlinjen for at kvantificere perinexal bredde som funktion af afstanden fra GJ, hvilket gøres ved første anvendelse en rumlig afledning til det endelige arbejde billede (figur 2-sidste billede og figur 5 A). Et andet eksempel på en mere uregelmæssigt formede perinexus kan findes i supplerende fil S3.
Midterlinjen identifikation. Graduering af det endelige arbejde billede kan kvantificeres ved en rumlig derivat, som dilatation count værdier fra kant til kant ændre fra høj til lav til høj igen (figur 5A fra venstre til højre). Overvejer kun omfanget af den rumlige derivat (figur 5B) er disposition og midterlinjen, fremhævet med hvide pile, øjeblikkeligt identificerbare som områder af diskontinuitet. På disse steder ændres den gradient retning fra stigende til faldende eller vice versa. Anvender en tærskel (figur 5C) producerer et binært billede af midterlinjen og disposition, og fratrække den oprindelige skitse udbytter isolerede midterlinjen (fig. 5D). Mens denne metode til at isolere midterlinjen er beregningsmæssigt effektiv, skaber den tærskel, der anvendes til den rumlige afledte huller i den resulterende midterlinjen. Disse huller (figur 5D, indsætte) skal udfyldes, at give en nøjagtig måling af afstanden fra GJ og sikre perinexus måles i sin helhed. Først, midterlinjen er forstørrede for at udfylde eventuelle huller (figur 5E), efterfulgt af en erosion (figur 5F) og en "bwmorph" funktion (operation = 'netværk', n = inf) til at fjerne så mange point som muligt mens en kontinuerlig midterlinjen, hvorved den beregningsmæssige effektivitet af en efterfølgende pathfinding algoritme udviklet af Wasit Limprasert og tilgængelige på MATLAB Central9. Denne dilatation-erosion funktion producerer færdige midterlinjen, som er kombineret med det endelige arbejde billede (figur 5G). Men denne midterlinjen er ofte mere end én pixel tyk og er derfor ikke en præcis isolation af midterlinjen.
Wasit Limprasert pathfinding algoritme bruges til at bestemme perinexus midterlinjen. Pathfinding algoritme er i stand til at spore de højeste værdier - i dette tilfælde de værdier, der er tættest på det center, som forblev un-forstørrede gennem de mest gentagelser langs skibets midterlinie (figur 5G, Indsæt). Resultatet er en automatisk sporing af midterlinjen, som vist i figur 6. Ved at isolere midterlinjen, kan perinexal bredde præsenteres som funktion af afstanden fra slutningen af GJ, som vist i figur 6B (top), eller som den gennemsnitlige bredde af et bestemt område af interesse.
Kerne analyse. Det er vigtigt at bemærke, at digitaliserede billeder er baseret på firkantede matrixer og dilatation kerner er ligeledes baseret på firkantede matrixer. Det betyder at dilatation afstand på tværs af en diagonal er større end retvinklede. Derfor søgte vi næste at afgøre om kernen påvirket resultaterne af algoritmen. For at kvantificere kerne-specifikke variabilitet, fem forskellige kerne figurer blev analyseret: "Plus" (den figur, der bruges i de ovenstående analyser), "X", "kasse", og "linje", som beskrevet i figur 7A. Kernen er anvendt på hver enkelt nul point i et binært billede. Stjerne i hver kerne af fig. 7A repræsenterer center, hvor hvide er en værdi på 1, og sort er en værdi på 0 for dilatation kerne.
Hver kerne indflydelse på gennemsnitlig Wp måling af en enkelt ca vandrette perinexal billede (fig. 7B, top), kvantificeres ved en erfaren bruger, blev fastsat ved at rotere billedet med Matlab's "imrotate" kommando og Computing WPedersen i trin på 10 °. WPedersen målingsværdier (fig. 7B, nederst) svinger med billedretningen i en rektificeret sinusformet mode med et Plus formet kerne. De laveste værdier forekomme når en relativt lige perinexus er orienteret vertikalt eller horisontalt. Hverken X, bokseller linje kerner fastsat nogen fordel i forhold til de plus-formet kerne. X og Box kerner produceret identiske resultater, men værdierne af mener WPedersen var ude af fase med the Plus kerne af 45 °. Line kerne ikke fuldt spile billede i visse vinkler, som kan ses ved fravær af data i det grønne spor for billeder roteret mindre end 30 eller mere end 145 °. Således, den ortogonale Plus dilatation kerne overvurderet membran adskillelse, når dilatere en perinexus med en akse orienterede diagonalt for eksempel på ca 45 °, og X og Box kerner undervurderet betyder Wp da den lange akse af perinexus var også på 45°. Baseret på denne analyse, udviklede vi en korrektionsfaktor, der er anvendt på de værdier, der er genereret fra dilatere kerneversion plus-formet. For at tage højde for overvurdering af membran adskillelse tilknyttet billedretningen, denne korrektionsfaktor, ganget med den målte breddeværdi afhængig af orientering af billede (ligning 1).
Hvis θ < 45°
WPedersen korrigeret = cosd(θ) * Wp målt
Hvis θ ≥45 °
WPedersen korrigeret = cosd(θ) * Wp målt (ligning 1)
I denne ligning er Wp målt den oprindelige Wp værdi genereret af ovenstående algoritme og θ er den beregnede vinkel fra vandret i grader. Θ er beregnet ved at tage den inverse tangens til den samlede ændring i den vandrette retning divideret med den samlede ændring i den lodrette retning af perinexal midterlinjen. Den ovenstående korrektion tilnærmer de gennemsnitlige vinkel i forhold til vandret, af perinexus (figur 8A, venstre-toppen) og resulterer i en måling, som om fremstillet af en vandret perinexus (figur 8A, venstre-bund). Rationalet bag denne ligning kommer fra det faktum, at de plus-formet kerne (figur 7A) er det væsentlige to line-formet kerner arrangeret retvinklet til hinanden. Som sådan, under 45° (tættere på vandret), dilations opstår vertikalt og derfor multiplikation af cosinus til vinklen giver den rigtige måling. Omvendt, for vinkler over 45° (tættere på lodret), dilations forekomme vandret og sinus bruges til at bestemme den korrekte måling. Netop 45° er sinus og cosinus ens. Supplerende fil S4 giver en skildring af dette begreb. Bemærk at denne korrektion er baseret på den gennemsnitlige vinkel og forsigtighed bør anvendes, når du analyserer væsentlig ikke-lineær figurer. Denne proces blev gentaget på 20 tilfældigt udvalgte perinexi og de korrigerede målinger korreleret kraftigt med målinger opnået ved manuelt rotere og re analysere billeder (fig. 8A, højre). For at bekræfte den nøjagtige korrektion for billedretningen, var to sæt af phantom kanter genereret (figur 8B, venstre) og drejes 180 °. Med de trigonometriske korrektion returneres algoritmen præcist den korrekte værdi på hver orientering, uanset rumlige opløsning eller billedstørrelse (figur 8B, højre).
Analytiske anvendelse og reproducerbarhed med orientering korrektion. Minde om, at tidligere undersøgelser ved hjælp af manuel segmentering rapport statistisk signifikant betyde Wp forskelle større end eller lig med 3 nm, det var vigtigt at afgøre, om at algoritmen kunne bruges til at sammenfatte tidligere resultater ved hjælp af en komplet datasæt. Ved hjælp af den nye algoritme, to observatører - erfarne og uerfarne med perinexal analyse (NB. 1 og NB. 2, henholdsvis)-analyseret de samme billeder fra en tidligere undersøgelse6 , der omfattede 12 patienter, der blev diagnosticeret med atrieflimren atrieflimren (AF) før væv samling og 29 patienter, der ikke har allerede eksisterende AF (No-AF). Den erfarne bruger fandt, at Wp var væsentligt bredere hos patienter med AF end uden AF (21.9±2.5 og 18.4±2.0 nm, henholdsvis figur 9A). Disse værdier med den korrektionsfaktor, der er anvendt er lighed med de rapporterede tidligere (24.4±2.2 nm og 20.7±2.4 nm, henholdsvis)6. Vigtigere, den uerfarne bruger findes den samme signifikant forskel (22.1±2.8 nm og 20.1±2.6 nm, henholdsvis) mellem sygdomstilstande med automatiseret program. Derudover ændre standardafvigelsen af Wp værdier ikke med den korrektionsfaktor, der angiver standardafvigelsen af 2-3 nm ikke er en artefakt af algoritmen, men strukturen selv og væv behandling. Disse resultater viser, at den foreslåede automatiserede metode er habil i recapitulating resultaterne af tidligere undersøgelser.
Vigtigere er, perinexus er en nyligt defineret struktur og ingen enighed er opnået enighed om rækken af absolutte værdier af membran adskillelse støder op til GJ2,3. Da ydre membran-til-ydre-membran GJ bredde er tidligere anslået til 20 nm13, søgte vi at bestemme den algoritme effektivitet ved at også måle GJ bredde. Begge observatører fandt ingen signifikant forskel mellem gap junction bredder (GJW) af patienter med eller uden eksisterende AF (fig. 9B). Absolut GJW værdier for AF og ikke-AF patienter blev 20,5 ± 2,5 nm og 20,3 ± 1.9 nm, henholdsvis, for den erfarne observatør og 21.0 ± 3.1 nm og 20,0 ± 2.2 nm for den uerfarne iagttager, svarende til hvad er blevet rapporteret tidligere.
For at afgøre, om den automatiske algoritme der kræves mindre tid til at analysere data end manuel segmentering, registreres både erfarne og uerfarne bruger tiden behov for at kvantificere en 10-image uddannelse sæt (supplerende fil S5). Tabel 1 viser, at den erfarne og uerfarne bruger faldt analyse tid af 4.7 - og 8.3 - gange henholdsvis ved hjælp af den automatiske algoritme i forhold til manuel segmentering tilgang, med en ca 43-fold stigning i rumlige opløsningen langs perinexus.
Fejlfinding af algoritme. De mest almindelige fejl når du kører algoritmen, der opstår, når den endelige midterlinjen ikke ender på kanten af billedet. I sådanne tilfælde blev ikke nok punkter udvalgt fra den rumlige afledte kort, forårsager program til at mislykkes og producere en fejl besked rådgive brugeren at vælge en større beskæringsområdet eller øge den rumlige afledte tærskel. Tegning en større beskæringsfeltet vil forbedre pålideligheden af programmet i nogle tilfælde som de rumlige afledte ændringer drastisk nær kanten af den figur, der kan forstyrre pathfinding eller edge detection algoritmerne.
Det er også muligt for pathfinding algoritme til at undlade at identificere midterlinjen, selvom midterlinjen når kanten af billedet, især hvis den gradient tærskel er for lav (fig. 2A). Hvis tærsklen gradient er indstillet for højt, vil der være flere unødvendige punkter indarbejdes i pathfinding algoritme (figur 2B), faldende beregningsmæssige effektivitet. Hvis brugeren ikke er i stand til at bestemme en passende tærskel, billede array "GMag" (figur 2C), som er genereret af programmet og kan findes i arbejdsområdet, kan hjælpe brugeren bestemme tærsklen. Finde punkter langs midterlinjen og indstille tærskel lidt over deres indeksværdi for disse punkter er markeret. I det givne eksempel, vil en passende tærskel være over ~5.1 (figur 2C, Indsæt).
Startpunktet kan også undlade at begyndelsen af perinexus (figur 2D). I dette tilfælde, igen køre programmet og indstille værdien Manuel Start til 1. Når midterlinjen er blevet isoleret, brugeren vælger et punkt uden for perinexus og midterlinjen punkt tættest på den markerede pixel (figur 2E, rød firkant) angives som startpunktet. Resultatet er den fulde midterlinjen (figur 2F).
Figur 1 : TEM billeder med kvantificering processer. Manuel segmentering proces (A) kræver, at brugeren kan udføre 12 intermembrane enkeltmålinger mens estimering midterlinjen. Den automatiske proces (B) kræver en manuel, fortløbende spor af omridset af perinexus. Den røde prik i hvert billede repræsenterer bruger-identificerede årets GJ og begyndelsen af perinexus. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Midterlinjen fejlfinding. To primære former for fiasko for midterlinjen identifikation og deres løsninger: hvert billede er mærket med navnet array i Matlab. Hvis den gradient tærskel er alt for lav (A, tærskel 0,2) midterlinjen algoritme kan mislykkes. Indstilling af tærsklen for højt (B, tærskel 70) kan reducere den beregningsmæssige effektivitet af pathfinding algoritme. En passende gradient tærskel kan fastlægges fra matrixen GMag (C, Indsæt). Hvis midterlinjen undlader at nå begyndelsen kanten af perinexus (D), kan brugeren vælge manuelt vælge startpunktet. Efter den "Start pege" indstilling er indstillet til 1 i åbningen GUI, brugeren vælger derefter et punkt uden for perinexus af interesse (E). Slutresultatet bør være en midterlinjen, der præcist skildrer i sin helhed af perinexus (F). Alle etiketter i citater (A-F) svarer til de variable navne i Matlab. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Valg af Perinexus. At beskære perinexus, klik og hold at trække en boks rundt om det (beskæringsværktøjet markeres automatisk) som det fremgår af den blå pil. Denne boks kan justeres ved hjælp af firkanter på siderne og hjørnerne til at gøre den større eller mindre. Den grønne pil repræsenterer enden af perinexus, som brugeren skal sikre fortsat er "åben". Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Seriel billede dilations. Binære dispositionen er gentagne gange dilaterede én pixel ad gangen (A-D) og føjet til arbejde billede (ikke-binær form af billede, E-H) efter hver dilatation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: midterlinjen isolation og pathfinding. En rumlig derivat beregnes ud fra det endelige arbejde billede (A) og omfanget af den rumlige derivat (B) der bruges til at isolere disposition og midterlinjen (hvide pile). En bruger-defineret tærskel identificerer dispositionen og midterlinjen og fratrække den oprindelige skitse udbytter midterlinjen (D). Huller vises dog i midterlinjen af tærsklen (D - Indsæt). For at producere en kontinuerlig midterlinjen, udføres en sekundær dilatation på isolerede midterlinjen (E), efterfulgt af en sekundær erosion at øge den beregningsmæssige effektivitet af en efterfølgende pathfinding algoritme. Denne eroderede billede (F) kombineres derefter med den endelige arbejde billede, giver mulighed for identifikation af en kontinuerlig, one-pixel-tykke midterlinjen (G - Indsæt). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Sidste datapræsentationen. Programmet udgange den endelige disposition oven på det oprindelige TEM billede (A). Linjen er farvekodet grøn for 0-150 nm, blå for bruger-definerede region af interesse og rød for området ud over 150 nm. Derudover udsender programmet en tilsvarende farvekodede diagram, der repræsenterer Wp som funktion af afstanden fra starten af perinexus og for regionen af interesse (B), samt den gennemsnitlige WPedersen (indsatser i respektive graf). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Dilatation kerne figur analyse. Figurer til dilatation kerner (A): stjerne i midten repræsenterer de forstørrede pixels. Hvide kasser er pixel påvirket af dilatation, i form af et plus, X, boks eller linje. En cirka vandret perinexus (B, top, med en rød linje, der angiver 0°) var roteres med uret fra 0 til 180° i trin på 10° og gentagne gange forstørrede ved hjælp af forskellige kerne figurer (B, nederst). Plus - og line-formet kerner producere lignende resultater, selvom den linje kerne mislykkes på visse retningslinjer, mens boks - og X-formede kerner er ude af fase af 45 °. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Billede orientering korrektion. Til korrekt for orientering af billedet, den gennemsnitlige vinkel af perinexus er beregnet ud fra holdninger af start - og slutbruger - points (A, venstre, begyndelsen og slutningen af sort linje). Den inverse tangens af ændringen i y-retning (en, venstre, grøn linje) divideret med ændringen i x-retning (en, venstre, rød linje) udbytter korrektion vinkel, θ (en, venstre, gul). Målet er at så rette den gennemsnitlige Wp -værdi for at give den mindste afstand mellem kanterne, som om perinexus havde været afbildet omtrent vandret (en, venstre nedenfor). Anvendelsen af korrektionsfaktoren beskrives ved ligningen 1 blev sammenlignet med manuelt roterende hver af 15 tilfældigt udvalgte billeder af den beregnede θ før analyse. De korrigerede værdier stærkt korreleret med roteret billede værdier (R2 = 0.991, A, højre), der angiver ligning 1 er en gyldig korrektionsfaktor for billede orientering. For at bekræfte korrektionsfaktoren er passende, var to phantoms genereret af perfekt-parallel kanter med en kendt distance mellem dem (B, venstre). Phantom 1 og Phantom 2 har rumlige resolutioner af 2.833 pixels / mm. og 71.6 pixels/i., henholdsvis. Som det fremgår af de blå diamanter og røde firkanter i B, højre, beregner algoritmen, der nøjagtigt deres bredder på tværs af 180 grader af billedrotation. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : Algoritme reproducerbarhed. Ved hjælp af den automatiske proces med billedkorrektion orientering, både erfarne og uerfarne observatør fundet signifikante forskelle mellem AF og No-AF grupper (A), i overensstemmelse med en tidligere undersøgelse afsløre en mindste forskel på 2,6 nm. Derudover hverken observatør fandt en signifikant forskel i GJW (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Manual | Automatisk | |
| Tid - NB. 1 (s) | 205±11 | 44±14 |
| Tid - NB. 2 (s) | 248±18 | 30±5 |
| Rumlig opløsning (målinger/nm) | 0,08 | 3,45 |
Tabel 1: sammenligning af manuelle og automatiske processer. Begge observatører kræves mindre tid pr billede at spore disposition end for at udføre manuel segmentering proces for en 10-image uddannelse sæt. Derudover den automatiske proces har en højere samplingfrekvens, optagelse 3,45 målinger pr. nm, sammenlignet med et gennemsnit på 1 måling hver 12,5 nm for den manuelle proces. Uddannelse sæt billeder kan findes i supplerende fil S5, sammen med konturer og målinger, som udføres af en erfaren bruger.
Discussion
Algoritmen bruger serielle billede dilations til at tælle antallet af pixels mellem to modsatrettede 2D kanter i et binært billede, som i dette tilfælde er indbyrdes membran magtens perinexus2,3,14. En rumlig derivat og en pathfinding algoritme bruges derefter til at isolere midterlinjen, efterfulgt af en sekundær dilatation og erosion sekvens til at udfylde hullerne i midterlinjen, svarende til hvad der er sket inden15. Midterlinjen kombineres derefter med den endelige dilatation-count billede til at repræsentere perinexal bredde som funktion af afstanden fra begyndelsen af kant adskillelse, i dette tilfælde i slutningen af GJ og begyndelsen af perinexus16.
Fire primære parametre er brugeren, der er defineret i en GUI i starten af programmet:
- Gradient tærskel
- Skala
- Region af interesse vifte
- Start punkt udvælgelsesmetode (automatisk eller manuel)
Den mest almindelige mekanisme for fiasko for algoritmen er svigt af midterlinjen at nå frem til kanten af det billede, som er hvordan slutpunktet bestemmes den pathfinding algoritme. For at lave sådan et problem, kan brugeren øge gradient tærsklen beskrevet i trin 3.3.1, som vil forårsage program til at vælge flere point ud af de rumlige afledte billede, hvilket vil øge beregningen tid kræves af pathfinding algoritme. Derfor, denne algoritme kræver et kompromis mellem beregning hastighed og midterlinjen integritet. Det er vigtigt at bemærke, at så længe alle punkter på centerlinien er identificeret fra den rumlige derivat, sammen med en passende startpunktet, den rumlige afledte tærskel vil have nogen effekt på kanten adskillelse måling.
Billede orientering synes at påvirke dilatation værdier, fordi kernen dilaterer i 90 graders trin, som kan indføre en fejl, hvis størstedelen af det pågældende område er i en vinkel 45° til akserne i dilatation matricer. Derfor dilatation tæller muligvis ikke en nøjagtig fremstilling af rum mellem kanterne. Denne begrænsning er blevet behandlet af en trigonometrisk korrektionsfaktor, men kunne potentielt blive ignoreret, hvis alle billeder i et datasæt er justeret på den samme retning. Desuden bør forsigtighed anvendes ved fortolkningen af resultaterne, som det er muligt, at afsnit planer ikke er helt vinkelret på de to membraner. I figur 9Bbruger vi GJW til at foreslå, at vores perinexus billeder var i flyet. Stadig, det er bydende nødvendigt, at stikprøvestørrelser vaere tilstraekkeligt store til konto for unøjagtigheder skæring mellem billeder. Vores perinexal bredde målinger bør derudover ikke fortolkes for at afspejle, i vivo rum, men denne fremgangsmåde bruges til at måle betyde forskelle i perinexal bredde i forhold til nogle indgreb eller sygdom stat.
Den nuværende algoritme kræver også en manuelt spore omridset af kanterne som input. Det er vigtigt at bemærke, at så længe skalaen er indstillet korrekt, rumlige opløsning har ingen effekt på den algoritme målinger, som det fremgår af de forskellige resolutioner af billeder i figur 6 og en ekstra lav opløsning billede i supplerende filen S6. Det næste skridt for at forbedre algoritmen er at fjerne menneskelig indgriben fra skitse generation sammen med et værktøj, der kan vælge området af interesse. Disse funktioner vil sandsynligvis forbedre præcisionen af målingen og reducere bruger bias.
Denne beregningsmæssigt effektiv algoritme giver en hurtigere metode, der kræver cirka en femtedel af mandetimer, af kvantificere perinexus med ingen påviselige straf at reproducerbarhed sammenlignet med den manuelle segmentering proces. Derudover udnytter manuel segmentering proces en måling hver 15 nanometer til at kvantificere perinexal bredde, hvilket kan føre til under prøvetagning som membran adskillelsen af perinexus kan ændre væsentligt inden for at 15 nm rækkevidde. Derimod har den automatiseret program en rumlig opløsning lig med imaging modalitet, i dette tilfælde 2,9 pixel pr. nanometer langs længden af perinexus, derfor levere et mere fint løst gennemsnit af perinexal bredde.
Mens anvendelsesmuligheder inden for hjerte strukturel biologi er lovende og spændende, er denne algoritme anvendelser ikke begrænset til TEM billeder. Ethvert felt, som kræver en præcis, høj opløsning måling af to næsten parallelle 2D kanter kan gøre brug af denne algoritme. Algoritmen, der kan bruges til at spore noget fra riverbank erosion og oversvømmelse mønstre fra satellitbilleder til vaskulær udvikling med brightfield eller fluorescerende mikroskopi. En af de mest lovende potentielle anvendelser er inden for kardiologi og måle ventrikulær uddrivningsfraktion (UDDRIVNINGSFRAKTION) med punkt af pleje hjerte ekkokardiografi. I øjeblikket, er den standard teknik metoden biplan diske17, om en nyere algoritme, AutoEF, er i øjeblikket forkant EF-kvantificering metode18,19. Biplan metode til diske, det pågældende kammer med røbestof manuelt og kvantificeres ved hjælp af en modificeret Simpson metode, hvorved samlede volumen beregnes automatisk ved summation af stablede elliptisk diske. Den største begrænsning med denne metode er, at det kun kan returnere de samlede tværsnitsareal af den ønskede afdeling, med ingen beslutning at identificere specifikke områder af interesse, og også kræver betydelige menneskelige input og ekspertise. Den nyere metode, AutoEF, identificerer og beskriver kanten af ventrikel ved hjælp af en 2D speckling algoritme og derefter beregner ventrikulær tværsnitsareal. Denne proces, har mens præcis og effektiv til at måle ventrikulær bruttoareal, også en lignende iboende begrænsning af kun måle samlet tværsnitsareal. Denne primære ulempe begrænser klinikere diagnostisk og behandling evner. Derimod den algoritme, der præsenteres i dette håndskrift kan identificere en midterlinjen og har en opløsning, der er lig med opløsning af imaging modalitet at udpege specifikke områder af interesse. Dette er vigtigt fordi ultralyd scannere med mikrometer rumlige opløsning er kommercielt tilgængelige20,21, hvilket indebærer, at denne algoritme kunne afsløre lokaliseret væg bevægelse abnormaliteter på løsningen af mikrometer i stedet for centimeter. Mens denne anvendelse skal valideres eksperimentelt, er det en af de mest umiddelbart lovende anvendelser af denne algoritme. Faktisk, det kan nemt kombineres med speckle sporing kapaciteter af AutoEF eller de manuelle spor udnyttet i manuel planimetry med højere opløsning oplysninger parallelt med konventionelle EF data.
Så alsidig og gældende som den nuværende algoritme er, blev det udviklet til 2D-billeder. Men som billeddannelsesteknologier fortsætter med at forbedre, der er en stigende efterspørgsel efter 3 og 4 D kvantificering teknologier. Den næste iteration af algoritmen er derfor at tilpasse den samme fremgangsmåde, seriefremstillede dilatere et binært billede til et 3-dimensionelt objekt, hvor automatisk definere en midterlinjen er i øjeblikket overgår nuværende billeddiagnostiske programmer-funktionerne. Sådan en algoritme ville har bredt programmer både klinisk og eksperimentelt i feltet hjerte alene, herunder 3D hjerte ekkokardiogrammer22,23, 3D elektronmikroskopi24,25, 26og 3D magnetisk resonans imaging27,28,29.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Kathy Lowe på Virginia-Maryland kollegium i Veterinary medicin til forarbejdning og farvning TEM prøver.
Finansiering:
Nationale kontorer i sundhed R01-HL102298
Nationale kontorer i sundhed F31-HL140873-01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Touchscreen Monitor | Dell | S2240T | Needs soft-tipped stylus |
| Desktop | Dell | Precision T1650 | 8GB RAM |
| Operating System | Microsoft | Windows 7 Enterprise | 64-bit OS |
| Program platform | Mathworks | Matlab R2015b | Program may be incompatible with newer/older versions of Matlab |
References
- Rhett, J. M., Gourdie, R. G. The perinexus: a new feature of Cx43 gap junction organization. Heart Rhythm. 9 (4), 619-623 (2012).
- Veeraraghavan, R., et al. Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).
- George, S. A., et al. Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).
- Veeraraghavan, R., et al. Potassium channels in the Cx43 gap junction perinexus modulate ephaptic coupling: an experimental and modeling study. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2016).
- Rhett, J. M., et al. Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).
- Raisch, T. B., et al. Intercalated Disc Extracellular Nanodomain Expansion in Patients with Atrial Fibrillation. Frontiers in Physiology. , (2018).
- Yan, J., et al. Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections. PLoS One. 9 (8), 104357 (2014).
- Papari, G., Petkov, N. Adaptive pseudo dilation for gestalt edge grouping and contour detection. IEEE Transactions on Image Processing. 17 (10), 1950-1962 (2008).
- Limprasert, W. PathFinding. , Available from: www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34966-pathfinding (2012).
- George, S. A., et al. Extracellular sodium and potassium levels modulate cardiac conduction in mice heterozygous null for the Connexin43 gene. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).
- Revel, J. P., Karnovsky, M. J. Hexagonal array of subunits in intercellular junctions of the mouse heart and liver. Journal of Cell Biology. 33 (3), 7-12 (1967).
- Huttner, I., Boutet, M., More, R. H.
- Makowski, L., et al. Gap junction structures. II. Analysis of the x-ray diffraction data. Journal of Cell Biology. 74 (2), 629-645 (1977).
- Entz, M., et al. Heart Rate and Extracellular Sodium and Potassium Modulation of Gap Junction Mediated Conduction in Guinea Pigs. Frontiers in Physiology. 7, 16 (2016).
- Sild, M., Chatelain, R. P., Ruthazer, E. S. Improved method for the quantification of motility in glia and other morphologically complex cells. Neural Plasticity. 2013, 853727 (2013).
- Rhett, J. M., et al. The perinexus: Sign-post on the path to a new model of cardiac conduction. Trends in Cardiovascular Medicine. , (2013).
- Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Journal of the American Society of Echocardiography. 28 (1), 1-39 (2015).
- Kawai, J., et al. Left ventricular volume and ejection fraction by the axius auto ejection fraction method: comparison with manual trace method and visual assessment of ejection fraction. Journal of Cardiology. 49 (3), 125-134 (2007).
- Frederiksen, C. A., et al. Clinical utility of semi-automated estimation of ejection fraction at the point-of-care. Heart, Lung and Vessels. 7 (3), 208-216 (2015).
- Foster, F. S., et al. A new ultrasound instrument for in vivo microimaging of mice. Ultrasound in Medicine and Biology. 28 (9), 1165-1172 (2002).
- Moran, C. M., et al. A comparison of the imaging performance of high resolution ultrasound scanners for preclinical imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (3), 493-501 (2011).
- Papademetris, X., et al. Estimation of 3D left ventricular deformation from echocardiography. Medical Image Analysis. 5 (1), 17-28 (2001).
- Hosny, A., et al. Unlocking vendor-specific tags: Three-dimensional printing of echocardiographic data sets. Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 155 (1), 143-145 (2018).
- Cretoiu, D., et al. Human cardiac telocytes: 3D imaging by FIB-SEM tomography. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2157-2164 (2014).
- Risi, C., et al. Ca(2+)-induced movement of tropomyosin on native cardiac thin filaments revealed by cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6782-6787 (2017).
- Dhindwal, S., et al. A cryo-EM-based model of phosphorylation- and FKBP12.6-mediated allosterism of the cardiac ryanodine receptor. Science Signaling. 10 (480), (2017).
- Reddy, V. Y., et al. Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).
- van Heeswijk, R. B., et al. Three-Dimensional Self-Navigated T2 Mapping for the Detection of Acute Cellular Rejection After Orthotopic Heart Transplantation. Transplant Direct. 3 (4), 149 (2017).
- Valinoti, M., et al. 3D patient-specific models for left atrium characterization to support ablation in atrial fibrillation patients. Magnetic Resonance Imaging. 45, 51-57 (2018).
