Methodenartikel

Cell Cycle Analysis in C. Elegans Keimbahn mit Thymidin-Analog-EdU

DOI:

10.3791/58339

⸱

22. Oktober 2018

 ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri, 2Department of Genetics, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eine Imaging-basierte Methode beschrieben, die kann verwendet werden, um S-Phase zu identifizieren und analysieren Zellzyklus Dynamik in C. Elegans Hermaphrodit Keimbahn mit dem Thymidin analoge EdU. Diese Methode erfordert keine transgene und ist kompatibel mit immunofluorescent Beflecken.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zellzyklus-Analyse in den Eukaryotes nutzt häufig Chromosom Morphologie, Ausdruck und/oder Lokalisierung von Gen-Produkte für die verschiedenen Phasen des Zellzyklus oder die Einbeziehung von Nukleosid-Analoga. S-Phase enthalten DNA-Polymerasen Thymidin-Analoga wie EdU oder BrdU in chromosomaler DNA, markieren die Zellen für die Analyse. Für C. Elegansder Nukleosid analoge EdU an die Würmer verfüttert wird, während der regulären Kultur und ist kompatibel mit immunofluorescent Techniken. Die Keimbahn von C. Elegans ist ein leistungsfähiges Modell-System für das Studium der Signalisierung Bahnen, Stammzellen, Meiose und Zellzyklus, denn es transparent, genetisch facile ist und meiotischen Prophase und zelluläre Differenzierung/Gametogenese in auftreten einem lineare Montage-wie Mode. Diese Eigenschaften machen EdU ein großartiges Werkzeug, um dynamische Aspekte der mitotically Radsport Zellen und Keimbahn Entwicklung zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie erfolgreich vorbereiten EdU Bakterien, füttern zu Wildtyp C. Elegans Hermaphroditen, Zwitter Gonade sezieren, für EdU Gesellschaftsgründung in DNA, Fleck Fleck mit Antikörpern gegen verschiedene Zellzyklus zu erkennen und Entwicklungs-Marker image die Gonade und analysieren Sie die Ergebnisse. Das Protokoll beschreibt die Unterschiede in der Methode und Analyse für die Messung der S-Phase Index, M-Phase Index G2 Dauer, Dauer des Zellzyklus, Rate der meiotischen Eintrag und meiotischen Prophase Fortschreiten. Diese Methode kann angepasst werden, um den Zellzyklus oder Zelle Geschichte in anderen Geweben, Stadien, genetische Hintergründe und physiologischen Bedingungen zu studieren.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In der tierischen Entwicklung müssen Hunderte, Tausende, Millionen, Milliarden oder gar Billionen von Zellteilungen erwachsenen Organismus bilden. Zellzyklus, die Menge der zelluläre Ereignisse bestehend aus G1 (Gap), S (Synthese), G2 (Gap), und M (Mitose) definieren die Reihe von Veranstaltungen, die Ausführung jeder Zellteilung. Der Zellzyklus ist dynamisch und in Echtzeit, was technisch schwierig sein kann, am besten geschätzt. In diesem Protokoll vorgestellten Techniken erlauben es, die Messungen der Phasen und Timing des Zellzyklus von Standbildern zu machen.

Etikettierung mit Nukleosid-Analoga z. B. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine (EdU) oder 5-Bromo-2'-Deoxyuridine (BrdU) ist der Goldstandard, S-Phase in den Studien des Zellzyklus Dynamik in den Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) Erwachsenen zu identifizieren zwittrige Keimbahn1,2,3,4,5. EdU und BrdU kann in nahezu jedem genetischen Hintergrund verwendet werden, da sie nicht auf irgendwelche genetischen Konstrukt angewiesen sind. Visualisierung von BrdU erfordert harte chemische Behandlung aussetzen Antigen für Anti-BrdU Antikörper Färbung, oft mit der Beurteilung der anderen zellulären Marker visualisiert, indem gemeinsam mit zusätzlichen Antikörper Färbung nicht kompatibel ist. Im Gegensatz dazu visualisieren EdU erfolgt durch Click-Chemie unter milden Bedingungen und ist somit kompatibel mit Antikörper Co Färbung6,7.

Die Besonderheit des Labels ist klar, da Kerne nur die Thymidin (5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine) Entsprechungen in DNA während der S-Phase zu integrieren. Visualisierung erfolgt im festen Gewebe. Das EdU Etikett unsichtbar selbst bis eine azid-haltigen Farbstoff oder Fluorophor reagiert kovalent mit Alkinen in EdU durch Kupfer-katalysierte Klick-Chemie-8. EdU Kennzeichnung kann sofortige Auskunft auf die Kerne in S-Phase, einen kurzen Impuls sind der Beschriftung verwenden. EdU kann auch dynamische Informationen bereitstellen, mit Puls-Jagd oder fortlaufende Kennzeichnung; zum Beispiel in einem Puls-Chase-Experiment, das Label wird bei jeder Zellteilung verdünnt oder als nondividing Zellen Fortschritt durch Entwicklung weitergegeben.

C. Elegans Hermaphrodite Keimbahn ist ein leistungsfähiges Modell-System für das Studium der Signalisierung Bahnen, Stammzellen, Meiose und Zellzyklus. Die Erwachsenen Keimbahn ist eine polarisierte Montagelinie mit Stammzellen gefunden am distalen Ende gefolgt von ein- und Progression durch meiotische Prophase, koordiniert mit den Phasen der Gametogenese mehr proximal (Abbildung 1). Am proximalen Ende Eizellen Reifen, sind Eisprung befruchtet und beginnen Embryogenese in der Gebärmutter9,10,11. Die Zelle ~ 20 Durchmesser lange Region nahe der distalen Spitze-Zelle, die mitotically Radsport Germline Stem, Vorläuferzellen und meiotischen Zellen der S-Phase aber nicht auf die Zellen in meiotischen Prophase enthält, nennt man den Stammvater Zone2,4 , 9 , 12. die Zellmembranen bieten unvollständige Trennung zwischen den Kernen in den distalen Keimbahn, aber Zone Vorläuferzellen unterziehen mitotische Zelle Radfahren weitgehend selbstständig. Die mediane mitotische Zelle Zyklusdauer der Keimbahn Zone Vorläuferzellen in jungen Erwachsenen Hermaphroditen ist ~6.5 h; G1-Phase ist kurz oder abwesend, und Ruhe ist nicht eingehalten,1,2,13. Keimbahn Stammzell-Differenzierung erfolgt durch im wesentlichen direkten Differenzierung und somit fehlt Transit-Verstärkung Divisionen4. Während der Differenzierung in der Pachytene Phase etwa 4 von 5 Kerne werden keine Eizellen bilden aber stattdessen Apoptose, als Krankenschwester Zellen durch eine Spende den zytoplasmatischen Inhalt in den Entwicklungsländern Eizelle12,14 , 15.

Neben der Kennzeichnung Zellen in der S-Phase mit Nukleosid-Analoga kann man die Zellen in Mitose und Meiose mit Antikörper Färbung identifizieren. Kerne in Mitose sind immunreaktiven zu Anti-Phospho-Histon H3 (Ser10) Antikörper (so genannte pH3)7,16. Kerne in Meiose sind immunreaktiven Anti-ihn-3 Antikörper (ein meiotische Chromosomen Achse Protein)17. Kerne in der Stammvater Zone können durch das Fehlen von HIM-3, das Vorhandensein von nucleoplasmic REC-818oder das Vorhandensein von WAPL-119identifiziert werden. WAPL-1 Intensität ist in der somatischen Gonade, hoch in der Stammvater Zone am höchsten und niedrigen während frühen meiotischen Prophases19. Mehreren Zellzyklus Messung ist möglich mit ein paar Variationen im Protokoll: ich) Kerne in S-Phase zu identifizieren und Messen S-Phase Index; (II) ermitteln Sie Kerne M-Phase und Messen Sie den M-Phase-Index zu; (III) bestimmen Sie, ob Kerne in mitotischen oder meiotische S-Phase wurden; (IV) messen Sie die Dauer der G2; (V) messen Sie die Duartion G2 + M + G1 Phasen; (VI) messen Sie die Geschwindigkeit der meiotischen Eintrag; (VII) die Rate der meiotic Progression zu schätzen.

Man kann mehrere Zellzyklus-Messungen von nur ein paar Arten von nass-Labor Experimente machen. Das Protokoll unten beschreibt eine 30 min Puls Kennzeichnung durch die Fütterung von C. Elegans adulter Hermaphrodites mit EdU Bakterien und Co Kennzeichnung M-Phase Zellen nach Färbung mit Antikörper Anti-pH3 und Vorläuferzellen Zone Zellen durch Färbung mit Anti-WAPL-1 Antikörper beschriftet. Nur Änderungen in der Dauer der EdU feed (Schritt 2.5), Art der Antikörper eingesetzt (Schritt 5) und Analysen (Schritt 8.3) sind für die weiteren Messungen erforderlich.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Vorbereitung der EdU-Label Bakterien

  1. Wachsen Sie eine Starterkultur von MG1693. Escherichia coli (E. Coli) MG1693 trägt eine Mutation im ThyA.
    1. Streifen aus E. Coli MG1693 aus einem gefrorenen Glycerin bestand auf einem 120 mm Lysogeny Brühe (LB) Agar Petrischale. Kultur bei 37 ° C über Nacht.
    2. Impfen aus zwei einzelnen E. Coli MG1693 Kolonien in zwei doppelte 4 mL-Tuben der Flüssigkultur lb bei 37 ° C für ~ 16 h.
      Hinweis: MG1693 wächst gut in LB ohne Ergänzung mit Thymin oder Thymidin.
  2. Wachsen Sie E. Coli MG1693 in minimal Medien ergänzt mit EdU.
    1. Autoklaven eine konische 500 mL-Flasche.
    2. Verwenden Sie sterilen Technik, um hinzuzufügen, 5 mL 20 % Glukose, 50 μL von 10 mg/mL von Thiamin, 120 μl 5 mM Thymidin, 100 μL 1 M MgSO4, 200 μl 10 mM EdU, 100 mL M9 Puffer und 4 mL frisch gewachsen über Nacht MG1693 Kultur.
      Hinweis: Die Endkonzentration von EdU ist 20 μM in dieser Kultur1,7. Diese Konzentration führt zu DNA-Schäden und Zellzyklus Festnahme, wenn direkt an Säugetierzellen in Kultur20angewendet. Allerdings ist nur ein Bruchteil dieser EdU in E. Coli und somit zur C. Eleganseingearbeitet. Gibt es keinen Beweis des Zellzyklus Festnahme und keine Veränderung in der Größe der Stammvater Zone oder M-Phase-Index nach EdU Behandlung des jungen Erwachsenen Hermaphroditen.
    3. Über Nacht, aber nicht länger als 24 h bei 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min-Kultur.
  3. Konzentrieren Sie EdU-Label E. Coli zu und für M9 Agar Petrischalen.
    1. Vorkühlen einer Tischplatten Zentrifuge bis 4 ° C.
    2. Verwenden Sie sterilen Technik, um die Kultur in 2 – 4 steril 50 mL konische Röhrchen zu übertragen.
    3. Zentrifugieren der Kulturen bei 3.000 X g bei 4 ° C für 30 min, pellet-EdU-Label E. Coli.
      Hinweis: EdU-haltigen überstand nach lokalen und institutionellen Richtlinien entsorgen.
    4. Die Pellets mit 4 mL frische M9 aufzuwirbeln. Verwenden Sie einen sterilen 1 mL pipettieren Tipp oder eine sterile 5 mL serologische pipettieren. Resuspending der Pellets kann mehrere Minuten dauern.
    5. Verwenden Sie die gleichen pipettieren, um aufzutragen und zu verteilen ~ 8 Tropfen resuspendierte EdU-Label E. Coli MG1693 zur Mitte der Raumtemperatur 60 mm M9 Agar Petrischalen. Einer Charge ergibt ~ 16 Gerichte.
    6. Lassen Sie das Geschirr zum Trocknen für einige Stunden oder über Nacht bei Raumtemperatur, dann versiegeln jedes Gericht mit einem Filmstreifen Labor. Gerichte können bei 15 ° C für ~ 2 Wochen und bei 4 ° C für ~ 2 Monate gelagert werden. Verwenden der gleichen Charge von EdU Gerichte für jeden Satz von Experimenten.

(2) Verfütterung von EdU an C. elegans

  1. Synchronisieren Sie Bevölkerung durch zeitgesteuerte Ei legen, alkalischen Hypochlorit Behandlung gefolgt von Schraffuren in S-Medium mit Cholesterin, oder durch Auswählen der entsprechenden Stufe21. Wachsen Sie die Tiere zur gewünschten Stufe (hier: 24 h Post-L4) auf Nematoden Wachstumsmedium ausgesät mit E. Coli OP50 bei 20 ° C.
    Hinweis: Bereiten Sie 50-100 Tiere pro Versuch, da einige möglicherweise nicht gut zu sezieren, und andere werden in den Prozess der Wasch- und Übertragung verloren.
  2. Lassen Sie die EdU-Gerichte auf 20 ° C (oder die Temperatur für das Experiment benötigt) erwärmen.
  3. Waschen Sie die Tiere von NGM Gerichte mit M9 oder Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) in einer 1,5 mL-Tube. Lassen Sie die Tiere kurz durch Schwerkraft oder eine kurze Spritztour in einem Microcentrifuge begleichen.
  4. Entfernen Sie den überstand zu und waschen Sie der Tiere 1 – 2 Mal mit ~ 1 mL M9 oder PBS. Den überstand zu entfernen.
  5. Verwenden Sie ein Glas Pasteurpipette, um die Tiere in einem winzigen Tropfen M9 oder PBS auf die Mitte des Rasens EdU übertragen. Warten Sie einige Minuten, bis die Flüssigkeit aufgesogen werden, dann Inkubation bei 20 ° C für 30 min (für die S-Phase Direktmessung) oder länger (zur Geschichte der S-Phase Messen), je nach Bedarf.
    Hinweis: EdU-Signal ist nach weniger als 15 min von EdU Fütterung1nachweisbar in Keimbahn Kernen.
  6. Die EdU-Schale mit ~ 2 mL M9 oder PBS in ein Glas Schüssel sezieren waschen Sie die Würmer ab.

(3) Dissektion und Fixierung von C. Elegans Keimbahn

Hinweis: Dieses Protokoll für die Dissektion, Fixierung und Antikörper Färbung von C. Elegans Hermaphrodit Keimbahn ist fast identisch mit dem veröffentlichten Gervaise und Arur (2016)22, abgesehen davon, dass die Glasröhren 1 mL zentrifugiert werden können, um zu beschleunigen, Waschen Schritte und ein langwieriger Glas Pasteurpipette kann verwendet werden, um die Flüssigkeit aus 1 mL Glasröhrchen effektiver zu entfernen.

  1. Waschen und C. Elegans Germlines zu sezieren.
    1. Ermöglichen Sie es die Tieren, sich an der Unterseite der sezierenden Schale, Wirbel, die Tiere in der Mitte zu sammeln und nutzen Sie eine lange Pasteurpipette PBS zu entfernen. 1 – 2 Mal mit ~ 2 mL PBS waschen.
    2. Fügen Sie 2 mL PBS und 4 μL von 100 mM Levamisol, die Tiere zu immobilisieren. Schwenken Sie die Schüssel erneut, um die Tiere in der Mitte des Tellers zu sammeln.
      Hinweis: Immobilisierung kann zwischen wenigen Sekunden und einigen Minuten dauern. Komplette Ruhigstellung ist nicht erforderlich für erfolgreiche Dissektion. Manche Menschen haben mehr Erfolg, wenn Tiere sezieren unvollständig immobilisiert werden.
    3. Sezieren die Tiere mit einem Paar von 25 5/8" Nadeln durch Schneiden an der Spitze (etwa zwischen den zwei pharyngealen Glühbirnen) oder das Heck. Achten Sie darauf, nicht um die Schleife der Keimbahn zu schneiden. Darm und Keimbahn sollten "pop-out" von der Körperhöhle durch Innendruck, sondern bleiben verbunden. Dieses Protokoll ist ähnlich wie zuvor veröffentlichten Gervaise und Arur (2016)22.
      Hinweis: Halten Sie die Dissektion Zeit bis ~ 5 min, sicherlich nicht mehr als 15 min. länger Dissektion führen zum Verlust der Antikörper Färbung Signal (Sudhir Nayak, persönliche Mitteilung) und verhungern in PBS beeinträchtigen die Tiere Physiologie. Lernen, schnell und präzise zu zergliedern dauert einige Übung.
    4. Bei Bedarf, Wirbel um die sezierten Tiere in der Mitte zu sammeln, und eine lange Pasteurpipette verwenden, um möglichst viel PBS wie möglich entfernen.
  2. Beheben und Gewebe zu entwässern
    1. 2 mL 3 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS-Lösung zugeben. Bedecken Sie die Schüssel locker mit Labor Film und Shop auf einer Bank oder in einer Schublade für 10 Minuten.
      Hinweis: Tauwetter PFA-Lösung in einem 37 ° C Wasserbad und Abkühlen auf Raumtemperatur vor Germlines sezieren.
      Achtung: PFA Lösung ist mäßig giftig und wahrscheinlich krebserregend und Teratogen. Dämpfe ausstoßen von Paraformaldehyd Lösungen sind leicht entflammbar. Nitril-Handschuhe zu tragen. Verdünnen Sie PFA von 16 % auf 3 % in einem chemischen Abzug. Wenn Sie außerhalb der Abzugshaube arbeiten, halten Sie alle Behälter bedeckt.
    2. Übertragen Sie die Keimdrüsen sorgfältig auf eine saubere 5 mL Glas Zentrifugenröhrchen.
    3. Fügen Sie ca. 3 mL PBSTw (PBS mit 0,1 % Tween-20) in die Schale, die die Keimdrüsen, um verbleibende Gonaden abrufen und die PFA-Lösung verdünnen enthalten.
    4. Spin-down in einer klinischen Zentrifuge bei 870 X g ~ 1 min. jüngere oder kleinere Tiere erfordern längere Spin-Zeiten als ältere oder größere Tiere.
    5. Mit einer langen Glas-Pipette, den überstand auf unerwünschtes Material Becher für eventuelle Ablagestapel in unerwünschte Material Flasche in der chemischen Haube übertragen.
    6. Fügen Sie 2 mL hochwertige Methanol vorab gekühlt bis-20 ° C. Decken Sie die Zentrifugenröhrchen mit Labor Film fest.
      Hinweis: Verwendung von frischen hochwertigen "gold Label" Methanol ist unerlässlich für die richtige Morphologie mit bestimmten Antikörpern.
      Achtung: Methanol ist eine hoch entzündliche Flüssigkeit und Dampf, das ist giftig beim Verschlucken, eingeatmet oder Hautkontakt durfte. Tragen Sie Handschuhe und geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. Verwenden Sie einen Gefrierschrank für Kleinmengen entzündliche Stoffe geeignet.
    7. Store in Gefrierschrank-20 ° C für 1 h, auch über Nacht oder sogar mehrere Monate.
      Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

4. Germlines rehydrieren

  1. PBSTw verdünnen das Methanol zu rehydrieren die Keimdrüsen füllen Sie Zentrifuge Glasröhrchen nach oben ein. Spin-down in einer klinischen Zentrifuge bei 870 X g ~ 1 min.
  2. Mit einem langen Glas Pasteurpipette, überstand auf unerwünschtes Material Becher für eventuelle Ablagestapel in unerwünschte Material Flasche in der chemischen Haube übertragen.
  3. Die Keimdrüsen, 3 Mal mit ~ 5 mL PBSTw, dreht sich in einer klinischen Zentrifuge bei 870 X g ~ 1 min jedes Mal zu waschen. Den überstand zu entfernen.
  4. Spülen Sie eine kleine 1 mL Borosilikatglas Rohr und einem langen Glas Pasteurpipette mit PBSTw.
  5. Fügen Sie ~ 700 μl des PBSTw und verwenden Sie der lange Glas Pasteurpipette übertragen die Gonaden auf das Röhrchen. Verwenden Sie ein paar zusätzliche Tropfen PBSTw, um sicherzustellen, dass alle Keimdrüsen übertragen werden.
  6. Spin-down in einer klinischen Zentrifuge bei 870 X g ~ 1 min. eine langwierige lange Glas Pasteurpipette verwenden, entfernen Sie soviel Flüssigkeit wie möglich ohne zu stören die Keimdrüsen. Lassen Sie nicht mehr als 50 μL.
    Hinweis: Wenn Antikörpernachweis nicht notwendig ist, fahren Sie mit Schritt 6.

(5) erkennen Sie Antigene mit Antikörpern

  1. Verdünnen Sie der primäre Antikörper im Serum 30 % in PBS. Im vorliegenden Beispiel Anti-WAPL-1-Antikörper ist verdünnter 1:2,000 und Anti-pH3 Antikörper wird verdünnt 1: 500. Zentrifugieren Sie frisch aufgetauten Serum für 10 min in ein Microfuge bei 20.000 X g bei 4 ° C, die Partikel zu entfernen. Verwenden Sie den überstand, die mehrere Tage bei 4 ° C aufbewahrt werden kann. Verwenden Sie das entsprechende Serum entsprechend den Wirtsorganismus Sekundärantikörper (ziegenserum wird hier verwendet). Ein optionaler blockierender Schritt kann vor der Zugabe von primären Antikörper hinzugefügt werden.
  2. Jede kleine Glasröhre 100 μL der verdünnten Primärantikörper zuweisen. Inkubation bei Raumtemperatur für 4 h.
    Hinweis: Die Inkubationszeiten schwanken durch Antikörper. Für einige Antikörper ist 2 h bei Raumtemperatur ausreichend. Längeren Inkubationen (zB., über Nacht) sind möglich, aber Hintergrund erhöhen kann.
  3. Füllen Sie die Rohre um top mit PBSTw und spin-down in einer klinischen Zentrifuge bei 870 X g ~ 1 min.
  4. Waschen Sie die Keimdrüsen 3 Mal mit ~ 1 mL PBSTw. Inkubation für ~ 5 min pro Waschgang damit überschüssige Primärantikörper in Waschanlagen verbreiten. Mit einer langwierigen lange Glas Pasteurpipette, entfernen Sie soviel Flüssigkeit wie möglich ohne zu stören die Keimdrüsen. Lassen Sie nicht mehr als 50 μL.
  5. Verdünnen Sie der Sekundärantikörper in 30 % ziegenserum in PBS. Im vorliegenden Beispiel werden Ziege-Anti-Kaninchen-594 und Ziege-Anti-Maus-647 jeweils bei 1: 400 verdünnt.
    Hinweis: Wählen Sie Sekundärantikörper sorgfältig, um sicherzustellen, dass Farbstoffe aus der Farbstoff in der EdU Kit unterscheiden. Im vorliegenden Beispiel enthielt das EdU Kit 488 nm Anregung Farbstoff.
  6. Jede kleine Glasröhre 100 μL der verdünnten Sekundärantikörper zuweisen. Inkubieren Sie im Dunkeln bei Raumtemperatur 2 h.
    Hinweis: Die Inkubationszeiten schwanken durch Antikörper. Für einige Sekundärantikörper reicht 1 h bei Raumtemperatur. Längeren Inkubationen (zB., über Nacht) sind möglich, aber Hintergrund erhöhen kann.
  7. Waschen Sie die Keimdrüsen 3 Mal mit ~ 1 mL PBSTw. Inkubation für ~ 5 min pro Waschgang damit überschüssige Sekundärantikörper in Waschanlagen verbreiten. Mit einer langwierigen lange Glas Pasteurpipette, entfernen Sie soviel Flüssigkeit wie möglich ohne zu stören die Keimdrüsen. Lassen Sie nicht mehr als 50 μL.
    Hinweis: Gonaden können in 100 μl PBS nach diesem Schritt ggf. gespeichert werden obwohl dies Signal verringern kann. PBS zu entfernen, bevor Sie fortfahren.

6. führen Sie die EdU Klick Reaktion um EdU zu erkennen

Hinweis: Durchführung der EdU ist Klick Reaktion vor der Färbung Schritte (führen Sie Schritt 6 vor Schritt 5) Antikörper möglich, abhängig von der verwendeten Antikörper-7. Die Klick-Reagenzien können jedoch stören bestimmte Antigene (zB., REC-8 Antikörper reagiert empfindlich auf Fixierung und Permeabilisierung). Die hier angegebenen Reihenfolge ergibt helle Antikörper Färbung mit der REC-8, WAPL-1, HIM-3, pH3, Flagge und CYE-1 Antikörper verwendet, unter anderem.

  1. Bereiten Sie Klick EdU cocktail8 frische durch eine saubere 1,5 mL-Tube Folgendes hinzufügen. Die Reihenfolge der Zusätze ist wichtig. Vor Licht schützen Sie und pflegen Sie alle Reagenzien auf Eis. Dieses Rezept ergibt genug für eine Probe (100 μl); Multiplizieren Sie das Rezept, nach Bedarf.
    1. 2 mL Reinstwasser in den Puffer additive hinzugeben. Dies macht 10-fach Puffer Additiv, die auf 1 X verdünnt werden muss unmittelbar vor dem Gebrauch.
    2. 76,5 μL von Reinstwasser 8,5 μl 10 X Puffer hinzufügen. Mischen Sie gut.
    3. Fügen Sie 4 μL von 100 mM CuSO4 (kann als Komponente E bezeichnet werden). Mischen Sie gut.
    4. Fügen Sie 0,25 μl von 488 nm Dye azid. Es muss bei Raumtemperatur aufgetaut werden, wie seine Lösungsmittel, Dimethyl Sulfoxid, bei 4 ° c leuchtet Gut mischen und vor Licht schützen.
    5. Mix 9 μL von Reinstwasser mit 1 μl des Puffers additive in der Kappe des Rohres. Pipettieren von der Kappe bis zum restlichen Cocktail hinzufügen und mischen Sie gut durch pipettieren rauf und runter.
  2. Führen Sie die EdU-Klick-Reaktion.
    1. Die Keimdrüsen in das Röhrchen ~ 100 μL der Klick EdU cocktail hinzufügen. Mit Labor Film abdecken und 30-60 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    2. Einmal waschen Sie, mit 100 μL der Reaktion spülen Puffer.
    3. Waschen Sie die Keimdrüsen 4 mal mit ~ 1 mL PBSTw. Inkubation für ~ 15 min pro Waschgang, überschüssige EdU cocktail Komponenten in Waschanlagen diffundieren können. Mit einer langwierigen lange Glas Pasteurpipette, entfernen Sie soviel Flüssigkeit wie möglich ohne zu stören die Keimdrüsen. Lassen Sie nicht mehr als 50 μL.

(7) Fleck DNA und bereiten Sie Folien

  1. Die Keimdrüsen fügen Sie 1 Tropfen (~ 25 μL) antifade Eindeckmittel mit 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, verwendet, um DNA zu visualisieren hinzu). Warten Sie wenige Minuten, so kann es zu begleichen und mischen Sie mit den Keimdrüsen.
    Hinweis: Alternativ kann eine 1:1,000 Verdünnung des DAPI (aus einem Bestand von 0,1 mg/mL) mit PBS-Puffer für 5 min, gefolgt von 20 μL 1,4-Diazabicyclo [2.2.2] Oktan (DABCO) in 90 % Glycerin oder ein anderes antifade Eindeckmittel angewendet werden.
  2. Bereiten Sie einen großen 2,5 % Agarose Block auf einen standard-Glas-Objektträger.
  3. Eine neue saubere staubfreie lange Glas Pasteurpipette die Keimdrüsen, die Agarose-Pad übertragen. Bewahren Sie alle Flüssigkeit und Gonaden schmale Ende der Pipette auf den Verlust der Gonaden zu minimieren.
    Hinweis: Gonaden auf kleinen Glasröhrchen stecken oder in langen Glas Pasteurpipette kann "gerettet werden" durch Spülen mit PBSTw, sammelt die Flüssigkeit in einen sezierenden Teller und Kommissionieren einzelner Tiere auf der Folie mit der Wimper.
  4. Verwendung einer Wimper (oder eine Schleife von dünnem Haar) geklebt, um einem Zahnstocher verteilen die Gonaden über das Agarose-Pad und die Staubpartikel zu entfernen.
  5. Gelten Sie einem rechteckigen Glas deckgläschen. Unteren langsam von einer Seite um Luftblasen zu vermeiden. Verwenden Sie eine Gewebe entfernen überschüssige Lösung verhindert das Deckglas so frei bewegen.
    Hinweis: Wählen Sie Deckgläsern, die an das Mikroskop zu entsprechen, die verwendet werden. #1 und #1.5 Deckgläsern funktionieren gut.
  6. Ermöglichen Sie die Folien, sich niederzulassen und Trocknen leicht über Nacht bei Raumtemperatur oder 4 ° C. Dadurch werden die Keimdrüsen leicht abflachen. Folien sollten bei 4 ° c gelagert werden
  7. Optional: Seal die Ränder der Folie mit Nagellack oder eine andere Folie-Versiegelung. Abdichtung der Ecken zuerst, dann die Seiten, wird verhindert, dass das Deckglas verlagert.

8. die konfokale Bildgebung und Analyse

  1. Bild der distalen Gonade mit einem drehenden Scheibe konfokale Fluoreszenz Mikroskop mit einer hochenergetischen Lichtquelle, Plan-apochromatische Ziele und eine hohe Effizienz-Mikroskop-Kamera ausgestattet. Aufnahmen Sie mit 1 μm oder engere Abstände zwischen Z-stapeln. Achten Sie auf Laser macht, Empfindlichkeit und Belichtung Zeit für alle Kanäle.
    1. Verwenden Sie die folgenden: 405 nm Linie Laseranregung mit 485 nm (W60) Emission Filter für DAPI, 488 nm Linie Laseranregung mit 527 nm (W55) Emission Filter für EdU, 561 nm Linie Laseranregung mit einem 615 nm (W70) Emission Filter für WAPL-1 und ein 640 nm Laser Linie Targets Tion mit 705 nm (W90) Emission Filter für pH3.
      Hinweis: Signalintensität und hintergrundintensität variiert. Ebenso werden möglicherweise bis zu 10-fach die erforderliche Belichtungszeiten variieren.
  2. Verwenden Sie Cell Counter-Plug-in23 in Fidschi24,25 , um manuell jeden Kern zählen. Beschriften Sie jeden einzelnen Kern nach der an- und Abwesenheit von pH3, EdU und WAPL-1. Verwenden Sie die Klassen der Kerne, die in Tabelle 1 und Abbildung 2, beschrieben, wie diese alle unten beschriebenen Berechnungen erleichtern werden.
    Hinweis: Qualifizierte Experimentatoren können genau alle Kerne in ein 3D-Bild zählen, ohne Doppelzählungen oder fehlen alle Kerne. Alternativ kann man jedem Kern in jedem Z-Ebene zählen, und die Marken-Zellen R Skript3 multiplizieren gezählt Kerne entfernen verwendet werden.
  3. Berechnen Sie Zellzahlen und Frequenzen aus der oben genannten Grafen je nach Art des Zellzyklus Messung erforderlich. Die Kerne sind in Tabelle 1 und Abbildung 2definiert. Die Berechnungen sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
    1. (Variante ich) Um die Kerne in der S-Phase zu identifizieren, füttern Sie die Tiere EdU für 30 Minuten. Alle Kerne anzeigen EdU Label sind S-Phase Kerne. Um zu berechnen, nehmen Sie die Summe A und C-Kerne, siehe Tabelle 1 und Abbildung 2.
      Hinweis: In 30 min EdU Puls in Wildtyp adult Hermaphroditen sind alle EdU beschriftet Kerne Co beschriftet mit Stammvater Zone Marker1.
    2. Zur Messung der Stammvater Zone Fleck mit einem Stammvater zonenmarkierung wie REC-8 oder WAPL-1 Antikörper. Die Stammvater Zone wird definiert als alle nucleoplasmic REC-818 oder WAPL-1 immunreaktiven Keimbahn Kerne. Zum Berechnen der Summe aller WAPL-1 immunreaktiven Kerne (A + B + C + D, siehe Tabelle 1 und Abbildung 2).
      Hinweis: WAPL-1 kennzeichnet auch die DTC und somatische Gonade Kerne, die nicht gezählt werden sollte. Somatische Zellkerne sind leicht zu erkennen durch sehr intensive WAPL-1 Signal, Lage etwas außerhalb der Keimbahn und ein "Ei gebraten" Morphologie der Zellkerne.
    3. Um die S-Phase-Index zu messen, eine 30 min EdU Experiment durchführen und gemeinsam mit REC-8 oder WAPL-1 Antikörper beschriften. Die S-Phase-Index ist definiert als der Anteil der Stammvater Zone, die in S-Phase ist. Um zu berechnen, zählen alle Kerne der S-Phase und dann durch die Gesamtzahl der Stammvater Zone Kerne teilen (A + C / A + B + C + D, siehe Tabelle 1 und Abbildung 2).
    4. (Variante II) Um die Kerne im M-Phase zu identifizieren, Färben Sie mit pH3 Antikörper. Jede pH3 immunreaktiven Kerne sind M-Phase Kerne. Dies funktioniert unabhängig von der Dauer der EdU ernähren. Um zu berechnen, nehmen Sie die Summe von A und B Kerne, siehe Tabelle 1 und Abbildung 2.
      Hinweis: WAPL-1 kennzeichnet auch die DTC und somatische Gonade Kerne, die nicht gezählt werden sollte. Somatische Zellkerne sind leicht zu erkennen durch sehr intensive WAPL-1 Signal, Lage etwas außerhalb der Keimbahn und ein "Ei gebraten" Morphologie der Zellkerne.
    5. Zur Messung des M-Phase-Indexes gemeinsam mit pH3 und REC-8 oder WAPL-1 Antikörper kennzeichnen. Der M-Phase-Index ist definiert als der Anteil der Stammvater Zone, die in M-Phase ist. Um zu berechnen, zählen alle Kerne der M-Phase, und dann durch die Gesamtzahl der Stammvater Zone Kerne teilen (A + B / A + B + C + D, siehe Tabelle 1 und Abbildung 2).
    6. (Variante III) Kerne in mitotischen meiotische S-Phase und beide beschriften mit EdU. Um die beiden Populationen voneinander entfernt zu sagen, bestimmen Sie, ob die S-Phase durch Mitose oder Meiose folgte. Um festzustellen, ob Kerne in mitotischen oder meiotische S-Phase sind, ernähren EdU für 4 h und Co Label für pH3 (ein Marker der M-Phase) und HIM-3 (ein meiotische Chromosomen Achse Protein) durch Antikörper Färbung. Aufzeichnen der Kerne, die EdU und pH3 anzeigen (Typ A, siehe Tabelle 1 und Abbildung 2) als mitotischen S-Phase, während Kerne, die EdU und HIM-3 anzeigen (Typ E, siehe Tabelle 1 und Abbildung 2) als meiotische S-Phase.
    7. (Variation IV) Berechnen Sie die Dauer der G2-Phase.
      Hinweis: G2-Phase trennt S-Phase von M-Phase. Obwohl kein Marker Label G2 in C. Elegans Keimbahn berichtet worden ist, kann man berechnen, die Dauer der G2-Phase durch die Kombination von Daten aus mehreren Experimenten, die M-Phase (zum Zeitpunkt der Dissektion) und S-Phase (ab mehreren h vor beschriften Dissektion). Eine Zelle, die M-Phase und S-Phase Marker zeigt G2-Phase abgeschlossen im Verlauf des Experiments. Eine Zelle, die nur der M-Phase-Marker und nicht der S-Phase Marker zeigt war nicht in der S-Phase während des Experiments.
      1. Um die Dauer der G2-Phase zu berechnen, feed EdU für 2 h und Co Label mit pH3 Antikörper. Prüfen Sie nur Kerne, die mit pH3 (diese sind in M-Phase bei der Präparation) auf das Vorhandensein von EdU beschriften (diese waren in S-Phase während der 2 h-EdU-Label vor Dissektion). Berechnen Sie den Anteil der M-Phase-Kerne, die G2-Phase abgeschlossen (A / A + B, siehe Tabelle 1 und Abbildung 2).
      2. Wiederholen Sie dieses Experiment mit einem 3 h-EdU-Label, und wieder mit ein 4 h-EdU-Label (und optional ein 5 h-EdU-Label). Plot der Prozent der pH3 positive Kerne, die EdU positiv auf der y-Achse und die Dauer der EdU-Beschriftung auf der x-Achse, wie in Abbildung 3Agezeigt.
      3. Berechnen Sie die mediane Dauer der G2-Phase durch die Verbindung der Punkte in der Grafik und bestimmen, wo die Linie überquert 50 %, wie in Abbildung 3Agezeigt.
      4. Berechnen Sie die maximale Dauer der G2-Phase durch Verbinden der Punkte in der Grafik und bestimmen wo die Linie überquert 99 %, wie in Abbildung 3Agezeigt.
    8. (Variante V) Berechnen Sie die Duraion G2 + M + G1.
      Hinweis: In die Keimbahn C. Elegans ist G1-Phase ungewöhnlich kurz. Obwohl kein Marker G1 in C. Elegans Keimbahn beschriften berichtet worden ist, kann schätzen die Summe Dauer der G1, G2 und M-Phase, und dann vergleichen Sie diesmal mit der G2-Phase Zeit oben beschrieben. Die maximale Dauer der G2 + M + G1 wird aus dem Prozentsatz der alle Vorläuferzellen Zone Kerne (WAPL-1 immunreaktiven), die bleiben EdU negativ (nicht unterziehen, S-Phase) nach EdU labeling für mehrere Stunden geschätzt.
      1. Um die Dauer der G2 + M + G1 zu berechnen, feed EdU für 2 h und Co Label mit REC-8 oder WAPL-1 Antikörper. Bestimmen der Bruchteil der Stammvater Zone, die S-Phase in dieser Zeit erfuhr (A + C / A + B + C + D, siehe Tabelle 1 und Abbildung 2).
      2. Wiederholen Sie dieses Experiment mit einem 3 h-EdU-Label, und wieder mit ein 4 h-EdU-Label (und optional ein 5 h-EdU-Label). Plot der Prozent der REC-8 oder WAPL-1 positive Kerne, die EdU positiv auf der y-Achse und die Dauer der EdU-Beschriftung auf der x-Achse, wie in Abbildung 3 bgezeigt.
      3. Berechnen Sie die maximale Dauer der G2 + M + G1 durch die Verbindung der Punkte in der Grafik und zu finden wo die Linie überquert 99 %, wie in Abbildung 3 bgezeigt.
        Hinweis: Es ist möglich, die Experimente zu bestimmen, die Dauer der G2 und G2 + M + G1 als einen einzigen Satz von 2, 3, 4 und 5 h EdU Experimente durchführen, indem gemeinsam mit Kaninchen-Anti-WAPL-1 und Maus-Anti-pH3 Antikörper Kennzeichnung.
    9. (Variation VI) Um die Kerne, die in der Stammvater Zone repliziert zu identifizieren, aber haben seit eingegebenen Meiose, füttern Sie die Tiere EdU für 10 h und Co Label mit REC-8 oder WAPL-1 Antikörper. Alle Kerne anzeigen EdU Label befanden sich in S-Phase während dieser 10 h. Alle Kerne, die nicht nucleoplasmic REC-8 oder WAPL-1 Färbung angezeigt werden wurden in Meiose. Einfach zählen die Kerne mit EdU Kennzeichnung, die nicht angezeigt werden mit dem Stammvater zonenmarkierung Kennzeichnung (E, siehe Tabelle 1).
      Hinweis: Wenn Keimdrüsen des meiotischen Prophase Markers HIM-3 mit Anti-HIM-3 Antikörper gefärbt sind, Count die Anzahl der Kerne mit EdU, die Kennzeichnung, die sind auch positiv für HIM-3.
    10. Um die Rate der meiotischen Eintrag zu berechnen, führen Sie das obige Experiment mit einem 5 h, 10 h und 15 h-Label der EdU. Zeichnen Sie die Anzahl der Kerne, die Meiose auf der y-Achse und die Dauer der EdU-Beschriftung auf der x-Achse eingegeben, wie in Abbildung 3dargestellt. Verwenden Sie dann eine einfache lineare Regression zur Berechnung der Steigung (Kerne eingegeben Meiose pro h) von y = Mx + b.
      Hinweis: Es ist wichtig, eine lineare Regression zu verwenden, um die Rate der meiotischen Eintrag berechnen. Es wäre falsch, teilen Sie einfach die Anzahl der Kerne, die Meiose um die Dauer der EdU Beschriftung eingegeben, da der y-Achsenabschnitt nicht NULL ist.
    11. (Variation VII) Die Rate der meiotic Progression zu messen.
      Hinweis: Da EdU kovalent in DNA integriert ist, kann es verwendet werden, eine Bevölkerung der Zellen durch eine Differenzierung zu verfolgen. Die Zellen, die S-Phase in der Stammvater Zone unterzog sich behalten die EdU-Label, Meiose, Fortschritt durch Meiose, eingehen und Oogenese zu unterziehen. Eine Puls-Chase-Experiment mit EdU kann verwendet werden, um die Rate der meiotic Progression messen.
      1. Füttern Sie EdU-Label Bakterien der Tiere für 4 h ("Puls"). Übertragen Sie die Tiere auf unbeschriftete OP50 Bakterien für 48 h (die "Jagd"), dann sezieren Sie und Co mit einem Stammvater zonenmarkierung wie REC-8 oder WAPL-1 (oder einem meiotischen Prophase Marker wie HIM-3) zu kennzeichnen Sie, wenn gewünscht.
      2. Beim abbilden, suchen Sie die Position des Nucleus am proximalen EdU gekennzeichnet. Die Rate der meiotic Progression ist die zurückgelegte Distanz (in Zelle Durchmessern ab Ende der Stammvater Zone) durch die am proximalen EdU beschriftet Zellkern während der 48 h-Jagd.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Da DNA-Synthese benötigt wird, EdU zu integrieren, kann man feststellen, dass mit der Bezeichnung der EdU Kerne S-Phase während des Zeitfensters EdU-Kennzeichnung unterzog. Man kann die Kerne dieser Bezeichnung in einer 30 min Fütterung mit EdU beschriftet Bakterien als Kerne in S-Phase bei der Präparation interpretieren. Kerne, die in einem mehr kontinuierliche EdU Fütterungsversuch beschriften können früh im Zeitfenster und seit Links S-Phase gekennzeichnet haben, oder können in der spä...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorbereitung der EdU-Label Bakterien (Schritt 1) ist für dieses Protokoll und den ersten Punkt für die Problembehandlung von entscheidender Bedeutung. Wildtyp junge Erwachsene Hermaphroditen Label in einer 4 h EdU-Puls, so dass dies ein nützliches Steuerelement für jede neue Charge mit der Bezeichnung der EdU Bakterien sehr zuverlässig. Darüber hinaus werden intakte EdU-Label Bakterien, die den Darm (in älteren Tieren oder bestimmte Rachen/Mahlwerk defekt Mutanten) geben Sie beschriften mit Click Chemie und erscheinen al...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir sind dankbar für die E. Coli Lager Zentrum für MG1693; Wormbase; die Caenorhabditis Genetik Center das von der nationalen Institute der Gesundheit der Forschung Infrastruktur Büroprogramme (P40OD010440) für Stämme gefördert wird; Zach Pincus für statistische Beratung; Aiping Feng für Reagenzien; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar und John Brenner für Schulung, Beratung, Unterstützung und hilfreiche Diskussion; und das Kornfeld und Schedl Labs für Feedback zu dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health unterstützt [R01 AG02656106A1, KK, R01 GM100756 TS] und National Science Foundation predoctoral Fellow [DGE-1143954 und DGE-1745038, ZK]. Weder die National Institutes of Health als auch der National Science Foundation hatte keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, Erhebung, Analyse und Interpretation der Daten, noch schriftlich das Manuskript.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
E. coli MG1693Coli Genetic Stock Center6411wächst gut in standardmäßigen unsupplementierten LB
em>E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging KitThermo Fisher ScientificC10337
5-Ethynyl-2′-DesoxyuridinSigma900584-50MGoder verwenden Sie EdU, das im Kit
GlucoseSigma D9434-500GD-(+)-Dextrose
Thiamin (Vitamin B1)SigmaT4625-5GReagenzqualität
ThymidinSigmaT1895-1GBioReagenz
Magnesiumsulfat HeptahydratSigmaM1880-1KGMgSO4, Reagenzqualität
Natriumphosphat, zweibasisch, wasserfreiFisherBP332-500GNa2HPO4
Kaliumphosphat, monobasischSigma P5379-500GKH2PO4
AmmoniumchloridSigmaA4514-500GNH4Cl, Reagenz plus
bakteriologischer AgarUS BiologischesC13071058
Calciumchlorid-DihydratSigmaC3881-500GCaCl
LB Bouillon (Miller)SigmaL3522-1KGVerwendet bei 25 g/l
LevamisolSigmaL9756-5G0,241 g/10 ml
Phosphatgepufferte KochsalzlösungCalbiochem Omnipur6506hausgemachtes PBS funktioniert genauso gut
Tween-20SigmaP1379-500ML
16 % Paraformaldehyd, Ampullen in EM-QualitätElektronenmikroskopie Sciences1571010 ml Ampullen
100 % MethanolThermo Fisher ScientificA454-1LGold-Markierungs-Methanol ist entscheidend für die richtige Morphologie mit bestimmten Antikörpern
ZiegenserumGibco16210-072Los 1671330
Kaninchen-Anti-WAPL-1Novus Biologika49300002Los G3048-179A02, verwendet bei 1:2000
Maus-Anti-pH3-Klon 3H10Millipore05-806Los#2680533, verwendet bei 1:500
Ziegen-Anti-Kaninchen IgG-konjugiertes Alexa Fluor 594InvitrogenA11012Los 1256147, verwendet bei 1:400
Ziegen-Anti-Maus IgG-konjugiertes Alexa Fluor 647InvitrogenA21236Los 1511347, verwendet bei 1:400
Vectashield Antifading-Eindeckmedium mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol-Dihydrochlorid (DAPI)Vector LaboratoriesH-1200Eindeckmedium ohne DAPI kann stattdessen verwendet werden, nach einem separaten DAPI Inkubationsnagellack
Wet n WildDTC450Bjeder klare Nagellack sollte wirken
S-Mediumverschiedenesiehe wormbook.org für Protokoll
M9 Pufferverschiedenesiehe wormbook.org für Protokoll
M9Agar verschiedenegleiche Rezeptur wie M9 Puffer, jedoch 1,7% Agar hinzufügen
Nematoden-Wachstumsmediumverschiedenesiehe wormbook.org für das Protokoll
Präparieren von UhrglasCarolina Biological42300
Parafilm LaborfoliePechiney KunststoffverpackungPM-9964 Zoll breite Laborfolie
Petrischalen60 mm Durchmesser
Langglas Pasteur-Pipetten
1ml ZentrifugenröhrchenMidSci Avant2926
Spitzen
Serologische Pipetten
500 mL Erlenmyer Kolben
Aluminiumfolie
25G 5/8" NadelnBD PrecisionGlide 
5ml Zentrifugenröhrchen aus GlasPyrex 
Borosilikatglasröhren 1ml
Objektträger
Nr. 1 Deckgläser 22 x 40 mmNr. 1,5 kann funktionieren, auch
37 > C Shaker Inkubator
Tischzentrifuge
Klinische ZentrifugeIEC428mit 6 schwingenden Schaufelrotoren
Mini Centrifuge
20 ° C Inkubator
4 ° C Kühlschrank-20
&Grad; C Gefrierschrank
Observer Z1 MikroskopZeiss
Plan Apo 63X 1,4 Öl-ImmersionsobjektivZeiss
Ultraview Vox Spinning Disc konfokales SystemPerkinElmer Das konfokale Spinning-Disc-System von Nikon funktioniert auch sehr gut, wie hier beschrieben: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy 
<305122

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -H., Maine, E. M., Schedl, T. Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline. Development. 138 (11), Cambridge, England. 2223-2234 (2011).
  2. Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line. Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).
  3. Seidel, H. S., Kimble, J. Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch. eLife. 4, (2015).
  4. Fox, P. M., Schedl, T. Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).
  5. Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans. BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).
  6. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  7. vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. elegans Cell Cycle Analysis. Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).
  8. ThermoFisher. Click-iT EdU Imaging Kits. , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10338.pdf (2011).
  9. Pazdernik, N., Schedl, T. Germ Cell Development in C. elegans. , Springer. 1-16 (2013).
  10. Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).
  11. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  12. Hansen, D., Schedl, T. Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).
  13. Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line. Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).
  14. Agarwal, I., Farnow, C., et al. HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans. Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).
  15. Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline. Development. 126 (5), Cambridge, England. 1011-1022 (1999).
  16. Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation. Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).
  17. Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., Mü Ller, F. Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation. Genes & development. 13 (17), https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC317003/pdf/x8.pdf 2258-2270 (1999).
  18. Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline. Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).
  19. Crawley, O., Barroso, C., et al. Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes. eLife. 5 (2), 1-26 (2016).
  20. Zhao, H., Halicka, H. D., et al. DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporated into DNA. Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Gervaise, A. L., Arur, S. Spatial and Temporal Analysis of Active ERK. in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).
  23. Vos, K. De Cell Counter Plugin. , https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html (2015).
  24. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  25. Rasband, W. ImageJ. , http://imagej.nih.gov/ij/> (2016).
  26. Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans. Development. 137 (4), Cambridge, England. 671-680 (2010).
  27. Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells. Nature communications. 6 (5), 7107(2015).
  28. Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance. Cell. 143 (2), 299-312 (2010).
  29. Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -C. daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans. Development. , 4230-4241 (2015).
  30. Cinquin, A., Chiang, M., et al. Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and. Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985(2016).
  31. Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/mp10044.pdf 1-7 (2010).
  32. Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue. Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

EdU EinbauS Phasen IndexM Phasen IndexG2 Dauerimmunfluoreszenzbasierte F rbungGonadensektionClick ChemieFiji Cell Counter

Verwandte Artikel