Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Gehirn Kerne im neonatalen Rattengehirn in Verbindung mit der ersten Fütterung Kolostrum zu isolieren. Diese Technik erlaubt die Studie von Nährstoff-Insuffizienz Stress im Gehirn wie von Enterozyten Signal moduliert.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Bewertung von zellulären Stresses und Entzündung im diskreten Oxytocin-sezernierenden Gehirn Kerne bei Neugeborenen Ratten vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Ziel dieses Protokolls ist, Oxytocin-Rezeptoren reichen Gehirn Kerne im neonatalen Gehirn vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum zu isolieren. Die Expression von Proteinen reagieren auf metabolischer Stress bekannt wurde im Gehirn-Kerne Isolate mit Western blotting gemessen. Dies wurde getan, um festzustellen, ob metabolischen Stress-induzierte Nährstoff Mangel im Körper neuronalen Stress ausgelöst. Wir haben bereits gezeigt, dass Nährstoff Insuffizienz bei Neugeborenen metabolischer Stress im Darm entlockt. Darüber hinaus moduliert Kolostrum Oxytocin zellulären Stress Response, Entzündung und Autophagie Marker in Neugeborene Ratte Darmzotten vor und nach ersten Feed. Signalisierung von Protein-Marker, die mit dem endoplasmatischen Retikulum Stress [ER Chaperon Immunglobulin Bindeprotein (BiP), eukaryotic Übersetzung Einleitung Faktor 2A (eIF2a), und eIF2a-Kinase Proteinkinase R (p-PKR)], sowie zwei Entzündung-Signalisierung Proteine [nuklearer Faktor κB (NF-kB) und Inhibitor κB (IkB)], wurden in Neugeborenen Gehirn Kerne gemessen [Kern des einsamen Trakt (NTS), paraventrikulären Nukleus (PVN), supra-Optik Kern (Sohn), Kortex (CX), Striatum Kerne (STR), und mediale präoptischen Kern (MPO)] vor der ersten Feed (entschärften von Kolostrum) und nach dem Start der Krankenpflege (grundiert von Kolostrum). Ausdruck des BiP/GRP78 und p-eIF2a wurden hochreguliert in ungestrichenen und herunterreguliert in grundiert NTS Gewebe. NF-κB wurde (hoch) in das Zytoplasma CX, STR und MPO beibehalten, während NF-κB niedriger und im NTS, PVN und Sohn unter beiden Bedingungen unverändert war. Die kollektiven BiP und p-eIF2 Erkenntnisse stehen im Einklang mit einer Stress-Reaktion. eIf2a war der Sohn, CX, STR und MPO durch DsRNA abhängige Kinase (p-PKR) phosphoryliert. Allerdings wurde in der NTS (und in geringerem Maße in PVN), eIf2a von einem anderen Kinase, allgemeine Kontrolle-Nonderepressible-2-Kinase (GCN2) phosphoryliert. Die Stress-modulierende Mechanismen zuvor beobachtet in Neugeborenen Darm Enterozyten erscheinen in einigen OTR-reiche Gehirnregionen gespiegelt werden. Die NTS und PVN kann einen unterschiedlichen Phosphorylierung-Mechanismus (unter Nährstoffmangel) aus anderen Regionen zu nutzen und refraktär gegenüber den Auswirkungen der Nährstoff-Insuffizienz. Diese Daten zufolge Kollektiv Gehirn Reaktionen auf Nährstoff-Insuffizienz Stress durch Signalisierung von Kolostrum grundiert Enterozyten ausgeglichen sind.
Einleitung
Im Gegensatz zu unserem Verständnis der frühen Entwicklung des Gehirns im Laufe von Tagen bis Wochen nach der Geburt auftreten, ist relativ wenig über die Vielzahl von dynamischen Veränderungen in den ersten Stunden des Lebens in Ratten bekannt. Eine zentrale Herausforderung wurde die geringe Größe des Gehirns neonatalen Ratte und eine Voraussetzung für High-Tech-Werkzeuge, diskrete Hirnregionen oder einzelne Zellen zu isolieren. Studien beurteilen oft gen Transkription und keine Übersetzung1,2, die kein festes Verständnis der funktionalen Ebenen der aktivierten Signalmoleküle geben. Andere untersuchen Ausdruc....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Diese Studie wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse an der Columbia University und der New York State Psychiatric Institute genehmigt.
(1) Gewebe-Vorbereitung
- Bestellen Sie zeitgesteuerte trächtigen Ratten vom Hersteller.
- Folgen Sie zeitgesteuerten trächtigen Ratten durch die Beobachtung ihrer wachsenden Bäuche in den Wochen nach ihrer Ankunft und anschließend auf der Suche nach Welpen auf den voraussichtlichen Liefertermin durch die Überprüfung des Käfigs alle 2 h bis Lieferung beginnt.
- Welpen mit einer behandschuhten Hand ihren Schwanz vor ihr erstes Futter für ungestrichenen Welpen....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die repräsentative Bands Immunoreactivity bezogen auf Gesamt-Protein zeigen, dass es Gehirn Kerne mit sehr niedrigen geschlagenem Eiweiß. Dies erfordert die Verwendung der automatisierten Western-Blot-Technik, die sehr empfindlich im Vergleich zu den kanonischen Western-Blot ist. Dieser Ansatz kann mit fortyfold weniger Protein pro Kapillare im Vergleich zu der pro-Spur in Western Blots ausgeführt werden.
Differentielle Effekte von.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Eine Technik zur Mikrodissektion von diskreten, OTR-reiche Gehirn Kerne im neonatalen Rattengehirn wird in diesem Papier präsentiert. Es ist bekannt, dass Neuronen hoch, sogar innerhalb von gut charakterisierten Kerne im Gehirn spezialisiert sind. Diese hoch reproduzierbare Herangehensweise an bestimmte OTR-reiche Kerne isolieren kann robuste Hypothesentests. Verwendung von automatisierten Western blotting, waren die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse weiter verbessert. Während eine Einschränkung dieser Tec.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren danken für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung dieses Protokolls Manon Ranger und Alexandra Schulz.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bradford-Lösung | Bio Rad | ||
| Protein-Lyse-Kit | Protein einfach | CBS403 | Bicine/CHAPS |
| WES-Kits | Protein einfach | WES-Maus 12-230 Master-Kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 Master-Kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa insgesamt Protein-Master-Kit (PS-TP07) | |
| Anti-Maus-IgG HRP-Konjugat | Protein einfach | ||
| Kaninchen anti-phospho-eIF2a | Zellsignaltechnologie | SER51, 9721 | |
| Maus mAb anti-PKR | Zellsignaltechnologie | 2103 | |
| Kaninchen anti-phospho-PKR | Millipore | Thr451, 07-886 | |
| Kaninchen mAb anti-PKR | Zellsignaltechnologie | 12297 | |
| Kaninchen mAb anti-GAPDH | Zellsignaltechnologie | 2118 | |
| Maus-mAb Anti-Phospho-IKB-Zell-Signaltechnologie | 9246 | ||
| Maus-mAb Anti-IKB-Zell-Signaltechnologie | 4814 | ||
| Kaninchen Anti-BiP-Zell-Signaltechnologie | 3183 | ||
| Kaninchen Anti-GCN2-Zell-Signaltechnologie | 3302 | ||
| Kaninchen mAb Anti-Phospho-GCN2 | BIORBYT | T899 | |
| schwanger Sprague-Dawley Ratten | Charles River Laboratories | ||
| Stanzgerät | WellTech Rapid Core oder Harris Uni-Core | 0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50 |
Referenzen
- Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
- Okabe, A., et al.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
