Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.
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Methodenartikel
Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die elektrische Aktivität der Zellen in den Geweben durch elektrophysiologische Techniken überwacht werden kann, aber diese sind in der Regel auf die Analyse der einzelnen Zellen beschränkt. Da eine Erhöhung der intrazellulären Kalzium (Ca2 +) in die Zellflüssigkeit oft aufgrund der elektrischen Aktivität tritt oder in Reaktion auf eine Vielzahl von anderen reizen, dieser Prozess sich durch lässt die Darstellung der Zellen mit fluoreszierenden Calcium-Sensitive geladen Farbstoffe. Allerdings ist es schwierig, diese Antwort in einer einzelnen Zelle Art im gesamten Gewebe Bild, da diese Farbstoffe durch alle Zelltypen im Gewebe entnommen werden. Im Gegensatz dazu genetisch codierte Kalzium Indikatoren (GECIs) können durch eine einzelne Zelle Art ausgedrückt werden und fluoreszieren in Reaktion auf eine Erhöhung der intrazellulären Ca2 +, erlaubt die Bildgebung von Ca2 + in der gesamten Bevölkerung der Signalisierung einzelnen Zelltypen. Hier wenden wir die Verwendung von GECIs GCaMP3/6 auf der Maus neuromuskulären Synapse, eine dreigliedrige Synapse zwischen Motoneuronen, Skelettmuskel und Terminal/Perisynaptic Schwann-Zellen. Wir zeigen den Nutzen dieser Technik im klassischen ex Vivo Gewebe Vorbereitungen. Mit Hilfe eines optischen Splitters, führen wir Dual-Wellenlänge Bildgebung der dynamischen Ca2 + Signale und eine statische Beschriftung der neuromuskulären Synapse (NMJ) in einem Ansatz, der an zwei zellspezifische GECI oder genetisch codierte Spannung überwachen leicht angepasst werden könnte Indikatoren (GEVI) gleichzeitig. Schließlich diskutieren wir die Routinen verwendet, um räumliche Karten der Fluoreszenzintensität zu erfassen. Zusammen, können diese optischen, transgenen und analytische Techniken eingesetzt werden, um die biologische Aktivität der Zelle unterschiedliche Subpopulationen bei NMJ in einer Vielzahl von Kontexten zu studieren.
Einleitung
NMJ, wie alle Synapsen besteht aus drei Elementen: ein präsynaptischen Terminal abgeleitet eines Neurons, einer postsynaptischen Neuron/Effektor-Zelle und eine Perisynaptic glial cell1,2. Während die grundlegenden Aspekte der synaptischen Übertragung dieser Synapse3erstmals nachgewiesen wurden, bleiben viele Aspekte dieses Prozesses unbekannt, teilweise aufgrund der Ausdruck der gleichen Moleküle durch die ausgeprägte zelluläre Elemente dieser Synapse. Beispielsweise werden Rezeptoren für die Purin Adenin Nukleotide ATP und Acetylcholin (ACh), die von Motoneuronen bei Wirbeltieren NMJ C....
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Protokoll
Tierhaltung und Experimente wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und die IACUC an der University of Nevada durchgeführt.
1. Vorbereitung von Membranen und phrenicus Nerven von transgenen Mäusen
- Kaufen Sie Transgene Mäuse und Oligonucleotide Zündkapseln, Genotyp dieser Mäuse.
Hinweis: Die Primer werden für jede dieser Mäuse auf der Seite "Informationen" aufgeführt.- Züchten von 3 bis 6 Monate alte Maus mit dem Ausdruck eine Kopie des entsprechenden transgene/Knock-in Cre-Fahrer-Allels und NULL Kopien des Allels bedingte GCaMP3/6 mit....
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Ergebnisse
Mehrere Beispiele für Fluoreszenz Intensität Änderungen, vermittelt durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2 + in bestimmten Zelltypen von NMJ, zeigt das Dienstprogramm dieses Ansatzes. Diese Ergebnisse werden als räumliche Fluoreszenz Intensität Karten, präsentiert die geben die Position der antwortenden Zellen sowie die Intensität ihrer Antworten, so dass für die Bewertung von wie viele Zellen reagieren und wie viel jeder Zelle reagiert auf ein bestimmtes Reiz. Zum Beispie.......
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Diskussion
Hier stellen wir einige Beispiele für Ca2 + Antworten in bestimmte Zellen in intaktem neuromuskuläre Gewebe mit Hilfe von GECI exprimierenden Mäusen zu messen. Um diese Experimente erfolgreich durchführen zu können, ist es nicht unbedingt Nervus phrenicus während der Präparation zu verletzen. Um Ca2 + Antworten in Schwann-Zellen bei hohen oder niedrigen Leistung (d.h.20 X oder X 60) Bild, ist es notwendig, BHC oder µ-vor Block Bewegung zu verwenden. Für Niederleistungs-Bildgebung von Ca
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde mit Mitteln aus den National Institutes of Health (NIH) GM103554 und GM110767, (T.W.G.) und das National Center for Research Resources 5P20RR018751 und das National Institute of General Medical Sciences 8 P 20 GM103513 (zu G.W.H.) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Myf5-Cre Mäuse | Jax | #007893 | Treibt die Expression von Muskelzellen bereits ab E136 |
| Wnt1-Cre Mäuse | an Jax | #003829 | Treibt die Expression in alle Schwann-Zellen bei E13, aber nicht bei P209 |
| >Sox10-Cre | Mäuse Jax | #025807 | Treibt die Schwann-Zellexpression im höheren Alter an |
| Bedingte GCaMP3-Mäuse | Jax | #029043 | Exprimiert GCaMP3 auf zellspezifische Weise |
| Bedingte GCaMP6f-Mäuse | Jax | #024105 | exprimiert GCaMP6f auf zellspezifische Weise |
| BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-on) | Hit2Lead | #5102862 | Blockiert das Myosin der Skelettmuskulatur, aber nicht die Neurotransmission6 |
| CF594-α-BTX | Biotium | #00007 | Markiert Acetylcholinrezeptor-Cluster bei NMJ |
| µ-conotoxin GIIIb | Peptides Int'l | #CONO20-01000 | Blockiert Nav1.4 spannungsabhängiger Natriumkanal8 |
| Silikon Dielektrisches Gel; aka Sylgard | Ellswoth Adhesives | # Sil Dielec Gel .9KG | Ermöglicht die Ruhigstellung der Membran durch winzige Stifte |
| Winzige Stifte (0,1 mm Durchmesser) | Fine Science Tools | 26002-10 | Immobilisiert das Diaphragma auf dielektrischem Silikongel |
| Eclipse FN1 aufrechtes Mikroskop | Nikon | MBA74100 | Ermöglicht das Staging und die Beobachtung von Proben |
| Grundlegende stationäre Mikroskopplattform mit manuellem XY-Mikroskop-Übersetzer | Autom8 | MXMScr | Ermöglicht die Bewegung der Probe |
| Manueller Mikromanipulator | Narishige | M-152 | Hält Aufzeichnungs- und Stimulationselektroden |
| Mikroelektroden-Verstärker | Molecular Devices | Axoclamp 900A | Ermöglicht die intrazelluläre elektrophysiologische Aufzeichnung von scharfen Elektroden |
| Mikroelektroden rauscharmes Datenerfassungssystem | Molecular Devices | Digidata 1550 | Ermöglicht die elektrophysiologische Datenerfassung |
| Mikroelektroden-Datenanalysesystem | Molecular Devices | PCLAMP 10 Standard | Führt elektrophysiologische Datenanalysen durch |
| Rechteckwellenstimulator | Grass | S48 | Stimuliert den Nerv, um Muskeln zu erregen |
| Stimulus Isolation Unit | Grass | PSIU6 | Reduziert Stimulationsartefakte |
| Borosilikatfilamente, 1,0 mm Außendurchmesser, 0,5 mm Innendurchmesser | Sutter | FG-GBF100-50-15 | Spießt und zeichnet nervenevozierte Muskelpotentiale |
| Borosilikatfilamente, 1,5 mm Außendurchmesser, 1,17 mm Innendurchmesser | Sutter | BF150-117-15 | Verlängert und für Saugelektrode |
| verwendet Mikropipette Abzieher | Sutter | P-97 | Zieht und bereitet Aufzeichnungselektroden vor |
| 1200x1200 Pixel, rückwärtig belichtete cMOS-Kamera | Photometrics | Prime 95b | Empfindliche Kamera, die hochauflösende Hochgeschwindigkeitsaufnahmen ermöglicht |
| Lichtquelle | Lumencor | Spectra X | Bietet Beleuchtung durch LEDs für die Fluoreszenzbeobachtung |
| nbsp; Unendlich korrigierte fluoreszierende Wasserimmersionsobjektive, W.D. 2mm | Nikon | CFI60 | Bietet lange Arbeitsabstände für die Visualisierung von Proben |
| Faseroptische Beleuchtung mit Halogenlampe | Sumita | LS-DWL-N | Bietet Beleuchtung für die Hellfeldbeobachtung |
| W-View Gemini Image Splitter | Hamamatsu | A12801-01 | Projiziert 1 Paar Bilder mit zwei Wellenlängen, getrennt durch einen dichroitischen und einen einzigen |
| Kamera-Einzelband-Bandpassfilter (512/25-25 und 630/92-25) | SemRock | FF01-512/25-25; FF01-630/92-25 | Ermöglicht Dualband-Bildgebung |
| 560 nm Einkantiger dichroitischer Strahlteiler | Sem Rock | FF560-FDi01-25x36 | Dichroitischer Spiegel, der Lichtstrahlen trennt, um eine Bildgebung mit zwei Wellenlängen zu ermöglichen |
| Bilddatenerfassungssystem | Nikon | NIS Elements - MQS31000 | Ermöglicht die Aufnahme von |
| Bilddaten Wellenlängensteuermodul | Nikon | MQS41220 | Modul für Bilddaten acqusiition |
| Emissionssplitter Hardware-Modul | Nikon | MQS41410 | Modul zur Erfassung von Bilddaten |
| Analysesystem für Bilddaten | NA | Volumetry 8D5, Fidschi | Ermöglicht die Analyse der Fluoreszenzintensität und anderer Bilddaten |
Referenzen
- Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Development of the vertebrate neuromuscular junction. Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).
- Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple func....
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Nachdrucke und Genehmigungen
