Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

Jonathan G.T. Lam; Chi Song; Stephanie Seveau

doi:10.3791/58351

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Methodenartikel

Hochdurchsatz-Messung der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugerzellen

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DOI:

10.3791/58351

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7. Januar 2019

Jonathan G.T. Lam¹^,²^,³ , Chi Song⁴ , Stephanie Seveau¹^,²^,³

¹Department of Microbial Infection and Immunity, The Ohio State University, ²Department of Microbiology, The Ohio State University, ³Infectious Diseases Institute, The Ohio State University, ⁴Division of Biostatistics, College of Public Health, The Ohio State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Fluoreszenz basierende Assays, die die Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz durch fluorometrisch und bildgebende Untersuchungen in lebenden Zellen misst. Dieser Test kann verwendet werden, für das screening von Drogen oder Zielgene, die Plasmamembran Wiederverschließen in Säugetierzellen zu regulieren.

Zusammenfassung

In ihrer physiologischen Umgebung sind Säugerzellen häufig mechanischen und biochemischen Belastungen ausgesetzt, die Plasmamembran Schäden zur Folge haben. In Reaktion auf diese Schäden verschließen komplexen molekularen Maschinen schnell der Plasmamembran für die Wiederherstellung der Barrierefunktion und Überleben der Zellen zu erhalten. Trotz 60 Jahre Forschung in diesem Bereich fehlen uns noch ein gründliches Verständnis der Zelle Wiederverschließen Maschinen. Mit dem Ziel der Identifizierung von Zellkomponenten haben dieser Kontrolle Plasmamembran Wiederverschließen oder Medikamenten, die Wiederverschließen verbessern können, wir einen Fluoreszenz-basierte Hochdurchsatz-Assay entwickelt, der der Plasmamembran Wiederverschließen Effizienz in Säugetierzellen misst kultiviert in Mikrotiterplatten. Als Modellsystem für die Plasmamembran Schaden, sind bakterielle Pore-forming Toxin Listeriolysin O (LLO), bildet große 30-50 nm Durchmesser proteinhaltige in Cholesterin-haltige Poren Zellen ausgesetzt Membranen. Die Verwendung eines Lesers temperaturgeführte Multimode Mikrotestplatte ermöglicht rasche und sensible Spectrofluorometric Messungen in Kombination mit Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie-Imaging lebender Zellen. Kinetische Analyse durch eine Membran impermeant Nukleinsäure-bindenden Fluorochrom emittiert Fluoreszenz-Intensität reflektiert das Ausmaß der Membran Verwundung und Wiederverschließen auf Bevölkerungsebene Zelle, so dass für die Berechnung der Zelle Wiederverschließen Effizienz . Fluoreszenz-Mikroskopie-Bildgebung ermöglicht die Aufzählung der Zellen, die konstitutiv ausdrücken eine fluoreszierende Chimäre aus der nuklearen Protein Histon 2 b, in jede Vertiefung der Mikrotestplatte, um mögliche Schwankungen in ihrer Anzahl zu berücksichtigen und können für eventuelle Identifizierung von unterschiedlichen Zellpopulationen. Dieser Hochdurchsatz-Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug erwartet, um unser Verständnis der Membran Reparaturmechanismen über Screening für Host Gene erweitern oder exogen hinzugefügt, dass Kontrolle Plasmamembran Wiederverschließen Verbindungen.

Einleitung

Säugerzellen unterliegen mechanischen, osmotische und biochemischer Stress, was zum Verlust der Integrität der Plasmamembran. Ohne schnelle und effiziente Wiederverschließen, würde geschädigte Zellen programmierten oder nekrotischen Tod schnell erliegen. Seit den 1960er Jahren haben Bemühungen um die Plasmamembran Wiederverschließen Prozess verstehen von den verheerenden Folgen, verbunden mit seiner Funktionsstörungen motiviert. In der Tat sind Krankheiten wie Muskeldystrophie Limb-Gürtel, Diabetes und Chediak-Higashi-Syndrom mit mangelhaft Plasmamembran Reparatur durch Mutationen im gen Kodierung Dysferlin, Produktion von advanced Glycation Endprodukte und defekte ve....