Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie

7.8K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/58355

⸱

17. August 2018

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Sciences, Institute for Research in Biomedicine, Università della Svizzera italiana (USI), 2Graduate School of Cellular and Molecular Sciences, Faculty of Medicine, University of Bern, 3Institute of Computational Science, Università della Svizzera italiana (USI)

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur zwei-Photon intravitalen Bildgebung und Zelle Interaktionsanalyse in der murinen trachealen Schleimhaut nach Infektion mit Influenza-Virus führen. Dieses Protokoll wird für Forscher Immunzelle Dynamik bei Atemwegsinfektionen relevant sein.

Zusammenfassung

Die Analyse der Zell-Zell oder Zelle-Pathogen Interaktion in Vivo ist ein wichtiges Instrument zum Verständnis der Dynamik der Immunantwort auf eine Infektion. Zwei-Photonen-Mikroskopie intravitalen (2P-IVM) ermöglicht die Beobachtung des Zell-Interaktionen im tiefen Gewebe in lebenden Tieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Immunofluoreszenz während der Bildaufnahme generiert. Bisher wurden verschiedene Modelle für 2P-IVM der lymphatischen und nicht-lymphatischen Organe beschrieben. Bildgebung der Atmungsorgane bleibt jedoch eine Herausforderung durch die Bewegung der Atemzyklus des Tieres zugeordnet.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur in-Vivo Immunzelle Interaktionen in der Luftröhre von Mäusen mit 2P-IVM mit Influenza-Virus infiziert zu visualisieren. Zu diesem Zweck entwickelten wir eine benutzerdefinierte Image Plattform, die die chirurgische Exposition und Intubation der Trachea, gefolgt von der Übernahme von dynamischen Bildern von Neutrophilen und dendritischen Zellen (DC) in der Schleimhaut-Epithel enthalten. Darüber hinaus detaillierte wir die notwendigen Schritte zur Grippe intranasale Infektion und Flow durchflusszytometrischen Analyse von Immunzellen in der Luftröhre führen. Zu guter Letzt haben wir Neutrophilen sowie DC Motilität und deren Wechselwirkungen im Laufe eines Films analysiert. Dieses Protokoll ermöglicht für die Erzeugung von stabilen und helle 4-D-Bilder für die Beurteilung der Zell-Zell-Interaktionen in der Luftröhre.

Einleitung

Zwei-Photonen-Mikroskopie intravitalen (2P-IVM) ist eine effektive Methode zur Echtzeit imaging von Zell-Zell-Interaktionen, wie sie in ihrer natürlichen Umgebung1vorkommen. Der Hauptvorteil dieser Methode ist, dass es die Untersuchung von zellulären Prozessen eine größere Tiefe der Probe (500 µm bis 1 mm ermöglicht) im Vergleich zu anderen herkömmlichen bildgebenden Techniken2. Zum gleichen Zeitpunkt minimiert den Verbrauch von zwei niederenergetischen Photonen durch die zwei-Photonen-Laser erzeugt die Foto-Gewebeschäden in typischer Weise mit dem Bild Erwerb Prozess2verbunden. Während des letzten Jahrzehnts ist 2P-IVM angewendet worden, um verschiedene Arten von Zell-Zell-Interaktionen in mehreren Disziplinen3,4,5zu studieren. Diese Studien wurden besonders relevant zu untersuchen Immunzellen, die sich durch ihre hohe Dynamik und die Bildung von prominenten Kontakte nach erzeugten Signale von anderen Zellen und Umwelt auszeichnen. 2P-IVM wurde auch angewendet, um die Wechselwirkungen zwischen Erreger und Wirt6zu studieren. In der Tat hat bisher gezeigt, dass einige Krankheitserreger die Art und Dauer der Kontakte zwischen Immunzellen behindern, infolgedessen die Immunantwort7verändern können.

Die Schleimhaut der Atemwege ist die erste Website, in der die Immunantwort gegen Krankheitserreger in der Luft ist,8erzeugt. In Vivo Analyse der Erreger-Wirt-Interaktionen in diesem Gewebe ist daher entscheidend für die Einleitung der Wirt Abwehrmechanismen während der Infektion zu verstehen. 2 P-IVM der Atemwege ist jedoch anspruchsvoll vor allem durch die Artefakte produziert von den Atemzyklus des Tieres, die den Prozess der Bildaufnahme beeinträchtigt. Vor kurzem wurden verschiedene chirurgische Modelle für bildgebende murinen Luftröhre9,10,11,12 und Lunge13,14,15beschrieben, 16. Trachealen 2P-IVM-Modelle stellen eine ausgezeichnete Einrichtung, die erste Phase der die Immunreaktion in den oberen Atemwegen zu visualisieren, während Lungen-Alveolen 2P-IVM Modelle besser geeignet sind, um der späten Phase der Infektion zu studieren. Die entwickelten Lunge Modelle präsentieren eine Einschränkung verbunden mit der Anwesenheit von luftgefüllten Alveolen, die optische Eindringtiefe des Lasers zu beschränken und die Darmschleimhaut des Hämoglobin Atemwege unzugänglich für in-Vivo imaging17 . Umgekehrt erleichtert die Struktur der Luftröhre, gebildet durch eine kontinuierliche Epithel Bildaufnahme.

Hier präsentieren wir eine Protokoll, die eine detaillierte Beschreibung der auszuführenden Influenza-Infektion, chirurgische Vorbereitung der Tiere und 2P-IVM der Luftröhre erforderlichen Schritte enthält. Darüber hinaus beschreiben wir eine bestimmte Versuchsanordnung zur Visualisierung von Neutrophilen und dendritischen Zellen (DC), zwei Arten von Immunzellen, die eine wichtige als Vermittler der Abwehrmechanismus gegen Influenza Virus18,19 Rolle . Schließlich beschreiben wir ein Verfahren zur Neutrophilen-DC Interaktionen zu analysieren. Diese Kontakte haben gezeigt, dass DC-Aktivierung zu modulieren und anschließend auf die Immunantwort gegen Krankheitserreger20auswirken.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle tierische Verfahren, die mit Mäusen, in Übereinstimmung mit dem Bundesamt für Veterinärwesen Richtlinien und tierischen Protokolle durchgeführt wurden wurden von den örtlichen Tierarzt Behörden genehmigt.

1. Influenza-Infektion CD11c-YFP Mäuse

  1. Biologische Sicherheit
    Hinweis: Die Maus angepasst-Stamm von A/Puerto Rico/8/34 H1N1 Influenza (PR8) war in befruchteten Eiern gewachsen, gereinigt und titriert als zuvor beschriebenen21. Alles, was die Schritte, die mit infizierten Tieren oder biologischen Proben wurden im Rahmen eines Biosafety Schrank nach Biosafety Niveau (BSL) 2 Bedingungen.
    1. Reinigen Sie das Biosafety-Kabinett mit 70 % Ethanol-Lösung vor und nach der Behandlung der Infektion.
    2. Entsorgen Sie alle Abfallstoffe produziert während dieses Vorgangs nach richtig, die Biosicherheits-Richtlinien (http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf). Entsorgen Sie feste Abfälle in autoklavierbar Lagerplätze und kontaminierte Flüssigkeiten in Plastiktüten mit 70 % igem Ethanol-Lösung oder einem medizinischen Desinfektionsmittel gefüllt.
  2. Intranasale Infektion mit dem Influenza
    HINWEIS: B6. CG-Tg(Itgax-Venus) 1Mnz/J (CD11c-YFP)22 auf C57BL/6J Hintergrund wurden in dieser Studie verwendet. Mäuse wurden in bestimmten Pathogen-freies Einrichtung am Institut für Forschung in der Biomedizin beibehalten.
    1. Legen Sie maximal 5 Alter und Geschlecht-abgestimmt (sechs bis acht Wochen alten) CD11c-YFP Mäusen pro Käfig. Warten Sie mindestens zwei Tage für Mäuse Akklimatisierung zu Wohnverhältnissen vor der Infektion.
    2. Tauen Sie PR8 Lager ab und bereiten Sie die entsprechenden Verdünnung mit kalten 1 X Dulbeccos Phosphat-Puffer Kochsalzlösung ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid (PBS) geändert, um eine Endkonzentration von 200 Plaque bildende Einheiten (PFU) zu erhalten in 30 µL. halten Sie Virus Verdünnung auf dem Eis während des gesamten Verfahrens.
      Hinweis: Titration von jeder Charge des Influenza-Virus vor der Verwendung wird empfohlen, eine präzise Infektion Dosis zu gewährleisten.
    3. Eine Dosis von Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) intraperitoneale Injektion (i.p.) mit einer 26 G Nadel 1 mL Spritze.
    4. Warten Sie, bis die Maus vollständig betäubt (vollständiger Verlust der aufrichtenden und Pedal Rückzug Reflex) ist. Tiefe Anästhesie ist notwendig für eine optimale Infektion, da nicht vollständig narkotisierten Mäuse werden schlucken oder das Virus Inokulum, was zu Schwankungen in der Infektion Dosis zu vertreiben.
    5. Platzieren Sie die narkotisierten Maus in Rückenlage. Sammle 15 µL des Inokulums Virus. Setzen Sie die PIPETTENSPITZE in der Nähe der Maus linke Nasenloch und verzichten Sie das virale Inokulum tropfenweise zu. Wie Tropfen inhaliert werden müssen, pipette sie nicht direkt in die Nase Hohlraum.
    6. Warten Sie 2 – 5 min und setzen Sie die PIPETTENSPITZE mit den verbleibenden 15 µL des Inokulums Virus in das rechte Nasenloch.
      Hinweis: Zur Vermeidung von Erstickungsgefahr verzichten Sie, kleine Tropfen in ca. 20 s-Intervallen.
    7. Überprüfen Sie, ob die Maus richtig atmet und legen Sie sie in einem Käfig in seitlichen Dekubitus. Überwachen Sie Maus Atmung und Anästhesie Recovery (ca. 60 min nach Induktion).
      Hinweis: Es ist möglich, mehr als 1 Maus gleichzeitig zu infizieren. In diesem Fall virale Inokulum in das linke Nasenloch alle Mäuse in einer Sequenz zu verwalten, für 2 – 5 min warten und dann das Virus in das rechte Nasenloch zu verwalten. Zur Vermeidung von Variabilität zwischen einzelnen Personen infizieren Sie nicht mehr als 3 Mäuse zur gleichen Zeit.
    8. Tiergesundheit-Status und Gewicht-Verlust täglich zu überwachen.
    9. Einschläfern Sie Mäuse nach der humane Endpunkt durch die Behörde-Richtlinien bestimmt. Die Euthanasie-Methode muss von den Tierversuchen Behörden genehmigt werden und ethischen Vorschriften einzuhalten. Nach zwei-Photonen-Experimenten einschläfern Sie Mäuse durch Verabreichung einer Überdosis von Ketamin/Xylazin gefolgt von zervikale Dislokation. Verwenden Sie in den anderen Experimenten CO2 Einatmen als Methode zur Sterbehilfe.
      Hinweis: Um die virale Titer von infizierten Luftröhre, 50 % Gewebekultur Infektionsdosis (TCID50) Assay oder Real-Time Polymerase-Kettenreaktion zu messen kann (RT-PCR) Assay als zuvor beschriebenen23durchgeführt werden.
  3. Bewertung der Neutrophilen Rekrutierung in der Luftröhre durch Durchflusszytometrie
    Hinweis: Dieser Teil des Protokolls ist optional. Ziel ist es, Neutrophilen Rekrutierung in trachealen Schleimhaut nach Influenza-Infektion zu bewerten.
    1. Infizierte und nicht infizierte kontrollmäusen am 3. Tag nach der Infektion (p.i.) durch CO2 Inhalation einschläfern.
      Hinweis: Um trachealen Schäden zu vermeiden, vermeiden Sie die Verwendung von zervikale Dislokation, Tiere einzuschläfern. Darüber hinaus empfiehlt sich die Perfusion der euthanasierten Mäuse zur Vermeidung von Kontaminationen aus Blut neutrophile.
    2. Sprühen Sie den Maus-Hals mit 70 % igem Ethanol-Lösung und führen Sie einen Hautschnitt mit Chirurgische Schere von der Brust bis zum Kinn.
    3. Trennen Sie die Speicheldrüsen mit Pinzette und Aussetzen der Luftröhre.
    4. Die Muskeln um die Luftröhre mit Zange und Schere zu sezieren.
      Hinweis: Dieser Schritt muss sorgfältig ausgeführt werden, da die Luftröhre während des Eingriffs leicht beschädigt werden könnte.
    5. Halten der Luftröhre mit Pinzette und lösen Sie vorsichtig die Speiseröhre, indem Dissektion.
    6. Halten Sie den Brustraum Teil der Luftröhre mit der Pinzette, einen Einschnitt machen Sie am Anfang des Bronchialbaumes. Lösen Sie dann die Luftröhre vom Kehlkopf und entfernen Sie vorsichtig alle Muskulatur Links.
    7. Legen Sie die Orgel in einem 1,5 mL Röhrchen mit RPMI 1640 + HEPES Medium (RPMI) auf Eis.
    8. Bereiten die Enzym-Mischung für die Luftröhre Verdauung, mit 0,26 Einheiten/mL der Kollagenbildung (I und II) und 0,2 mg/mL der DNase I RPMI.
    9. Ort der seziert Luftröhre in einem 6-Well-Platte mit 1 mL der Enzym-Gemisch.
    10. Schneiden Sie die Orgel in kleine Stücke mit Hilfe von Pinzetten und Scheren. Halten Sie die Platte auf dem Eis während dieses Schritts.
    11. Inkubation bei 37 ° C für 45 Minuten. Während dieser Zeit schütteln Sie die Platte alle 15 Minuten.
    12. Stoppen Sie die Enzym-Verdauung durch Zugabe von 1 mL der FACS waschen Puffer (2 mM EDTA und 2 % Hitze-inaktivierten Filter sterilisiert fetalen bovine Serum (FBS)) mit PBS-Puffer.
    13. Aufschwemmen der Lösung mit einer 1-mL-Pipette dazu beitragen, um die teilweise unverdaute Teile des Gewebes zu distanzieren.
    14. Übertragen Sie die Lösung zu einem anderen Brunnen indem man den Inhalt durch ein 40 µm-Sieb. Dann zerschlagen Sie vorsichtig die restlichen Stücke des Organs auf das Sieb mit einer 2 mL Spritzenkolben gefangen.
      Hinweis: Smashing teilweise unverdaute Teile der Luftröhre über das Sieb ist ein wichtiger Schritt, um eine optimale Anzahl von Zellen während der durchflusszytometrischen Analyse zu erhalten.
    15. Waschen Sie den Brunnen und das Sieb mit FACS Wasch-Puffer und Übertragung der Suspension in der 5 mL-Tube auf Eis gehalten.
    16. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 166 X g für 5 min bei 4 ° C. Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL FACS waschen Puffer.
    17. Fahren Sie fort mit Antikörper für die Durchflusszytometrie Oberfläche Beflecken. Kurz, blockieren Sie Fc-Rezeptoren der isolierten Zellen unter Verwendung eines Antikörpers gegen CD16/32, gefolgt von Oberfläche Beflecken. Um neutrophile korrekt zu identifizieren, sollte der Flow Cytometry Panel die folgenden Antikörper enthalten: αLy6G, αCD11b, αCD45 sowie eine Lebensfähigkeit zu färben, abgestorbenen Zellen auszuschließen.
    18. Den gesamten Inhalt der Proben auf einem Durchflusszytometer ausführen und Analysieren der Daten.
      1. Um eine optimale Anzahl von Immunzellen zu erhalten, führen Sie die einzelnen Zellsuspension mit einer Geschwindigkeit nicht höher als 3.000 Veranstaltungen/s. Dies reduziert die Anzahl der Ereignisse während der Erfassung ausgeschlossen. Unter Verwendung dieses Protokolls, sollte es möglich, 1 bis 2 Millionen Zellen pro Luftröhre zu erhalten.

(2) Isolation und Injektion von Neutrophilen

Hinweis: In diesem Verfahren, B6.129 (ICR)-Tg (CAG-ECFP) CK6Nagy/J Mäusen (CK6-ECFP) waren verwendeten24. Diese Tiere express GFP in allen Zelltypen unter der menschlichen β-Aktin-Promoter. Alternativ ist es auch möglich mit Mäusen C57BL/6J Zellen zu isolieren und Färben sie gemäß dem Protokoll im Schritt 2.6 beschrieben. Die Reinigung und Handhabung der Neutrophilen erhöht ihren Aktivierungsstatus, möglicherweise verändern ihre wandernden und funktionellen Eigenschaften.

  1. Einschläfern des Tieres durch CO2 Einatmen.
  2. Oberschenkelknochen und Schienbeine zu entfernen und leicht zu reinigen mit Pinzette.
  3. Schneiden von Knochen Epiphysen und spülen Sie das Knochenmark mit einer 1 mL Spritze gefüllt mit sterilen kaltem PBS in einer 50 mL-Tube auf Eis gehalten.
  4. Aufschwemmen der Zellen mit einer 18 G-Nadel und die Zellsuspension mit einem 40 µm-Sieb filtern. Einmal waschen mit PBS bei 110 X g für 5 min bei 4 ° C und Zellen in 2 mL kaltem PBS aufzuwirbeln.
  5. 100 % verdünnen Percoll 9:1 in 10 X PBS und bereiten gradient Percoll 72 %, 64 % und 52 % mit 1 X PBS-Lösungen. Sorgfältig Schicht 2 mL eines jeden der drei Steigungen in der 15 mL Tube, ausgehend von den meisten konzentriert man.
    1. Fügen Sie vorsichtig 2 mL Knochenmark Zellsuspension auf Steigungen und Zentrifuge bei 1.100 X g für 30 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Beschleunigungs- und Bremsvorgänge.
  6. Sorgfältig entfernen Sie das Band an der Schnittstelle zwischen 64 und 72 % und einmal bei 200 X g für 5 min bei 4 ° C mit kaltem PBS waschen. Aufschwemmen Sie Zellen in einem Volumen von 100 μl PBS und halten sie auf dem Eis. Die Reinheit der Neutrophilen wird voraussichtlich mehr als 90 % betragen.
  7. Optional, Label Neutrophilen mit einer Zelle Verbreitung Kit mit der Hersteller-Protokoll. Die Zellsuspension auf eine Endkonzentration von 10 μM in einem Volumen von 1 mL der Farbstoff hinzu, bei 37 ° C für 30 min inkubieren Sie und waschen Sie (166 X g, 5 min).
  8. Zellkonzentration mit Hilfe eines Hemocytometer zu schätzen und intravenös 5 x 106 Zellen in einem maximalen Volumen von 100 μL in die zuvor infizierten CD11c-YFP+ -Mäuse mit einer 26 G Nadel 1 mL Spritze, 12 h vor der Bildgebung zu injizieren.

3. Vorbereitung der Maus für die Bildgebung

  1. Anästhesie
    1. Infizierten CD11c-YFP+ -Mäuse am Tag 3 Pi gemäß Schritt 1.2.3 zu betäuben.
    2. Wenn Mäuse tief betäubt sind, bereiten Sie einen Katheter für Anästhesie neu dosieren.
      1. Entfernen Sie eine 30 G-Nadel aus einer Spritze mit Pinzette.
      2. Stechen Sie die Nadel auf ein 20 cm Stück PE-10 medizinische Silikon Schlauch.
      3. Legen Sie eine 30 G Nadel Spritze gefüllt mit Ketamin/Xylazin-Mischung auf der anderen Seite des Rohres.
      4. Entfernen Sie die Luft im Inneren der Röhre.
    3. Bereiten Sie einen 20 G Katheter verbunden zu einem Schlauch von einer Sauerstoff insufflieren Maschine, automatische Lüftung (Abbildung 1Aich) beizubehalten. Setzen Sie ihn auf einem Atem-Verhältnis von 130 Schläge pro Minute (b.p.m.) mit einem Tidalvolumen von 0,2 mL mit 100 % Sauerstoff Gasversorgung.
  2. Bereiten Sie die Maus für die Chirurgie
    1. Halten Sie die Maustaste auf einem speziellen maßgeschneiderte chirurgische Brett (Abbildung 1AIi-Iii) über eine beheizte Platte oder eine chirurgische Wärmebank bei 37 ° C für die Zeit der Operation festgelegt.
    2. Rasieren die Haare aus dem Hals der Maus einen elektrischen Rasierapparat mit einer Enthaarungscreme (Abbildung 1 bich).
    3. Platzieren Sie den Mauszeiger über die Kunststoff Maus positionellen (Abbildung 1AIi-a), halten die Koepfe außerhalb der positionellen (Abbildung 1 bIi) einen Winkel zu erstellen, die die Intubation der Trachea erleichtert.
    4. Fixieren Sie die Vorderbeine, die Pfoten und die Rute mit chirurgischen Klebeband, Befeuchten Sie Maus Augen mit einem Gel Vitamin A angereichert und Desinfizieren Sie den Maus-Hals (Abbildung 1 bIi).
  3. Chirurgie
    1. Richtig autoklaviert Elemente, nämlich, Schere, mikrochirurgische Schere und Zange vorbereiten.
    2. Führen Sie einen kleinen Schnitt auf der lange mediale Achse des Halses, ca. 1 cm lang, im mittleren Bereich zwischen der oberen Brust und die Linie, die durch den unteren Punkt des Unterkiefers (Abb. 1 bIii).
    3. Seitlich zu verschieben, die Hautflecken und die Speicheldrüsen und Visualisieren der Luftröhre, durch die Muskeln bedeckt. Dann zerlegen Sie die trachealen Muskeln sorgfältig mit der Pinzette (Abbildung 1 bIii).
    4. Die Maus mit einem Katheter Intubation und künstliche Beatmung (Abbildung 1 biv) starten.
      Hinweis: Der Katheter besteht aus einem externen Kunststoff Teil schützt die trachealen Schleimhaut und eine innere Eisen-Nadel. Das Vorhandensein der Nadel ist die ideale Lösung zu erweitern und die Luftröhre zu stabilisieren und seine Exposition zu regulieren. Künstliche Beatmung durch den Katheter wird richtiges Atmen der Maus garantieren.
    5. Sofort beginnen Sie die künstliche Beatmung Monitor Maus atmen.
    6. Befestigen Sie den Katheter Höhe und Ausrichtung mit einem chirurgischen Haken (Abbildung 1 bV) an die spezifischen Stab auf die chirurgischen Kammer (Abbildung 1AIi-b) angeschlossen. Setzen Sie die Luftröhre auf gleicher Höhe des Kinns.
    7. Einkreisen der Luftröhre mit Vaseline und bedecken Sie es mit ein paar Tropfen des vorgewärmten PBS, ausreichende Flüssigkeitszufuhr, die Orgel (Abbildung 1 bvi) zu gewährleisten.
    8. Montieren Sie das Deckglas auf der Vorbereitung. Kleben Sie für diesen Schritt ein Deckglas auf einem Metallhalter (Abbildung 1 bVii), die an den XYZ-Übersetzer (Abbildung 1AIi-c) geschraubt werden. Anpassen des XYZ-Übersetzers um das Deckglas auf die chirurgische Vorbereitung zu platzieren.
    9. Legen Sie den Katheter für die Verwaltung der Narkose intraperitoneal (Abbildung 1 bViii).
    10. 50 % der Initialen Dosis von Ketamin/Xylazin-Mischung alle 30 min. zu injizieren.
      Hinweis: Erneut Dosierung von 50 % auf 25 % der ursprünglichen Ketamin/Xylazin-Mischung ist eine sichere und gültige alternative25. Da dieses Protokoll terminal ist und eine strenge Immobilisierung des Tieres während des gesamten Verfahrens erforderlich ist, verwenden Sie jedoch höhere Dosierungen ein tief chirurgische Flugzeug der Narkose aufrechtzuerhalten.

4. in Vivo Zeitraffer Imaging

Hinweis: Bildaufnahme erfolgte mit einem aufrecht zwei-Photonen-Mikroskop, ausgestattet mit zwei Ti:Sa-Lasern, temperaturgeführte Inkubation Kammer und ein 25 X / NA 1.1 Wasser eintauchen Ziel. Die Photomultiplier (PMT) verwendet für die Bildaufnahme waren entweder Hybrid Detektoren oder hohe Empfindlichkeit GaAsP.

  1. Platzieren Sie die chirurgische Board mit der narkotisierten Maus innerhalb der Mikroskop-Inkubation-Kammer (37 – 38 ° c vorgewärmt) und Tropfen Sie einen Wasser auf das Deckglas.
  2. Zentrum finden Sie fokussieren und die trachealen Gewebe.
  3. Stellen Sie die Scan-Frequenz bis 800 Hz mit 520 x 520 Pixel, ein Sichtfeld von 440 x 440 μm2 und Zeile durchschnittlich 1.
    1. Melodie Ti:Sa Laser, 830 nm second harmonic Generation (SHG) von Kollagen mit einer indikativen Leistung an der Quelle von 150 begeistern mW. Melodie den zweiten Ti:Sa-Laser bei 920 nm mit 94 mW an der Quelle, CFP und YFP begeistern.
    2. Aufbau der 3D und Zeitraffer Akquisitionsmodus mit gleichzeitiger Anregung
      Hinweis: Halten Sie die Laserleistungen so gering wie möglich zu Immunofluoreszenz und Phototoxizität zu minimieren.
  4. Rekord Fluoreszenz über zwei Kanäle in nicht descanned Modus mit einem master dichroitischen Spiegel bei 560 nm. In der Konstellation in diesem Protokoll verwendeten, ein zweite Dichroitischer Spiegel teilen das Signal bei 495 nm trennen Kanal 1 (Emission Filter 475/50) von Kanal 2 (Emission Filter 525/50) (Abbildung 2A). Diese Konfiguration sammelt SHG Licht von Kollagen in den ersten Kanal, während GFP Emission in beiden Kanälen 1 und 2 erhobenen ist und YFP wird nur in Kanal 2 gesammelt.
  5. Definieren Sie einen Bereich 50 μm entlang der Z-Achse mit einer Schrittweite von 3 μm (Voxel Größe 0,86 μm X 3 μm). Datensatz Bilder alle 30 s für eine Gesamtdauer von 30 Minuten.
  6. Auf Wunsch erwerben Sie mehrere Regionen. Vor der Ausführung weitere Akquisitionen, Vitalfunktionen überprüfen und Wiedereinleitung Anästhesie durch den Katheter bei Bedarf (siehe Schritt 3.3.10).
  7. Am Ende den imaging-Prozess einschläfern Sie die Maus durch Ketamin/Xylazin-Überdosis gefolgt von zervikale Dislokation.

5. Bild-Verarbeitung und quantitativen Analyse der Neutrophilen-DC Motilität und Interaktion

Hinweis: In diesem Protokoll wurde eine spezielle imaging-Software für die Datenanalyse der Mikroskopie verwendet.

  1. Nachdem 4D Bildaufnahme abgeschlossen ist, übertragen Sie die Dateien (Daten und Metadaten) auf einer Arbeitsstation mit ausreichend computational Ressourcen (vorgeschlagen Mindest-Systemanforderungen: 32 GB RAM, schnelle solid-state-Laufwerke, aktuelle CPU, GPU, die auf der Grundlage gewidmet eine massiv parallele Architektur).
  2. Öffnen Sie die Dateien in der imaging-Software.
  3. Spielen Sie das Video und sicherzustellen Sie, dass die Zellen von Interesse deutlich sichtbar sind und bildgebenden Artefakte fehlen.
    Hinweis: dazu, sicherzustellen, dass sowohl die Bewegung der Probe und der helligkeitsvariation sind ausreichend beschränkt. In der Tat handelt es sich um Herausforderungen für die automatische Analyse-26. Wenn die Bewegung der Probe zwischen angrenzenden Frames zu hoch ist, gelten Sie eine Drift-Korrektur-Methode, beispielsweise mit Hilfe des SHG-Kanals als eine feste Referenz. Dies ermöglicht besseres Maß der Bewegung der Zellen und nicht die Bewegung der Probe. Darüber hinaus im Beisein von hellen Hintergrund oder Schmutz, beschneiden Sie die rekonstruierten Oberflächen mit Volumen als ein Selektionsparameter.
  4. Generieren Sie eine Co-Lokalisierung-Kanal speziell für GFP+ Zellen, um das Signal zwischen GFP und das Kollagen (SHG) zu trennen. Bezeichnen Sie zu diesem Zweck ein gating Polygon (Abb. 2 bich), die nur die Voxel haben eine positive Intensität in den grün-Kanal und in den blauen Kanal auswählt.
    Hinweis: Dieses Verfahren variieren je nach eingestellten Filter des Mikroskops und die Färbung der Zellen. Es kann erreicht werden, indem Sie nur Voxel mit ausreichender Intensität im grünen und blauen Kanal auswählen. Die Funktionalität "Coloc" ist unter den verfügbaren Tools lässt sich anhand der Intensität Schnittstellenüberwachung ns1-Kanal automatisch zu berechnen. Darüber hinaus können Methoden basierend auf Computerlernen für diesen Schritt mit der Aufsicht von einem erfahrenen27verwendet werden.
  5. Erkennen und verfolgen von GFP+ Zellen, mit automatischen Flächenrückführung und tracking-(Oberfläche Tool) über den entsprechenden Co-Lokalisierung-Kanal.
    Hinweis: Manuelle Kuration von eventuellen Tracking-Fehlern und Ausgrenzung von Tracks mit einer Dauer kürzer als eine definierte Schwelle (d.h., 150 s) können erforderlich sein.
  6. Generieren Sie eine Co-Lokalisierung-Kanal speziell für CD11c-YFP+ Zellen, um CFP und YFP Signale zu trennen. Bezeichnen Sie zu diesem Zweck ein gating Polygon (Abb. 2 bIi), die nur die Voxel eine positive Intensität in den grün-Kanal, sondern eine geringe Intensität in den blauen Kanal auswählt.
    Hinweis: repräsentative mikrographen zeigt die Signale von Kanal 1, Kanal 2 Co Lokalisierung Kanal für GFP, Co Lokalisierung Kanal für YFP und die Kombination aller Kanäle finden Sie in Abbildung 2 bIii.
  7. Rekonstruieren Sie die Oberfläche der CD11c-YFP+ Zellen zu und verfolgen Sie ihre Position im Laufe der Zeit (Oberflächen-Werkzeug).
    Hinweis: Manuelle Korrektur von eventuellen Tracking-Fehlern ist nicht erforderlich für diesen Schritt. Tatsächlich aufgrund der komplexen räumlich-zeitliche Dynamik der DC ist rekonstruieren ihre genaue Oberfläche aus 2P-IVM-Daten eine herausfordernde Aufgabe, die mit verfügbaren Segmentierung Software erreicht werden kann. Unter den Gründen, die diese Aufgabe schwierig machen, erlauben dünne Vorsprünge und Helligkeitsschwankungen nicht für die Nutzung von bestimmten Bildverarbeitungs-Techniken, wie glätten Filter oder statische Schwellwerte. Darüber hinaus in einem Netzwerk von DC ist es schwierig, einzelne Zellen basierend nur auf ihr Aussehen in 2P-IVM Daten trennen. Aus diesen Gründen, anstatt zu versuchen eine genaue Segmentierung durch Software-Parameter optimieren schlagen wir nicht genaue Oberflächen von DC zu rekonstruieren. Dann behandeln Sie die möglichen Fehler durch robuste Metriken wie in 5.8 beschrieben.
  8. Zellwanderung zu messen.
    1. Exportieren Sie die klassische Migration Maßnahmen für GFP+ und CD11c-YFP+ Zellen. Unter diesen zeigt "Track Geschwindigkeit bedeutet" wandernden Durchschnittsgeschwindigkeit der Zellen während der "track Geradheit" Direktionalität der Zellen anzeigt. Diese Maßnahmen können als eine Tabellenkalkulationsdatei von imaging-Software exportiert werden.
    2. In der exportierten Tabellenkalkulationsdateien berechnen die "korrigierten Track Geradheit" (auch als korrigierte Entbindung Verhältnis bezeichnet) für GFP+ und CD11c-YFP+ Zellen, die ist definiert als "Track Geradheit" multipliziert mit der Quadratwurzel der "Dauer-track" dividiert durch die Quadratwurzel aus der Videodauer. Diese Maßnahme ist robuster als "track Geradheit" im Beisein von kurzer28 Titel, stammen zum Beispiel von Tracking-Fehlern.
      Hinweis: mit dieser Maßnahme können nur Videos von der gleichen Länge verglichen werden.
  9. Zelle Interaktion zu messen.
    1. Definieren Sie einen Kontakt zwischen einer GFP+ -Zelle und einer CD11c-YFP+ -Zelle, wenn ihre Entfernung (am nächsten Voxel) kleiner oder gleich als ein Schwellenwert (d. h. 2 μm).
      Hinweis: Diese Schwelle sollte ausreichend strenge, einen Kontakt zu erkennen, nur wenn Zellen in der Nähe sind. Wir empfehlen jedoch, um diese Schwelle größer als 0, im Idealfall N-mal größer als der Voxel-Radius zu halten (N > 2), weil Rand glätten die Rekonstruktion der Zellen kleiner als die tatsächliche Zellengröße machen kann.
    2. Zählen Sie die Anzahl und die Dauer der Kontakte zwischen GFP+ und CD11c-YFP+ Zellen. In der imaging-Software kann dies zum Beispiel durch die Ausführung einer "kiss and run" Plug-in erfolgen. Diese Maßnahmen können als eine Tabellenkalkulationsdatei von der Registerkarte "Statistik" exportiert werden.
  10. Importieren Sie die zuvor berechneten Maßnahmen in einer Statistik-Software, generieren Sie die Grundstücke zu und durchführen Sie statistische Tests.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

In dieser Arbeit beschriebenen wir einem detaillierten Protokoll in Vivo zu studieren die Motilität und die Wechselwirkungen zwischen Neutrophilen und DC während der Influenza-Infektion in murinen Luftröhre (Abb. 3A). Zu diesem Zweck isoliert wir GFP+ Neutrophilen (92 % Reinheit; Abb. 3 b) von CK6-ECFP übertragen Mäuse und wir adoptively sie in eine CD11c-YFP Maus mit Grippe infiziert. Danach führten wir 2P-IV...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieses Werk stellt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von 4D Bilder zeigen die Migration der adoptively übertragenen Neutrophilen und ihrer Wechselwirkungen mit DC während einer Influenza-Infektion in der Maus Luftröhre. Die beschriebenen 2P-IVM-Modell werden Immunzelle Dynamik während einer Infektion in den Atemwegen zu studieren.

Vor kurzem, wurden mehrere Modelle basieren auf der Visualisierung von Zelldynamik in den Atemwegen entwickelten9,

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF) Stipendien (176124, 145038 und 148183), der Europäischen Kommission Marie Curie Wiedereingliederungsbeihilfe (612742) und SystemsX.ch nach einer Finanzierungsmöglichkeit für D.U.P (2013/124).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gigasept instru AFSchü LKE & Mayr GmbH4%ige Lösung
CD11c-YFP MäuseJackson Laboratories008829Mäuse wurden hauseigene
CK6-ECFP MäuseJackson Laboratories004218Mäuse wurden hausintern gezüchtet
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Kochsalzlösung modifiziert ohne Calciumchorid und MagnesiumchloridSigmaD8537-500ML
10x Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, modifiziert ohne Calciumchorid und MagnesiumchloridSigmaD1408-500ML
Percoll PLUSSigmaE0414-1LBei 4° lagern; C
Ketamin Labatec LabatecPharma7680632310024Store at RT, Store at 4 ° C in Lösung des Ket/Xyl-Gemisches
Rompun 2% (Xylazin)Bayer6293841.00.00Bei RT lagern, lagern bei 4 > C in Lösung eines Ket/Xyl-Gemisches
26 G 1 mL Sub-Q BD PlastipakBD Plastipak305501
30 G, 0,3 mL BD Mikrofeine InsulinspritzenBD324826
Falcon 40 & micro; m Cell StrainerCorning352340
2 mL SpritzenBD Plastipak300185
Microlance 3x 18 G NadelnBD304622
Introcan Safety 20 G (Katheter)Braun4251652.01
6 Well Zellkultur-ClusterCostar3516
RPMI Medium 1640 + HEPES (1x)ThermoFisher Scientific42401-018Lagern bei 4°; C
Liberase TL Roche5401020001Grade Bei -20 & Grad lagern; C / Kollagenase (I und II) Gemisch
DNAse IAmresco (VWR)0649-50KUBei -20 > lagern; C
CellTrace Violetter FarbstoffThermoFisher ScientificC34557Bei -20 & Grad lagern; C
EDTASigmaEDS-500G
Fötales KälberserumGibco10270-106Bei -20 ° lagern; C
PE-10 Micro Medical Tubing2Biologische Instrumente SNC#BB31695-PE/1
Chirurgisches KunststoffbandM Plast
ViscotearsBausch & LombStore at RT
PlastilinOhropax
High Tolerance Glasdeckglas 15 mm RundWarner Instruments64-0733
SomnoSuite Tragbares TieranästhesiesystemKent ScientificSS-01
Nuvo Lite mark 5GCE medline14111211
MiniTag (gasförmige Anästhesie und Heizbank)Tem Sega
SURGICAL BOARDUniversität Bern
TrimScope II Zwei-Photonen-MikroskopLaVision Biotec
Chameleon Vision Ti:Sa LaserCoherent Inc.
25X NA 1.05 Wasser-ImmersionsobjektivOlympusXLPLN25XWMP2
Der Würfel& Die Box Inkubationskammer und TemperaturreglerLife Imaging Services
Imaris 9.1.0BitplaneImaging Software
GraphPad Prism 7GraphPadStatistische Software
gezüchtet Research

Referenzen

  1. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  2. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
  3. Fein, M. R., Egeblad, M. Caught in the act: revealing the metastatic process by live imaging. Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 580-593 (2013).
  4. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).
  5. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annual review of immunology. 26, 585-626 (2008).
  6. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System. Science. 336 (6089), 1676-1681 (2012).
  7. Coombes, J. L., Robey, E. A. Dynamic imaging of host-pathogen interactions in vivo. Nature Reviews Immunology. 10 (5), 353-364 (2010).
  8. Pulendran, B., Maddur, M. S. Innate Immune Sensing and Response to Influenza. Life Science Journal. 6 (4), 23-71 (2014).
  9. Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza- specific CD8 + T cells in the airways. Science. 349 (6252), (2015).
  10. Kim, J. K., et al. In vivo imaging of tracheal epithelial cells in mice during airway regeneration. American journal of respiratory cell and molecular biology. 47 (6), 864-868 (2012).
  11. Kretschmer, S., et al. Autofluorescence multiphoton microscopy for visualization of tissue morphology and cellular dynamics in murine and human airways. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 96 (8), 918-931 (2016).
  12. Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Scientific Reports. 7 (1), 694(2017).
  13. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nature. 8 (1), 91-96 (2011).
  14. Thornton, E. E., Krummel, M. F., Looney, M. R. Live Imaging of the Lung. Current Protocols in Cytometry. 60 (1), (2012).
  15. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. Journal of Applied Physiology. 104 (2), 338-346 (2008).
  16. Fiole, D., et al. Two-photon intravital imaging of lungs during anthrax infection reveals long-lasting macrophage-dendritic cell contacts. Infection and immunity. 82 (2), 864-872 (2014).
  17. Secklehner, J., Lo Celso, C., Carlin, L. M. Intravital microscopy in historic and contemporary immunology. Immunology and Cell Biology. 95 (6), 506-513 (2017).
  18. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Lung Dendritic Cells in Respiratory Viral Infection and Asthma: From Protection to Immunopathology. Annual Review of Immunology. 30 (1), 243-270 (2012).
  19. Camp, J. V., Jonsson, C. B. A role for neutrophils in viral respiratory disease. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
  20. van Gisbergen, K. P. J. M., Sanchez-Hernandez, M., Geijtenbeek, T. B. H., van Kooyk, Y. Neutrophils mediate immune modulation of dendritic cells through glycosylation-dependent interactions between Mac-1 and DC-SIGN. The Journal of experimental medicine. 201 (8), 1281-1292 (2005).
  21. Gonzalez, S. F., et al. Capture of influenza by medullary dendritic cells via SIGN-R1 is essential for humoral immunity in draining lymph nodes. Nature Immunology. 11 (5), 427-434 (2010).
  22. Lindquist, R. L., et al. Visualizing dendritic cell networks in vivo. Nature immunology. 5 (12), 1243-1250 (2004).
  23. Li, H., et al. Human Vγ9Vδ2-T cells efficiently kill influenza virus-infected lung alveolar epithelial cells. Cellular and Molecular Immunology. 10 (2), 159-164 (2013).
  24. Tran Cao, H. S., et al. Development of the transgenic cyan fluorescent protein (CFP)-expressing nude mouse for "technicolor" cancer imaging. Journal of Cellular Biochemistry. 107 (2), 328-334 (2009).
  25. Jaber, S. M., et al. Dose regimens, variability, and complications associated with using repeat-bolus dosing to extend a surgical plane of anesthesia in laboratory mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science JAALAS. 53 (6), 684-691 (2014).
  26. Pizzagalli, D. U., et al. Leukocyte Tracking Database, a collection of immune cell tracks from intravital 2-photon microscopy videos. Scientific Data. , In press (2018).
  27. Sommer, C., Straehle, C., Kothe, U., Hamprecht, F. A. Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit. 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. , 230-233 (2011).
  28. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., De Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  29. Keller, H. U. Motility, cell shape, and locomotion of neutrophil granulocytes. Cell motility. 3 (1), 47-60 (1983).
  30. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital Microscopy. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
  31. Lambert Emo, K., et al. Live Imaging of Influenza Infection of the Trachea Reveals Dynamic Regulation of CD8+ T Cell Motility by Antigen. PLOS Pathogens. 12 (9), e1005881(2016).
  32. Kjos, M., et al. Bright fluorescent Streptococcus pneumoniae for live-cell imaging of host-pathogen interactions. Journal of bacteriology. 197 (5), 807-818 (2015).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Bildgebung der TrachealschleimhautInteraktion zwischen Neutrophilen und dendritischen ZellenDurchflusszytometrische AnalyseChirurgische Freilegung der TracheaIntranasale Influenza InfektionIsolation von Neutrophilen aus dem KnochenmarkPercoll DichtegradientAnalyse der Motilit t von Immunzellen
Bildgebung Zelle Interaktion in Trachealen Schleimhaut während der Influenza-Virus-Infektion mit Intravitalen zwei-Photonen-Mikroskopie
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.