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Methodenartikel

Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose

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DOI:

10.3791/58358

⸱

26. Februar 2019

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigación Sanitaria, 2Unidad de Animalario del Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), 3Departamento de Pediatría, Obstetricia y Ginecología, Universidad de Valencia, 4Servicio de Obstetricia y Ginecología, Hospital Clínico Universitario de Valencia

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für live-Aufnahmen von Eindringmittel beschriftete menschliche endometrialen Fragmente bei Mäusen verpflanzt. Die Methode ermöglicht das untersuchen die Auswirkungen der Medikamente der Wahl auf die Größe der nichtmalignem Läsion durch Überwachung und Quantifizierung der Fluoreszenz emittiert von fluoreszierenden Reporter in Echtzeit

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Durchführung einer heterologen Mausmodell, in dem Fortschreiten der Endometriose in Echtzeit durch eine nicht-invasive Überwachung der Fluoreszenz emittiert von implantierten ektopische menschlichen endometrial Gewebes beurteilt werden kann. Zu diesem Zweck werden Spender Frauen laufenden Eizellspende Biopsien des menschlichen Endometrium entnommen. Menschlichen endometrialen Fragmente sind im Beisein von Adenoviren entwickelt, um ausdrückliche cDNA für Reporter fluoreszierendes Protein mCherry kultiviert. Bei der Visualisierung beschriftet Gewebe mit einer optimalen Rate der Fluoreszenz nach Infektion werden anschließend für die Implantation im Empfänger Mäuse ausgewählt. Eine Woche vor der Implantation Operation Empfänger Mäuse oophorectomized und Estradiol Pellets sind subkutan aufgestellt, um das Überleben und Wachstum der Läsionen aufrecht zu erhalten. Am Tag der Operation sind Mäuse narkotisierten und peritonealen Hohlraum erreicht durch einen kleinen (1,5 cm) Schnitt durch die Linea Alba. Eindringmittel beschrifteten Implantate sind tweezed, kurz in Klebstoff getränkt und die peritoneale Schicht an. Einschnitte vernäht, und Tiere übrig, um für ein paar Tage zu erholen. Fluoreszenz emittierten nichtmalignem Implantate wird in der Regel nicht-invasiv alle 3 Tage für 4 Wochen mit einer in-vivo imaging-System überwacht. Variationen in der Größe von nichtmalignem Implantaten können in Echtzeit durch Quantifizierung des mCherry Signal und Normalisierung gegen die anfängliche Zeit-Punkt zeigen maximale Fluoreszenzintensität geschätzt werden.

Traditionelle präklinischen Nagetiere von Modellen der Endometriose nicht erlauben, nicht-invasive Überwachung der Läsion in Echtzeit aber eher erlauben Bewertung der Auswirkungen von Drogen am Endpunkt untersucht. Dieses Protokoll ermöglicht es, Läsionen in Echtzeit verfolgen und ist nützlicher, das therapeutische Potenzial von Drogen in präklinischen Modellen der Endometriose zu erkunden. Die wichtigste Einschränkung des so erzeugten Modells ist, dass nicht-invasives monitoring über längere Zeit wegen der episomal Ausdruck des Ad-Virus nicht möglich ist.

Einleitung

Endometriose ist eine chronische gynäkologische Erkrankung, initiiert durch die Implantation der funktionellen Gebärmutterschleimhaut außerhalb der Gebärmutterhöhle. Ektopische Läsionen wachsen und entzündliche Prozessen führt zu chronischen Becken-Schmerz und Unfruchtbarkeit1zu induzieren. Es wird geschätzt, dass bis zu 10 – 15 % der Frauen im gebärfähigen Alter von endometriosis2 betroffen sind, und es ist in ca. 40 – 50 % der unfruchtbaren Frauen3. Aktuellen pharmakologische Behandlungen für Endometriose sind nicht in der Lage, vollständig auszurotten Läsionen und nicht frei von Nebenwirkungen4,5. Die Forschung für eine effizientere Therapien braucht der Verfeinerung von bestehenden Tiermodellen der Endometriose in einer Weise, dass menschliche Läsionen können entsprechend nachgeahmt, und die Auswirkungen der Verbindungen auf die Größe der Läsion unter anderem genau beurteilt werden können.

Primas Modelle wurden verwendet, um die Endometriose zu imitieren, durch Implantation ektopische Läsionen, die histologisch identisch und an ähnlichen Standorten wie in Menschen6,7,8; jedoch im Zusammenhang mit ethische Bedenken und der hohen volkswirtschaftliche Kosten experimentieren mit Primaten Begrenzung ihrer Verwendung-9. Daher weiterhin die Verwendung von kleinen Tieren, vor allem Nagetiere, für die Umsetzung von in Vivo Modellen der Endometriose bevorzugt werden, da es Studien mit einer größeren Anzahl von Personen10,11erlaubt. Endometriose kann bei diesen Tieren induziert werden, durch die Transplantation entweder Stücke von Nagetier uterine Hörner ("homologe Modelle")12,13 oder menschlichen Endometrium/nichtmalignem Gewebe, ektopische Websites (heterologe Modelle)14 . Im Gegensatz zu Menschen Nager ihre endometrial Gewebes nicht vergossen und somit Endometriose nicht entwickelt werden kann spontan in dieser Arten. Homologe Maus, die Modelle der Endometriose kritisiert wurden die ektopische Maus uterine Gewebe implantiert spiegelt daher nicht die Eigenschaften des menschlichen nichtmalignem Läsionen15.

Entsprechende Physiologie der Endometriose kann in die heterologe Modelle der Endometriose nachgeahmt werden, wo frische menschliche endometrialen Fragmente immungeschwächte Tiere implantiert werden. In herkömmlichen heterologen Modellen werden die therapeutischen Wirkungen von Verbindungen des Interesses häufig am Endpunkt durch die Beurteilung der Größe der Läsion mit dem Einsatz von Bremssättel16bewertet. Eine offensichtliche Einschränkung ist, dass als solche Endpunkt Tiermodelle nicht zulassen Implantation Dynamik oder nichtmalignem Läsion Entwicklung im Laufe der Zeit zu studieren. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Verwendung der Bremssättel genaue Messungen der Größe der Läsion nicht zulässt. In der Tat ist der Standardfehler von Bremssättel zur Verfügung gestellt in der gleichen Größenordnung wie die Größe der Läsionen implantiert bei Mäusen, so beschränken die Kapazität dieser Werkzeuge, tatsächliche Abweichungen in der Größe zu erkennen (z.B. Millimeter).

Um solche Einschränkungen zu überwinden, beschreiben wir hier die Generation der heterologen Mausmodell der Endometriose in der implantiertes menschlichen Gewebe entwickelt, um ein Reporter m-Cherry fluoreszierende Protein zum Ausdruck bringen. Erkennung von das Fluoreszenzsignal mit einem entsprechenden Image-System ermöglicht nichtinvasive Überwachung der Läsion Status mit gleichzeitige Quantifizierung dieser Größe in Echtzeit. So sieht unser Modell klare Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Endpunkt Modelle wie es bringt die Möglichkeit, nicht-invasive Überwachung in Echtzeit und die Möglichkeit, weitere Objektive und präzise Einschätzung der Variationen in Größe der Läsion führen.

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Protokoll

Die Verwendung von menschlichem Gewebeproben wurde von Institutional Review Board und Ethik-Kommission der Hospital Universitario La Fe genehmigt. Alle Patienten zur Verfügung gestellt schriftliche Einwilligungserklärung. Die Studie an Tieren institutionelle Tier Pflege des Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia genehmigt wurde, und alle Eingriffe wurden nach den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Säugetieren aus den nationalen Ämtern der Gesundheit.

(1) endometrial Gewebes Erfassung und Vorverarbeitung

  1. Erhalten Sie eine gute Qualität Biopsie des menschlichen Endometrium Absaugen mittels einer Kanüle mit einer Saugvorrichtung verbunden. Gießen Sie die Biopsie in ein Fläschchen mit 10 mL steriler Kochsalzlösung und waschen mit sanften manuellen Agitation.
    Hinweis: Verfahren wie Sie erhalten gute Qualität Biopsien wurden zuvor beschriebenen17.
  2. Waschen Sie die Biopsie der verbleibenden Blut oder Schleim. Wiederholen Sie den Vorgang durch das Gießen des Gewebes, Fläschchen mit frische Kochsalzlösung möglichst viele Zinken nach Bedarf bis Gewebe sauber eingehalten wird.
  3. Transfer Biopsie Fragmente mit einem gesunden Aussehen in eine Lösung mit 10 mL komplett Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) Medium mit 10 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 1 % Antibiotikum antimykotische Lösung.
  4. Gießen Sie den Inhalt in einer 10 cm Petrischale und fahren Sie mit der Gewebe in 5 – 10 mm3 Stücke mit einem Paar Skalpelle zu hacken.

(2) adenoviralen Transfektion von endometrialen Fragmente

Hinweis: Alle Materialien, die dabei eingesetzt werden sollten im Voraus in der Haube eingeführt werden. Nehmen Sie alles, was nicht geht, im Prozess verwendet werden und eine Flasche mit Bleichmittel. Sämtliches Material, das in Kontakt mit der adenoviralen Vektor kommt muss mit dem Bleichmittel desinfiziert werden, bevor im Biohazard Container verwerfen.

  1. Sobald die Biopsie gehackt hat, nehmen Sie eine neue Petrischale. Pipette mehrere 30-50 µL DMEM Tropfen Ausbreitung die ganze Schüssel. Lassen Sie genügend Abstand zwischen Tropfen, so dass sie nicht in Berührung kommen.
  2. Unterstützt mit einer Nadel Spritze, legen Sie ein Stück des Fragments in jedem der mittleren Tropfen.
    Hinweis: Jeder Tropfen sollte ein einziges Stück des Endometriums enthalten.
  3. Bereiten Sie die Ad-mCherry-Arbeitslösung durch Verdünnung 01:20 von mCherry adenoviralen Stammlösung [1 x 1010 Pfu/mL]) in DMEM ohne Antibiotika (DMEM + 10 % gefiltert FBS) mittlere.
  4. 100 – 200 μL der Ad-mCherry-Lösung pro Bohrloch auf eine 96-Well-Platte, füllen so viele Brunnen wie Fragmente in der Petrischale Tropfen (Schritt 2.2 sind) zu verzichten. Darüber hinaus füllen Sie mindestens 3 Brunnen mit Adenoviren kostenlose DMEM Medium als Negativkontrolle.
  5. Unterstützt mit einer Nadel Spritze, jedes der Fragmente in der Petrischale (Schritt 2.2) zu jedem der Brunnen mit Ad-mCherry-Lösung in der 96-Well-Platte zu übertragen.
  6. Legen Sie die 96 Well-Platte mit der endometrialen Fragmente mit Ad-mCherry-Lösung in einem Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 16 h.
  7. Auswaschen der verbleibenden Adenoviren in das Medium durch die Übertragung von Gewebe in eine neue 96-Well-Platte mit kompletten DMEM Medium gefüllt (mit Antibiotika-Antimykotika, frei von Adenoviren) und mit 5 % CO2 für 24 – 48 h bei 37 ° C inkubieren.
    Hinweis: Denken Sie daran, mit Bleichmittel decken alle well-Platten und Tipps, die in Kontakt mit Ad-Virus kam vor verwerfen in den Biohazard Behälter.
  8. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und legen Sie es unter dem Fluoreszenzmikroskop auf 568 nm (Rot-Kanal) für optimale Kennzeichnung zu testen.
  9. Wählen Sie die brillantesten Fragmente und legen Sie sie in eine neue 96-Well-Platte mit frischen kompletten DMEM Medium (Adenoviren mit Antibiotika-Antimykotika, kostenlos).
  10. Dichtplatte gut mit einem Kunststoff Paraffin-Film und in den spezifischen-Pathogen-freies Tier Bereich für die Implantation der endometrialen Fragmente in Empfänger Tiere zu transportieren.

3. Generation von der Endometriose-Maus-Modell

Hinweis: Verwenden Sie 6 – 8 Wochen-alte Athymic nackt (oder ähnliche immungeschwächten Stämme) weiblichen Mäusen unter bestimmten Bedingungen Pathogen-freies, als Empfänger Tiere untergebracht. Zur Vermeidung von Zyklus-abhängige Hormonschwankungen und gleichzeitig Kraftstoff Läsion Wachstum mit Estradiol sind Tiere ovariectomized und platzierten mit 60-Tage-Release-Kapseln enthalten 18 mg 17 βeta-Estradiol (17β-E2). Zurückliegend und Pellet Platzierung müssen mindestens eine Woche im Vorfeld der Pfropfung endometrialen Fragmente in den Empfänger Tieren durchgeführt werden.

  1. Zurückliegend
    Hinweis: Bereiten Sie chirurgische sterilisierte Material in eine Kapuze. Anästhesie-Geräte und eine postoperative Erholung Zone bereit im selben Raum vorbereiten.
    1. Führen Sie eine subkutane Injektion von Morphin-Derivat in einer Dosis von 5 mg/kg pro Maus. Lassen Sie die Mäuse ausruhen für 30 min nach der Injektion, also als Analgetika Wirkungen der Droge manifestiert werden können.
    2. Verbinden Sie die Inhalation Anästhesie Ausrüstung und lassen Sie Sauerstoff und Isofluran (2 % mg/kg) Strom für ein paar Minuten in einer versiegelten Anästhesie-Kammer.
    3. Stellen Sie das Tier in die Isofluran-Narkose-Kammer. 3 – 5 min warten Sie und überprüfen Sie, dass Tiere vollständig betäubt sind, indem eine seiner Pfoten. Übertragen Sie das Tier auf den OP-Bereich und erhalten Sie Anästhesie zu, indem man eine Maske mit kontinuierlichen Fluss von Isofluran Gas für die Atemwege.
    4. Führen Sie nach der Desinfektion mit Chlorohexidine einen quer 0,5 cm kostalen Schnitt etwa auf der Höhe der Hüfte mit einer scharfen Schere.
    5. Trennen Sie die Haut vom Muskel erhalten Zugang zur Bauchhöhle, identifizieren weiße Fettpolster, die den Eierstock umgibt und Zurückziehen des Eierstocks mit Dissektion Zangen.
    6. Einen Knoten um die Eileiter mit resorbierbaren Naht und ziehen Sie es dafür geeignete Blutstillung vor den Eierstock besteuert.
    7. Schließen Sie die Muskelschicht mit 6-0 resorbierbaren Naht, und schließen Sie dann die Haut mit 6-0 nicht resorbierbaren Naht. Reinigen Sie den Bereich wieder mit einer antiseptischen Lösung.
    8. Wiederholen Sie den Vorgang um die Contra seitliche Eierstock zu entfernen.
  2. Estradiol pellet-Implantat
    Hinweis: Achten Sie darauf, dass das Tier während der Operation zurückliegend, Pellets an diesem Punkt setzen betäubt ist.
    1. Unmittelbar nach dem Abschluss des Verfahrens zurückliegend reinigen Sie die Haut mit einer antiseptischen Lösung rund um den Hals und machen Sie einen Schnitt quer subkutane klein (0,5 cm) mit einer scharfen Schere im Nacken.
    2. Verwenden Sie die Schere, um die Haut vom Muskel, so dass eine Tasche groß genug, um die Platzierung der Pellets zu ermöglichen zu zergliedern.
    3. Legen Sie die Tablette mit 18 mg 17β-E2 und die Haut mit einer 6-0 nicht resorbierbaren Naht zu Naht. Reinigen Sie den Bereich wieder mit einer antiseptischen Lösung.
    4. Legen Sie das Tier im Bereich Erholung und verwalten Sie eine optimale Dosis der lang anhaltende Analgesie, die Erholungsphase zu erleichtern.
  3. Endometrial Implantat-Chirurgie
    Hinweis: Lassen Sie mindestens einen Zeitraum von sieben Tagen Quarantäne um vollständige Genesung von Tieren nach zurückliegend vor Beginn der Endometrium Fragments Implantation Operation zu ermöglichen. Für optimale Synchronisation mit Kennzeichnung des Gewebes sammeln Sie die Biopsie 2 – 3 Tage vor der Implantation Operation um langfristige Kultur der Explantate zu vermeiden.
    1. Bereiten Sie die OP in der Freizone spezifischen Erreger im Voraus. Bereiten Sie die Haube mit allen erforderlichen chirurgisches Material, das Anästhesie-Equipment und die postoperative Erholung Zone auch.
    2. Bringen Sie die Tiere in den Raum zu, führen Sie eine subkutane Injektion von Morphin-Derivat in einer Dosis von 5 (mg/kg) in jeder Maus. Lassen Sie die Mäuse für 30 min nach der Injektion ruhen, so dass Analgetika Effekte der Droge manifestiert werden können.
    3. Verbinden Sie die Inhalation Anästhesie Ausrüstung und lassen Sie Sauerstoff und Isofluran (2 % mg/kg) Strom für ein paar Minuten in einer versiegelten Anästhesie-Kammer.
    4. Bewegen Sie vor Beginn der Operation sich die Platte mit Gewebekulturen beschriftet Fragmente (aus Schritt 2.10) in die Haube entsiegeln sie und gießen Sie die Fragmente in einer Petrischale zur einfacheren Handhabung.
    5. Stellen Sie das Tier in die Isofluran-Narkose-Kammer. 3 – 5 min warten Sie und überprüfen Sie, dass Tiere vollständig betäubt sind, indem eine seiner Pfoten. Übertragen Sie das Tier auf den OP-Bereich und erhalten Sie Anästhesie zu, indem man eine Maske mit kontinuierlichen Fluss von Isofluran Gas für die Atemwege.
    6. Ort der narkotisierten Tier gerecht werden. Die ventralen Fläche zu desinfizieren. Führen Sie einen longitudinale 1,5 cm Schnitt im Bauch mit einer scharfen Schere und trennen Sie die Haut aus dem Muskel zu. Führen Sie dann einen longitudinale 1,5 cm Einschnitt in der Muskulatur auf der Bauchhöhle zugreifen.
    7. Halten Sie den linken Rand der muskulösen Bauch Wand mit Mini-Zange und Falten Sie es versuchen, die Innenfläche des Bauchfells nach außen verfügbar zu machen.
    8. Nehmen Sie ein Endometriumkarzinom Implantat mit Mini-Pinzette, ein n-Butyl-Ester Cyanacrylat-Klebstoff kurz einziehen Sie und legen Sie sie auf das Peritoneum, wo es angebracht wird, erhalten. Für ein paar Sekunden trocknen lassen. Wiederholen Sie die Schritte 3.3.6 und 3.3.7 um ein Implantat auf der kontralateralen Seite des Bauchfells zu platzieren.
    9. Schließen Sie die Muskelschicht mit einer resorbierbaren 6-0-Naht, und anschließend der Haut mit einem nicht resorbierbaren Naht 6-0. Reinigen Sie den Bereich wieder mit einer antiseptischen Lösung.
    10. Legen Sie das Tier im Bereich Erholung und verwalten Sie eine optimale Dosis der lang anhaltende Analgesie zu.

(4) in Vivo Fluoreszenz Imaging mit einem In Vivo Imaging-System

  1. In-vivo imaging Systemgerät schalten Sie ein, initialisieren Sie das Programm und ermöglichen Sie die CCD-Kamera für ein paar Minuten abkühlen lassen.
  2. Bereiten Sie die Inhalation Anästhesie Ausrüstung. Öffnen Sie Isofluran bei 2 % für ein paar Minuten um die Narkose Kammer füllen. Bereiten Sie die Post-Anästhesie-Erholung-Zone.
  3. Sobald das Programm gestartet hat und die CCD-Kamera abgekühlt sind, klicken Sie auf das Imaging-Assistent -Tool: eine Tutorial beginnt mit einer Reihe von aufeinander folgenden Windows angezeigt, jeweils entsprechend einen Parameter von Interesse mit mehreren Möglichkeiten gewählt werden mit einem Klick in das entsprechende Feld ein. Vorwärts durch das Tutorial durch Auswahl der entsprechenden Felder in jedem Fenster und klicken Sie auf die Schaltfläche OK , um zum nächsten Satz von Parametern mit der folgenden Sequenz bewegen.
    1. Wählen Sie das Epiluminescence Feld für die Fluoreszenz-Parameter, wählen Sie das mCherry Feld für die Paare-Parameter "Filter". Aktivieren Sie die Kontrollkästchen Modus zu fotografieren und Konzentrieren sich bestätigen und aktivieren Sie das automatische Belichtung Parameter.
  4. Sobald das Gerät eingerichtet hat, verschieben Sie ein Tier in der Anästhesie-Kammer. Wenn vollständig betäubt, übertragen Sie das Tier in der in-Vivo imaging System Käfig zu und legen Sie sie seitlich oben mit dem Kopf in ein Röhrchen mit dem Anästhesiegerät verbunden. Schließen Sie den Deckel, und klicken Sie auf erfassen für die Überwachung.
  5. Die Bilder erscheinen (insgesamt fünf Bilder, ein Bild für jedes Paar Filter ausgewählt) und Daten zu speichern, indem Sie auf die Schaltfläche " Speichern unter ". Bewegen Sie die Maus auf den Bereich der Post-Narkose Erholung. Wiederholen Sie den Vorgang mit den übrigen Tieren.
  6. Wiederholen Sie die Überwachung zwei oder dreimal pro Woche zum Anschluß das Signal entsprechend im Laufe der Zeit.
  7. Fahren Sie fort, das Tier am Ende den zeitlichen Verlauf von CO2 Erstickung zu opfern.

(5) Quantifizierung der In Vivo Fluoreszenz-Bilder

  1. Segregation der tatsächliche Fluoreszenz durch entmischen Bild:
    1. Öffnen Sie die In-Vivo Imaging Analyse Softwareprogramm gekoppelt.
    2. Wählen Sie die Datei "Sequenceinfo", um die Analyse zu starten. Zwei Fenster werden angezeigt: "Sequenzansicht" und "Werkzeugpalette". Wählen Sie die Werkzeugpalette und sobald das Menü wählen Sie die folgenden Optionen.
    3. Wählen Sie Korrekturen aus , und klicken Sie auf das Kontrollkästchen Adaptive FL Hintergrundabzug , die unerwünschte fluoreszierende Signale aus den leuchtenden Bilddaten zu entfernen. Wählen Sie die Schwelle von größtem Interesse und klicken Sie auf festlegen.
    4. Klicken Sie auf Spectral Unmixing, wählen Sie die Wellenlängen von Interesse, die Methode für unmixing (Bibliothek, geführte, automatische oder manuelle) ausgewählt und klicken Sie dann auf starten Unmix.
    5. Wählen Sie das entsprechende mCherry Signal Unmixed -Bild, und doppelklicken Sie auf. Ein neues Fenster erscheint mit das letzte Bild des Signals von Interesse.
    6. Wiederholen Sie Schritt 5.1.3.
    7. OPTIONAL: Wenn ein repräsentatives Bild (JPEG) des Unmix Ergebnisses benötigt wird, wählen Sie die gewünschten Einstellungen in Tool-Palette | Bild einstellen (Farbe, binning, Kontrast, etc.), und klicken Sie dann auf Exportieren Sie Grafiken im Fenster "Unmix" die aktuellen Bildansicht als Bild exportieren.
    8. Speichern Sie die ungemischte Datei: Datei | Speichern als | Wählen Sie Ordner und Ok.
    9. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem Rest der Überwachung Tage und mit allen Tieren.
  2. ROIs einrichten und Quantifizierung zu signalisieren
    1. Klicken Sie auf Durchsuchen und wählen Sie die ungemischte Datei (siehe Schritt 5.1.8) von Interesse, die analysiert werden. Ein neues Fenster wird angezeigt.
    2. Klicken Sie auf Add To List um die ungemischten Dateien von jedem Tier zu unterschiedlichen Zeitpunkten und klicken dann auf Als A Lastgruppe. Alle Bilder müssen als eine einzelne Sequenz angezeigt.
    3. Weiter zur Werkzeugpalette Fenster: Wählen Sie aus der Box ichgerne Maßstab um alle Bilder in der gleichen Größenordnung zu erhalten.
    4. Doppelklick in ein Bild der Sequenz und einen ROI in der Zone mit der folgenden Sequenz zu erstellen. Zur ROI-Tools und wählen Sie Contour und Auto 1 Option, klicken Sie auf die Form des Kreises erscheinen, legen Sie es in der Mitte das Fluoreszenzsignal und klicken Sie dann auf Erstellen auf das angezeigte Fenster.
      Hinweis: Dies automatisch highlights Pixel mit einer Intensität der Fluoreszenz über Hintergrundwerte (d.h. Läsion) und erzeugt eine Form, deren Gebiet die skizzierten Pixel umfasst.
    5. Die erstellten ROI-Form kopieren und Einfügen in ein Hintergrund-Zone wo kein Signal vorhanden ist.
    6. Klicken Sie auf Maß ROIs | Wählen Sie alle Werte der Fluoreszenzintensität anzuzeigen. Fahren Sie mit Datenwerte mit der Maus auswählen, Rechte Maustaste klicken, drücken kopieren und auf einem Arbeitsblatt einfügen.

6. Datennormalisierung (Fluoreszenzsignal)

  1. Wählen Sie die erste Zeitpunkt, an welches Signal Intensität maximal. Gehen Sie zum Signal zu jedem Zeitpunkt zu normalisieren, mithilfe der Formel:
    Signal-Intensität zu jedem Zeitpunkt / maximale Signalstärke beobachtet im Laufe der Zeit) X 100.

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Ergebnisse

Hier beschreiben wir das Verfahren zum Erstellen einer heterologen Modell der Endometriose, in dem die Architektur der Läsionen durch Implantation von Eindringmittel beschrifteten Teile des menschlichen Endometrium in immungeschwächte Mäuse erhalten bleibt, damit nicht-invasive Überwachung der Läsion Progression. Kennzeichnung von endometrialen Fragmente wird durch Infektion mit Adenoviren entwickelt, um ausdrückliche mCherry, ein Protein emittierende Fluoreszenz im nahen Infrarotbereich ...

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Diskussion

Das Protokoll hier detailliert beschreibt die Umsetzung von einem Tiermodell der Endometriose in die Architektur der Implantation Läsionen Architektur bewahrt wird während gleichzeitig ermöglicht Echtzeit-Bewertung der Fluoreszenz emittiert durch mCherry mit der Bezeichnung endometrial Gewebes. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung eines speziellen in-vivo imaging-System und zugehöriger Software nicht-invasiv Fluoreszenz emittierten die beschrifteten Läsion einzuschätzen. Jeder Benutzer sollte das Protokoll ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit durch Miguel Servet Programm [CP13/00077] mitgegründet von FEDER (europäischer Fonds für regionale Entwicklung) und Dr. R. Gómez sowie von Carlos III Institute of Health Stipendien vergeben Dr R Gómez [PI14/00547 und PI17/02329] und Prof. A. Cano [PI12/02582].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Endosampler&Handel;Medgyn22720Kanüle zur Probenahme des Gebärmutterendometriums
DMEM MediumVWRHYCLSH30285. FSMedium
Ad-mCherryVector Biolabs1767Adenoviraler Vektor, der mCherry PBS exprimiert
, 1x Lösung, steril, pH 7,4VWRE504-500MLPuffer für Waschmittel
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 TageInnovative Research of AmericaSE-121Hormonpellets für Nagetiere
Vetbond™ Tissue Adhesive3M780-680Tissue Adhesive
Petrischalen aus PolystyrolkristallLevantina367-P101VR20Petrischalen
Penicillin-StreptomicinSigmaP4333-100MLAntibiotika
Spritzen, medizinisch 10 mL 0,5 mlVWRCODA626616
Spritzen Nitrilhandschuhe, puderfreiVWR112-2754Handschuhe
Weiche Schweizer NacktmäuseCharles RiverSNUSSFE05SMäuse für Tierversuche
Ivis Spectrum In vivo BildgebungssystemPerkin Elmer124262In vivo Überwachungsgeräte
Lebendes Bild® (Ivis Software)Perkin ElmerIn-vivo-Überwachungssoftware
Fötales RinderserumGibco10082147Anreicherungsserum
96-Well-ZellkulturplattenLebenstechnologien167008Kulturplatten
UrinkolbenSummedical4004-248-001Flaschen für Waschungen
Sterile chirurgische Klingen(Aesculap Division) Sanycare1609022-0008Chirurgische Klingen
Isovet 1.000 mg/gB-BRAUNIsofluran (Anästhetikum)
Buprex® 0,3 mgSchering Plough S.A.---Buprenorphin (Analgetische Lösung)
Injizierbare Morphinlösung 10 mg/mlB BRAUNMorphin (Analgetische Lösung)
Monofyl® Resorbierbare NähteCOVIDIENNähte
Desinclor ChlorhexidinPromedic SAAntiseptische Lösung
Mikroskopie DMi8Leica Mycrosystems---Fluoreszenzmikroskop
Hera Cell 150 InkubatorThermo Scientific51026282Inkubator
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Referenzen

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