Eine präzise und autonomen System zur Erkennung von Insekten entstehen Muster

Das Timing der terrestrische Insekt Aufkommen im experimentellen Einstellungen genau zu messen ist notorisch schwierig und erfordert ein gewisses Maß an Automatisierung. In der Vergangenheit wurden verschiedene Mechanismen entwickelt mit entweder ein "fallen-Ball"-Prinzip, mit fallenden Kugeln und Sensoren oder eine "Bang-Box" mit einem Trichter-Art System^1,2,3. Es gibt zwei Einschränkungen mit bestehenden Designs: (1) die Datenerhebung ist nur teilweise automatisiert und (2) Stichprobengröße oder beschränkt sich die Anzahl der aufstrebenden Insekten, die erkannt werden können. Diese Probleme verringern Sie die Genauigkeit der Datenerfassung, die zum Studium Timing der Bewegungsapparate bzw. Entstehung Muster wichtig ist. Wir adressiert diese Probleme durch die Entwicklung eines Systems, das ist automatisiert und nicht begrenzt durch die Größe der Stichprobe, ermöglicht dem Anwender entstehen Rhythmen als Reaktion auf ökologische Signale besser zu visualisieren.

Unser System ist eine Verbesserung gegenüber dem fallenden Kugel-Prinzip, die neueste, das Version von denen Infrarot-Sensoren verwendet, um Insekten entstehen im sechs-Minuten-Schritten²erkennen. Unser System noch Infrarot-Sensoren verwendet, sondern beinhaltet auch ein Arduino-Mikrocontroller um Datum und Uhrzeit jeder Entstehung Veranstaltung auf die Sekunde genau aufzuzeichnen. Daten werden automatisch zu einer sicheren digital (SD)-Karte, die als durch Trennzeichen getrennte Datei zur Analyse exportiert werden können. Die Analyse erfolgt automatisch, mithilfe eines benutzerdefinierten R-Skripts, die grafische Darstellung der Daten als ein Blasendiagramm und identifizieren Sie die mediane Zeit und Tag der Entstehung.

Mehrere Kanäle ermöglichen dem Anwender mehr Flexibilität bei der Datenerfassung. Zum Beispiel unsere mehrere Channel-Design nicht nur minimiert die Auswirkungen eines "verstopft" Sensors, sondern kann auch verwendet werden, um Probe zu vergrößern. Darüber hinaus erlauben mehrere Kanäle dem Benutzer, Anwendungen auf bestimmte Kanäle zu benennen, so dass sie gleichzeitig in einem Experiment ausgeführt werden können. Alle sechs Kanäle ermöglicht ca. 1200 neue Bienen in einem einzigen Experiment erfasst werden. Nach unserer Kenntnis Dies ist die größte Stichprobengröße von jedem aktuellen System messen Insekten entstehen und hat uns erlaubt, feinskaligen entstehen Muster in Reaktion auf ökologische Hinweise zu beobachten. Schließlich unser System profitiert von der Tatsache, dass die Mehrheit der Teile 3D gedruckt. Dadurch entsteht genau dimensionierte Bauteile, das verringert die Wahrscheinlichkeit von Fehlern auftreten (z. B. Detektor Verstopfung) während des Betriebs. Es ermöglicht auch für die Anpassung für andere Forschungssysteme.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, benutzerdefinierte Build, die eine präzise und automatisierte System zur Messung von Insekten entstehen, zu untersuchen, in der Chronobiologie und Stress Physiologie zu Fragen. Dieses System wurde und wird weiterhin sein, kritisch bei der Untersuchung von unbeantworteten Fragen im Zusammenhang mit Insekten entstehen Muster in Reaktion auf ökologische Hinweise. Hier beschreiben wir die Montage und die Verwendung für Entstehung Erkennung der Luzerne Blatt-Schneiden Biene, Megachile Rotundata in Labor-basierte experimentelle Einstellungen. Das System ist automatisiert mit Hilfe eines programmierbaren Mikrocontrollers und anpassbare mit 3D gedruckte Teile. Gedruckte Regale halten im Ort Röhrchen mit Biene Nest Zellen nach einem Metall BB. Bei der Entstehung ist Metall BB aus dem Rack, ein Infrarot-Sensor, Aufnahme, das Datum und die Zeit der Entstehung auf eine SD-Karte auf der Durchreise befreit. Das aktuelle Design ist optimiert für M. Rotundata, aber mit geringfügigen Anpassungen für andere Arten von Insekten angepasst werden könnte.

(1) Systembau

1. Mit PLA Filament, drucken Sie die folgende Anzahl an Teilen für jeden Kanal gebaut: 1 Kollektor Verteiler (collector_manifold.stl), 1 Endkappe (end_cap.stl), 6 Plattform unterstützt (platform_support.stl), 4 Rohr Rack Grundplatten (base_plate.stl) und 4 Tube Rack Planscheiben (face_plate.stl). Vergewissern Sie sich, dass Drucker Bett ist groß genug, um ein Element vor dem Drucken drucken. Alle *.stl-Dateien sind in ergänzende Daten zur Verfügung.
2. Verwenden Sie mit 3 Plattform unterstützt und eine 33 x 30 cm Stück Wellpappe Plastik Heißkleber zusammenzubauen 2 Rohr Rack Plattformen pro Kanal gebaut, wie in Abbildung 2dargestellt. Die gewellte Kunststoff kann auf der einen Seite an jeder Ecke zu biegen gewertet.
3. Elektronik in der Sammler-Verteiler zu installieren.
   1. Löten Sie einen 120 Ω Widerstand an der Anode (längere Bein) sowohl die Infrarot-Strahler Infrarot-Detektor und ~ 5 cm Länge 22 GA Draht beide Kathoden. Benutzen Sie verschiedene Farben der Drähte um Verwechslungen in späteren Schritten.
   2. Einsetzen Sie den Detektor vorsichtig in eine Steckdose von der Sammler-Verteiler (in Abbildung 3blau markiert) und der Emitter der zweiten Buchse (rot hervorgehoben). Beide Komponenten sollte gemütlich passen.
   3. Füttere die Detektor-Drähte durch die Verkabelung Kanal (in Abbildung 3gelb hervorgehoben) und ziehen Sie alle vier Drähte durch die Zugangsöffnung (grün markiert). Stellen Sie sicher, dass keine blanken Drähte berühren mit Heißkleber an Stelle befestigen.
   4. Löten Sie alle vier Drähte auf eine RJ45 Buchse (Ethernet), mit der hinteren Reihe der Stifte. Beide Anoden sollten die am weitesten links Pin, der Kathode des Senders mit dem am weitesten rechts Pin und die Kathode des Detektors entweder der Mitte Pins (Abbildung 4) gelötet werden.
   5. Sichern Sie die RJ45-Buchse über die Sammler vielfältigen Zugangsöffnung (in Abbildung 3grün markiert) mit Heißkleber, sicherzustellen, dass keine blanken Drähte im Inneren der vielfältigen berühren.
4. Fallende Kugel Sammler (1 pro Kanal gebaut) zu konstruieren, wie in Abbildung 5 dargestellt
   1. Verwenden Sie mit einer Endkappe ein kabelgebundene Kollektor Verteiler und einen 24 x 30 cm-Ausschnitt aus Wellpappe Kunststoff Heißkleber an um der Unterseite des Geräts (rot, grün und hell grau Komponenten der Abbildung 5) zu verbinden.
5. Verwenden Sie eine 8 x 27 cm Ausschnitt aus Wellpappe Kunststoff, eine fallende Kugel-Rampe an den Kollektor (dunkle graue Komponente der Abbildung 5) hinzuzufügen. Die Ende Kappe und Sammler vielfältigen Designs gehören leisten um korrekte Platzierung zu gewährleisten. Überprüfen Sie für einen reibungslosen Übergang von der Rampe an den Sammler zu Staus während des Gebrauchs zu vermeiden.
6. Konstruieren Sie den zentralen Prozessor für das System (siehe Abbildung6).
   1. Drucken Sie eine benutzerdefinierte Leiterplatte für Systemaufbau. Alle Dateien, die erforderlich für PCB Tafeldruck stehen in ergänzenden Daten.
   2. Löten Sie weibliche Header auf die Durchgangsbohrungen für folgenden Anlagen beschriftet: Arduino Nano, Temp, Uhr, Modul SD und Flüssigkristall-Display (LCD) Bildschirm (unbeschriftete 2 x 5 Durchgangsbohrung Bereich in der oberen linken Ecke der Platine).
   3. Snap-in und sechs RJ45-Buchsen an der unteren Kante der Platine zu löten.
   4. Lot sechs 470 k Ohm Pulldown Widerstände in der Durchgangsbohrung Websites befindet sich direkt über den RJ45-Buchsen.
   5. Arduino Nano, DHT-Temperatur und Luftfeuchte-Sensor, Uhr und SD-Modul auf der Platine einbauen. DHT-Temperatur-und Feuchtigkeitssensor sollte vor Gebrauch in Experimenten auf Richtigkeit geprüft werden.
   6. Ein Band 10-Connector-Kabel an den LCD Bildschirm Stecker von der Platine anschließen. Löten Sie das andere Ende des Drahtes Band auf dem LCD-Bildschirm, so dass die Bildschirm-Pins an den Arduino Pins entsprechen, wie in Abbildung 4. Weitere Details zur Verkabelung von LCD sind an https://Learn.adafruit.com/character-lcds/wiring-a-character-lcd erhältlich.
7. System-Programmierung
   1. Downloaden Sie und installieren Sie die neueste Version von der Arduino IDE für das richtige Betriebssystem aus www.arduino.cc.
   2. Installieren Sie bei der ersten Verwendung Arduino-Bibliotheken für die Real Time Clock (github.com/adafruit/RTClib) und der Temperatur/Luftfeuchte-Sensor (github.com/adafruit/DHT-sensor-library). Stellen Sie die Uhr auf die aktuelle Ortszeit mithilfe des ds1307-Skripts mit der Bibliothek enthalten.
   3. Laden Sie das System Arduino Skript, ergänzende Daten zur Verfügung.

2. die Systemnutzung

1. Montieren Sie das System, wie in Abbildung 7dargestellt. Für jeden Kanal verwendet wird sollte eine fallende Kugel-Kollektor (montiert in Schritt 1.4) auf beiden Seiten durch eine Rack-Plattform (montiert im Schritt 5.1) flankiert werden. Verwenden Sie Verpackungsklebeband Stücke zusammen zu halten und eine glatte, abgerundete Kante auf der Rack-Plattform zu schaffen.
2. Konfigurieren Sie die ungenutzten Kanäle um falsche positive Signale zu vermeiden. Da das System stützt sich auf ein low-Signal, ein Ereignis (Infrarot-Detektor nicht Empfang eines Signals von der Infrarot-Strahler) zu erkennen, müssen die ungenutzten Kanäle entsprechend konfiguriert werden, um falsche positive Signale zu vermeiden. Dies kann durch zwei verschiedene Arten erreicht werden.
   1. Deaktivieren Sie ungenutzten Kanäle in der Software durch die Schlaufen der ungenutzten Kanäle entsprechend auskommentieren. In Arduino IDE, kann dies durch Hinzufügen von "/ *" vor unnötigen Schleifen und "* /" an ihrem Ende.
   2. Deaktivieren Sie die ungenutzten Kanäle durch eine einfache Hardware-Unterkunft. Einfach Löten Sie Drähte #6 und #8 (in der Regel die braunen und solide grüne Massivdrähten eines handelsüblichen Cat 6 Kabel) zusammen und stecken Sie in die leere RJ45-Buchse auf den zentralen Prozessor.
3. Last und Ort Rohr Racks unmittelbar vor der Ausführung eines Tests.
   1. Stellen Sie sicher, dass alle Löcher einen 0,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit der Kappe entfernt enthalten und die Rohre fest sitzen.
   2. Füllen Sie jedes Rohr mit einem Insekt Brutzelle pupal Fall oder Kokon, ein Airsoft Pellet und schließlich einem Metall BB. Sicherstellen Sie, dass die flachen Seite (GAP) die Brutzelle in Richtung der Airsoft Pellet und Metall BB gegenübersteht. Befestigen Sie die Tube Rack Frontblende mit der abgerundeten Kante in Richtung zur Unterseite des Racks mit ¼ Zoll Nylonschrauben.
   3. Ort Rohr Racks auf die Rack-Plattform, mit der Öffnung in Richtung Kollektor fallenden Kugel nach. Regale sollten am äußersten Rand der Plattform platziert werden, so dass eine Metall BB in den Kollektor frei fallen kann, ohne Prellen gegen einen anderen Teil der Struktur (Abbildung 7). Wenn das Rack platzieren, beginnen Sie mit der Öffnung nach oben und drehen Sie dann vorsichtig in Ort, um sicherzustellen, dass Metall BBs nicht freigegeben werden. Die Regale sind so konzipiert, dass die Rohre leicht nach hinten neigen werden, wenn richtig platziert, reduziert die unbeabsichtigte Freisetzung von Metall BBs.
4. Legen Sie eine SD-Karte in den Adapter und starten Sie dann den zentralen Prozessor von der Arduino und das andere Ende in einen entsprechenden USB-Adapter einen Micro-USB-Stecker einstecken. Das LCD-Display zeigt Zahlen eins bis sechs, wenn Sie bereit sind. Drop eine einzige Metall BB in der Kugel-Sammler von jedem Kanal und beobachten für die entsprechende Anzahl auf dem Bildschirm angezeigt werden und die richtige Uhrzeit am unteren Rand des Bildschirms angezeigt.
   1. Wenn die Uhrzeit nicht angezeigt wird, wiederholen Sie die Schritte 1.6.3 und 1.6.4 die Uhrzeit neu einstellen.
   2. Wenn der Test Metall BB nicht erfasst wird, ist der Kollektor gesperrt. Sichtkontrolle für Verstopfung und das System neu starten.
   3. Wenn ein Kanal "ein Ereignis jede Sekunde zählt", bedeutet dies, dass der Kanal nicht richtig angeschlossen ist. Überprüfen Sie alle Verbindungen und starten Sie das System neu.

3. Experimentieren Sie Ende und Datenanalyse

1. Nach der Entstehung (siehe Ergebnisse und Abbildungen 8 und 9 für Beispiele der Zeitskala), schalten Sie das Gerät durch Ziehen des Arduino beendet ist. Regale können zerlegt und für die Wiederverwendung gereinigt.
2. Während des Experiments werden Daten auf der SD-Karte in eine durch Trennzeichen getrennte Datei (CSV) zugänglich von der Programmiersprache R. Verwenden Sie die SD-Karte zur Datenübertragung auf den Computer und RStudio, Blase Grundstücke der Daten automatisch zu generieren.
   1. Ereignis-und Temperatur werden in der gleichen Datei für die Integrität der Daten gespeichert. Daher muss einige Verarbeitung vor der Analyse abgeschlossen werden. Importieren Sie die Komma durch Trennzeichen getrennte Datei in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Spalten, I und J sind das Datum und die Zeit der Entstehung für Bienen; machen sie Spalten A und B durch Ausschneiden und Einfügen von Spalten A-E in eine zweite Tabelle, und speichern Sie als eine separate Datei, dies ist die Temperaturdaten.
   2. Titelspalte A mit "Date" und Spalte B "Time" und Sortieren der Daten nach Spalte A dann nach B. Speichern als CSV. Datei.
   3. Downloaden Sie und installieren Sie die neueste Version von der RStudio aus https://www.r-project.org/. Hilfe bei der Benutzung von RStudio für das Hochladen und analysieren von Daten finden Sie hier unter https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.html.
   4. Mit dem R-Skript in den ergänzenden Daten verfügbar, die Daten in RStudio hochladen. Ändern Sie das Ziel der Arbeit im R-Skript entsprechend wo Excel *. CSV-Datei befindet. Führen Sie das Skript und wählen Sie die Datendatei zu analysieren. Geben Sie in die R-Konsole "plot". Das Blasendiagramm befinden sich in der Arbeit Ziel namens "High-Res;" benennen Sie diese Datei als hochauflösende Tiff (300 dpi)-Datei speichern.

Entstehung von M. Rotundata ist asynchron ohne Exposition gegenüber einer ökologischen Cue mit Entstehung auftretenden gleichmäßig im ganzen Tag4. Allerdings wird, wenn ein Rechtecksignal Thermoperiod (4° C Thermoperiod) ausgesetzt, Entstehung synchron zum Thermophase4,5. Dieses Ergebnis ist ähnlich wie bei anderen Studien wo Insekten wurden gefunden, um Thermoperiod Hinweise zu verwenden, entstehen, einschließlich Fleisch Fly Sarcophaga Crassipalpis6, die Zwiebel Fliege Delia Atiqua7 und dem Boll Weevil regulieren Anthonomus Grandis Grandis8. Eine Studie hat gezeigt, dass Stress während der Entwicklung die Synchronität der Erwachsenen entstehen in S. Crassipaplpis9beeinflusst. Hier präsentieren wir Ihnen Ergebnisse von M. Rotundata , die während der Entwicklung, um die Hypothese zu testen, dass diese Behandlung die Desynchronisation der Erwachsenen Entstehung führt zu einem Stress ausgesetzt waren.

Erfolgreich ausgeführt

Der Benutzer sollte das LCD-Display sehen Sie vor dem Öffnen des Inkubators, um sicherzustellen, dass Insekten nicht mehr entstehen. Nach Abschluss des Experiments die SD-Karte entfernt und die Daten können als durch Trennzeichen getrennte Datei als ein Blasendiagramm visualisiert werden in RStudio exportiert werden, wie oben beschrieben. Abbildung 8 zeigt Biene Entstehung unter einer 4 ° C Thermoperiod nach Exposition gegenüber einem kalten Stress während der Entwicklung. Das rote Fadenkreuz zeigt die mittlere Zeit und Tag der Entstehung und der Name der Datei lautet der Titel. Diese R-Skript verwendet werden, um die Daten zu visualisieren, aber sollte nicht als die einzige Analyse dienen. Um entstehen als Reaktion auf eine ökologische Cue zu analysieren, die Daten für Rhythmik analysiert werden können (Siehe Analyse).

Komplikation

Wenn ein Sensor mit Metall BBs verstopft ist, ist das Fehlen eines Signals immer wieder gezählt, was zu mehreren falschen Datenpunkten. Abbildung 9 zeigt das gleiche Dataset dargestellt in Abbildung 8, aber mit einem der sechs Kanäle verstopft mit BBs, daher die große Blase im Diagramm erstellen. Im Falle eines verstopften Sensors können Daten aus diesem Kanal leicht aus der Analyse entfernt. Mit mehreren Kanälen in einem Experiment ist vorteilhaft bei der Minimierung der Auswirkungen eines verstopften Sensors.

Analyse

Datenanalyse für die Präsenz der Synchronisation erfolgt durch die Berechnung "Parameter R," eine skalare Statistik, die angibt, wenn entstehen rhythmische oder arrhythmischen10,11,12. Dies geschieht durch Berechnung der höchsten Anzahl an junge Menschen in einem 8-Stunden-Fenster Division dieser Zahl durch die Anzahl der Erwachsenen entstehen außerhalb des 8-Stunden-Fensters, dann multipliziert mit 100. Alle Individuen, die sich sollten gebündelt werden, um die Anzahl der aufstrebenden Erwachsene für jede Stunde des Tages berechnen. Die theoretische Reichweite des Parameters R liegt zwischen 0 (alle Entstehung tritt innerhalb des Gates) und 200 (Entstehung ist gleichmäßig über den Tag verteilt)10. R Werte < 60 gelten rhythmische Entstehung, 60 < R < 90 sind schwach rhythmisch, und R > 90 sind arrhythmischen. R-Werte > 150 zeigen gleichmäßige Verteilung der Entstehung10. Abbildung 8 zeigt die Entstehung ist rhythmisch mit Parameter R = 20,21 < 60. Da diese Art von Daten rund um eine sich wiederholende 24-Stunden-Uhr verteilt wird, müssen kreisförmige Statistiken für eine robustere Analyse (in Bennett Et Al., 20185ausführlich beschrieben) eingesetzt werden. Dies kann erreicht werden, durch kreisförmige Statistik-Pakete zur Verfügung, für RStudio (Paket "Rundschreiben"-CRAN. R-Project.org).

Abbildung 1: Additive hergestellten Komponenten. PLA Filament, 3D Drucken die benötigten Teile für das System. Für jeden Kanal gebaut benötigten Teile sind 1 Kollektor Verteiler (grün), 1 Endkappe (rot), 6-Plattform unterstützt (Orange), 4 Rohr rack Grundplatten (lila) und 4 Rohr Rack Planscheiben (gelb). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Tube Rack Plattform Montage. Verwenden Sie Heißkleber zusammenzubauen zwei Rohr Rack Plattformen pro Kanal gebaut. Verwenden Sie drei Plattform unterstützt (in Orange dargestellt) mit einem Ausschnitt aus Wellpappe Kunststoff (grau dargestellt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3: Collector vielfältigen Röntgen. Legen Sie ein Infrarot-Detektor in eine Steckdose des Sammlers (blau dargestellt) und der Emitter der zweiten Buchse (rot dargestellt). Füttern Sie die Detektor-Drähte durch die Verkabelung Kanal (gezeigt im gelb) und ziehen Sie alle vier Drähte durch die Zugangsöffnung (grün markiert). Stellen Sie sicher, dass keine blanken Drähte berühren mit Heißkleber an Stelle befestigen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 4: Anschluss Verkabelung. Schaltplan für die RJ45-Buchse vor der Anbringung an das Sammler-mannigfaltige, wie von der Unterseite der Buchse und der Verdrahtung Tabelle für den Anschluss des LCD-Bildschirms an den zentralen Prozessor gesehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 5: Ball Kollektor Montage. Mit einer Endkappe (rot dargestellt), einen Kollektor Verteiler (grün dargestellt) und ein 24 x 30 cm Stück Wellpappe Plastik (in hellgrau dargestellt) montieren Sie die Schale der Kugel Sammler Versammlung. Verwenden Sie eine 8 x 27 cm Stück Wellpappe Plastik (in dunkelgrau dargestellt), um eine Rampe hinzuzufügen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 6: zentrale Prozessor PCB-Board. Die Platine für den zentralen Prozessor besteht aus einer Unterschicht (grün dargestellt), einer Deckschicht (in rot dargestellt) und eine Siebdruck-Schicht (in blau dargestellt). Löten Sie weibliche Header alle Pass-Through-Löcher, mit Ausnahme derjenigen für die RJ45-Buchsen (unten) und die Pulldown-Widerstände (direkt über den RJ45-Pads). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 7: Endmontage. Bei der Benutzung sollte das Gerät auf beiden Seiten des jeden Ball-Collector verwendet wird mit einer Rohr-Rack-Plattform montiert werden. Rohr-Racks mit angehängten Faceplates sollte positioniert werden, so dass sie am äußersten Rand der Tube Rack Plattform, reduzieren die fallenden BBs abprallen von der Vorrichtung. Der Fußabdruck der zusammengebaute Vorrichtung ist ca. 25 cm x 35 cm, mit einer Höhe von 20 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 8: Diagramm eines typischen experimentellen Laufs nach der Verarbeitung in R. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 9: Diagramm eines Experiments, die einen verstopften Detektor litt, wie gezeigt durch die relativ große Blase am Tag 4. Verstopfte Kanal kann von der Analyse, und bewahrt somit die Restpunkte Daten entfernt werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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