Synthese und Strukturaufklärung von µ-vor PIIIA Isomere mit verschiedenen Disulfid Verschaltungen

Die Verwendung von bioaktiven Peptiden in der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung ist hoch anerkannt, weil sie potente und hoch selektive Verbindungen für bestimmte biologische Ziele¹darstellen. Für ihre Bioaktivität ist jedoch die dreidimensionale Struktur von großer Bedeutung um Struktur-Aktivitäts-Beziehungen Studien^2,3,4durchzuführen. Neben der primären Aminosäure-Sequenz, die die gesamte Konformation beeinflusst, stabilisieren Disulfid Anleihen deutlich die Struktur der Cystein-Rich-Peptide⁵. Mehreren Disulfid überbrückt Peptide enthalten Conotoxine wie µ-PIIIA von Conus Purpurascens die sechs Cysteine in seiner Sequenz enthält. Diese hohe Cystein-Inhalte ermöglicht theoretisch die Bildung von 15 Disulfid-Isomere. Die richtige Disulfid-Konnektivität ist sehr wichtig für die biologische Aktivität^6,7. Allerdings ist stellt sich die Frage, ob gibt es mehrere bioaktive Konformation des natürlich vorkommenden Peptide und wenn so, welche diese Isomere die höchste biologische Aktivität besitzt? Bei µ-Conotoxine, sind die biologischen Zielen Voltage-gated Natrium-Ionenkanäle und µ-PIIIA ist insbesondere für Untertypen_V1.2, Na Na stärkste_V1.4 und Na_V1.7³.

Die Synthese von Peptiden Disulfid überbrückt kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden. Die praktischste Methode für die Bildung von Disulfid-Bindungen innerhalb ein Peptid ist der sogenannte oxidative selbst Falten Ansatz. Hier wird die lineare Vorläufer des gewünschten zyklische Peptid synthetisiert zuerst mit Festphasen-Peptidsynthese, die nach die Spaltung von Polymeren Unterstützung Oxidation in einem Puffersystem unterworfen. Redox-aktiven Substanzen wie reduzierte und oxidierte Glutathion (GSH/GSSG) werden häufig hinzugefügt, um die Bildung von Disulfid-Bindungen zu fördern. Der größte Nachteil der Puffer unterstützt Self Faltung ist, dass die Disulfid-Bindungen nicht selektiv in einer schrittweisen Weise gebildet werden. Im Vergleich zu nativen Peptid, bei dem oft nur eine bestimmte Disulfid Isomer beschrieben wird, ist es möglich, zahlreiche andere Isomere mit diesem Ansatz⁸zu erhalten. µ-PIIIA nachweislich bereits mindestens drei unterschiedlich gefaltet Isomere auf selbst in einer früheren Studie³Falten führen. Die Trennung von solch ein Isomer Mischung ist eher schwierig, da ähnliche Retentionszeiten, wenn chromatographische Reinigung Methoden⁹verwenden. Die gezielte Synthese von spezifischen Isomer ist daher vorteilhaft. Insbesondere Produkte, die ein Isomer mit definierten Disulfid-Konnektivität, eine besondere Strategie erforderlich ist, in denen das Disulfid Anleihen werden sukzessive geschlossen. Daher ist der lineare Vorläufer tragen verschiedene Schutzgruppen auf die einzelnen Cystein-Paare auf die Polymer-Unterstützung synthetisiert. Nach der Beseitigung der Cystein-Paare sind einzeln und nacheinander deprotected und verknüpft in eine Oxidationsreaktion zu der gewünschten Disulfid Anleihen^{10,11,12,13, 14 , 15 , 16}. nach der Synthese und der Reinigung des reaktionsproduktes, es ist verpflichtet, die Identität und die Disulfid-Konnektivität bestätigen durch geeignete analytische Methoden. Zahlreiche analytische Methoden stehen zur Verfügung für die Aufklärung der primären Aminosäuresequenz, zB., MS/MS, während die Bestimmung der Disulfid-Konnektivität noch viel weniger untersuchten bleibt. Abgesehen von der Komplexität der solche mehrere Disulfid-gebundenen Peptide, produktbezogene Verunreinigungen (zB., von Disulfid kriechen), aufgrund der Probe Vorbereitung und Aufarbeitung können weiter zu komplizieren Analyse. In diesem Beitrag zeigen wir, dass die Verwendung einer Kombination von verschiedenen analytischen Techniken notwendig ist, die Identität der Disulfid Anleihen in der µ-PIIIA Isomere eindeutig zu klären. Wir haben Chromatographische Methoden mit Massenspektrometrie kombiniert und die gleichen Proben, NMR-Spektroskopie. In Matrix-unterstützte Laser desorption/ionization(MALDI) MS/MS-Analyse haben wir die Disulfid-Bindungen mit teilweiser Abbau und Iodoacetamide Derivatisierung, weil Top-Down-Analyse nicht möglich, dass dieses Peptid ist identifiziert. 2D NMR-Experimente wurden durchgeführt, um eine dreidimensionale Struktur jedes Isomer zu erhalten. So kann es durch die Kombination von verschiedenen anspruchsvollen Analysemethoden, richtig die Disulfid-Konnektivität und die dreidimensionale Struktur des Komplexes mehrere Disulfid-gebundenen Peptide⁷aufzuklären.

Hinweis: Alle hierin verwendeten Aminosäuren wurden in der L-Konfiguration. Die Abkürzungen von Aminosäuren und Aminosäure-Derivate wurden entsprechend den Empfehlungen der Nomenklatur Ausschuss der IUB und die IUPAC-IUB Joint Commission on biochemische Nomenklatur verwendet.

(1) Festphasen-Peptidsynthese (SPPS)

Hinweis: Führen Sie die Synthese mit einem Festphasen-Peptid-Synthesizer. Führen Sie die Synthese von linearen Peptid Vorläufer der allgemeinen Sequenz ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH₂ Standardprotokolls für 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Chemie. Gelten die folgenden geschützte Aminosäuren: Pyr (Boc (Tert-Butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-Sulfonyl)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) und seine (Trt). Schützen Sie die Cystein-Paare mit Trt, Acm oder tBu-Gruppen nach der beabsichtigten Disulfid-Konnektivität.

1. Vorbereitung
   1. Trocknen der Fmoc Rink-Amid-Harz (laden: 0,28 Mmol/g) mit einem Gefriertrockner über Nacht.
   2. Geben Sie die gewünschte Peptidsequenz (1-Buchstaben-Code) in das Programm des Synthesizers. Das Programm berechnet die benötigte Menge für jeden einzelnen Reagenz und zeigt die Lösungsmittel Mengen.
   3. Wiegen Sie die einzelnen Reagenzien (Aminosäuren, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium Hexafluorophosphate)) gemäß dem Protokoll und lösen sie in Dimethylformamid (DMF auf), eine Endkonzentration von 2,4 M (Aminosäuren) und 0,6 M ( HBTU), beziehungsweise.
   4. Die verschiedenen Reagenzien zu übertragen (Aminosäuren, HBTU, N-Methylmorpholine (NMM, 50 % in DMF), Piperidin (20 % in DMF), DMF, Dichlormethan (DCM)) zu den entsprechenden Gefäßen und legen Sie sie in die entsprechenden Schläger von der Festphasen-Peptid-Synthesizer.
   5. Die Reaktion Spalten 100 mg trocken Harz hinzu und setzen Sie sie in den Schläger des Synthesizers. Starten der Festphasen-Peptid-Synthesis.
2. SPPS-Protokoll (bereitgestellt von Synthesizer)
   Hinweis: Das Protokoll gilt für 100 mg des Harzes (laden: 0,28 Mmol/g) hinzugefügt, um eine Reaktion Spalte für 28 µmol Skala.
   1. Vorbereitung des Harzes
      1. Spülen Sie das Harz mit 2500 µL DMF, 1400 µL DCM und 1400 µL DMF.
      2. Spülen Sie das Harz mit Luft zu, bis das Lösungsmittel entfernt wird und spülen Sie das Harz mit 2500 µL DMF.
   2. Spaltung von der Fmoc-Gruppe zu schützen
      1. Fügen Sie 20 % Piperidin in DMF (1000 µL) die Lösung aus dem Harz, der Harz und warten 6 min. entfernen. Wiederholen Sie Schritt 1.2.2.1.
      2. Spülen Sie zweimal mit DMF (1^St 4000 µL, 2^Nd1400 µL), spülen Sie das Harz mit Luft zu, bis das Lösungsmittel entfernt wird und zweimal mit 2000 µL DMF abspülen.
   3. Kupplung-Reaktion
      1. Die folgenden Reagenzien in einem separaten Fläschchen mischen: HBTU (450 µL; 0,6 M im DMF; 270 µmol; 9,6 gl.), NMM (125 µL; 50 % in DMF; 568 µmol; 20 GL.), Fmoc-Aminosäure (420 µL; 2,4 M im DMF; 1,01 Mmol; 36 GL.). Fügen Sie die Mischung auf das Harz und warten Sie 13 min. entfernen die Lösung aus dem Harz. Wiederholen Sie Schritt 1.2.3.1.
      2. Waschen Sie mit 3000 µL DMF. Zweimal mit 1400 µL DMF waschen. Zweimal mit 2000 µL DMF waschen.
      3. Wiederholen Sie 1.2.2 und 1.2.3 entsprechend der Anzahl der Aminosäuren in der Peptidsequenz.
   4. Endgültige Fmoc Spaltung und Harz-Waschanlagen
      1. Fügen Sie 20 % Piperidin in DMF (1000 µL) die Lösung aus dem Harz, der Harz und warten 6 min. entfernen. Wiederholen Sie Schritt 1.2.4.1..
      2. Zweimal mit DMF (1^St 4000 µL, 2^Nd 1400 µL) spülen Sie und spülen Sie das Harz mit Luft. Zweimal mit 2000 µL DMF, 4 mal mit 1400 µL von DCM, spülen und zweimal mit Luft zu spülen.
3. Aufarbeitung
   1. Lyophilize des Harzes aus der Reaktion, die Spalten über Nacht nach die Synthese abgeschlossen ist.

(2) Peptid Spaltung aus dem Harz (Abb. 1A)

Hinweis: Bei der Spaltung werden alle Aminosäure-Seitenketten mit Ausnahme von Cys(Acm) und Cys (tBu) deprotected. Das Protokoll gilt für 100 mg des Harzes.

1. Kombinieren Sie das gefriergetrocknete Harz in einer 12 ml Tube und auf 0 ° C auf Eis abkühlen.
2. Das Harz fügen Sie 150 µL einer Schnitzeljagd-Mischung (vorbereitet von 0,75 g Phenol, 0,5 mL Thioanisole, Ethanedithiol 0,25 mL) und 1 mL Trifluoroacetic Säure (TFA, 95 % in Wasser (H2O hinzu)) auf dem Eis. Lassen Sie sanft Schütteln für 3 h bei Raumtemperatur.
3. Die Mischung durch ein Glasfritte Filtern und das Filtrat in Röhren einzeln gefüllt mit eiskalten Diethylether (1 mL der Spaltung Mischung pro 8-10 mL Diethylether) zu sammeln. Das Peptid ausfällt als weißer Feststoff.
4. Spülen Sie den Filterkuchen mit zusätzlichen TFA (95 % in H₂O, ca. 1-3 mL).
5. Schließen Sie die Rohre mit dem Niederschlag und Zentrifugieren Sie (3400 X g) die Suspensionen für 1 min, abgießen Sie überstand und waschen Sie die Pellets mit ca. 8-10 mL eiskaltes Diethylether. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
6. Lassen Sie die Pellets stehen ohne Stopfen für 5 min um verbleibenden Spuren von Diethylether entfernen. Auflösen der Rohprodukt Pellets in 1 mL der Tert-Butanol (80 % in H₂O). Gefriertrocknen Sie Peptide (-80 ° C).

3. Reinigung der linearen Vorstufe mit semi-präparative Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Hinweis: Reinigen der rohen Peptide durch Semi-präparative reversed-Phase (RP) HPLC, ausgestattet mit einer C18-Säule (5 µm Partikelgröße, 100 Å Porengröße, 250 x 32 mm) und einem 3,6 mL Injektionsschleife. Verwenden Sie einen Gradienten Elution System von 0,1 % TFA in H₂O (Laufmittel A) und 0,1 % TFA in Acetonitril (MeCN) / h₂O (9:1, Laufmittel B). Erkennen die Peaks bei 220 nm.

1. Eine 15 mL Tube ca. 70 mg das Roh-Peptid hinzu und löst das solide Peptid im Volumen von HPLC-Probenschleife (zB., 3,6 mL). Verwenden Sie eine Mischung von 0,1 % TFA in MeCN/H₂O (1:1). Vortex bis komplette Auflösung und Zentrifuge (3400 X g) die Lösung für 1 min.
2. Erarbeiten der Probe (3,6 mL) in einer 5 mL Spritze und Spritzen die Probe ohne Luftblasen in die Probenschleife. In das HPLC-System injiziert. Die Peptid-Mischung mit einer Steigung von 0-50 % Laufmittel B über 120 min bei einer Durchflussrate von 10 mL/min zu trennen.
3. Die Fraktionen in Einzelrohre zu sammeln, wie sie erscheinen. Nach der abgeschlossen ist, bereiten Sie ausgewählte Brüche für Massenspektrometrie (MS) und HPLC-Analytik (Schritt 6.1-6.2). Gefriertrocknen Brüche und lagern bei-20 ° C.
4. Kombinieren Sie nach MS und HPLC Analyse die sortenreine Fraktionen von linearen Peptid und bereiten Sie die Proben für die ersten Oxidation.

(4) selektive Bildung von Disulfid-Bindungen

1. 1 ^St Oxidation (Abbildung 1(B)
   Hinweis: Während der Peptid-Spaltung aus dem Harz, die Cys(Trt) sind deprotected, führt zu zwei ungeschützte Cys-Rückstände die Oxidation der ersten Disulfid Bindung anschließend ausgesetzt sind. Das folgende Protokoll gilt für 15 mg linear gereinigten Peptid (2864.5 g/Mol; 5,2 µmol; 1 GL.).
   1. Auflösen der linearen Peptid (15 mg) in 105 mL Isopropanol/H₂O-Gemisch (1:2; 0,05 mM; pH 8,5 mit Natriumhydroxid (NaOH) eingestellt) und lassen Sie sanft schütteln in Luft unter Rahmenbedingungen für 12-48 h.
   2. Überwachen Sie die Oxidationsreaktion über HPLC und MS. Confirm die Bildung der ersten Brücke von Iodoacetamide (IAA) Derivatisierung (Schritt 6).
   3. Gefriertrocknen Sie das Peptid und verwenden Sie es ohne weitere Reinigung für die 2^Nd -Oxidation.
2. 2^Nd Oxidation (Abbildung 1C)
   Hinweis: Bei der zweiten Oxidation der Deprotection von der Acm-geschützte Cysteine und die Bildung der zweiten Brücke sind katalysiert durch Jod. Das Protokoll gilt für 15 mg Peptid nach der 1^St -Oxidation (2862.5 g/Mol; 5,2 µmol; 1 GL.)
   1. Das Peptid (15 mg; Endkonzentration von 0,05 mM) in 105 mL Isopropanol/H₂O/1 M Salzsäure (HCl) Mischung (80:12.5:7.5) auflösen.
   2. 158 µL einer 0,1 M-Jod-Lösung in Methanol (MeOH) hinzufügen (15,7 µmol; 3 GL.) bis zur Lösung. Rühren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur 3-52 h, dh., bis die Oxidation abgeschlossen ist.
   3. Überwachen Sie die Oxidationsreaktion über HPLC und MS. Confirm die Bildung der zweiten Disulfid Bindung durch Iodoacetamide (IAA) Derivatisierung (Schritt 6).
   4. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 79 µL einer 1 M-Ascorbinsäure-Lösung in H₂O (78.8 µmol; 15 GL.). Gefriertrocknen Sie das Reaktionsgemisch und verwenden Sie das Pulver für die 3^rd -Oxidation.
3. 3^rd -Oxidation (Abbildung 1D)
   Hinweis: Die letzten Oxidation führt zu die Deprotection tBu geschützt Cysteine und zur Bildung von der dritten Disulfid-Brücke. Das Protokoll gilt für 15 mg Peptid nach der 2^Nd -Oxidation (2718.3 g/Mol; 5,5 µmol; 1 GL.).
   1. Das Peptid (15 mg, Endkonzentration von 1 mM) in 5,5 mL TFA auflösen. Es enthält eine Schnitzeljagd Mischung bestehend aus 11,2 mg Diphenylsulfoxide (55 µmol; 10 EQ), 60.2 µL Anisole (0,6 Mmol; 100 EQ) und 97,2 µL des Trichloromethylsilane (0,8 Mmol; 150 GL.). Rühren Sie die Mischung für 3-5 h bei Raumtemperatur.
   2. Überwachen Sie die Oxidationsreaktion über HPLC und MS. Confirm die Bildung der dritten Disulfid Bindung durch Iodoacetamide (IAA) Derivatisierung (Schritt 6).
   3. Das Peptid in den Rohren mit kalten Diethylether (0 ° C, 1 mL der Reaktionslösung pro 8-10 mL Diethylether) ausgefällt.
   4. Zentrifugieren der Suspensionen (3400 X g, 1 min), den überstand abgießen und waschen die Pellets wiederholt (4 mal) mit ca. 8-10 mL kalte Diethylether (0 ° C). Lassen Sie die Pellets auf Luft (3 min) trocknen.
   5. Lösen sich die Pellets in 1 mL 80 % Tert-Butanol (in H₂O), Gefriertrocknen das Peptid und bei-20 ° c Lagern

(5) Peptid-Reinigung

Hinweis: Reinigen der oxidierten Peptide durch Semi-präparative RP HPLC mit einer C18-Säule ausgestattet (10 µm Partikelgröße, 300 Å Porengröße, 250 x 22 mm) und einem 3,6 mL Injektionsschleife. Verwenden Sie einen Gradienten Elution System von 0,1 % TFA in H₂O (Laufmittel A) und 0,1 % TFA MeCN/H₂O (9:1, Laufmittel B). Erkennen die Peaks bei 220 nm.

1. Eine 15 mL Tube 15 mg gefriergetrocknetes Rohprodukt aus Schritt 4.3.5 hinzufügen. Das Rohprodukt in das Volumen der HPLC-Probenschleife auflösen (zB., 3,6 mL). Verwenden Sie eine Mischung von 0,1 % TFA in MeCN/H₂O (1:1). Vortex bis komplette Auflösung und Zentrifuge (3400 X g) die Lösung für 1 min.
2. Die 3,6 mL Mischung in einer 5 mL Spritze erarbeiten Sie und injizieren Sie die Probe ohne Luftblasen in die Injektionsschleife. Starten Sie die Injektion in der HPLC-Anlage. Reinigen Sie die Peptid-Mischung mit einer Steigung von 0-50 % Laufmittel B über 120 min bei einer Durchflussrate von 10 mL/min.
3. Die Fraktionen in Einzelrohre zu sammeln, wie sie erscheinen. Nach Abschluss die Ausführung bereiten Sie ausgewählte Brüche für MS und HPLC Analyse (Schritt 6.1-6.2). Gefriertrocknen aller Fraktionen und lagern bei-20 ° C.
4. Nach Abschluss die Ausführung bereiten Sie ausgewählte Brüche für MS und HPLC Analyse (Schritt 6.1-6.2). Gefriertrocknen aller Fraktionen und lagern bei-20 ° C.

(6) Peptid Analytics

1. Analytische HPLC
   Hinweis: Bestätigen Sie die Reinheit eines Peptids durch analytische RP-HPLC, ausgestattet mit einer C18-Säule (5 µm Partikelgröße, 300 Å Porengröße, 250 x 4.6 mm) und einer 500 µL Injektionsschleife. Verwenden Sie einen Gradienten Elution System von 0,1 % TFA in H₂O (Laufmittel A) und 0,1 % TFA in MeCN (Laufmittel B). Erkennen die Peaks bei 220 nm.
   1. Eine Probe der Peptid-Fraktionen zu übertragen oder Reaktion Steuerelemente in einer HPLC Fläschchen und lösen Sie es in einer Mischung von 0,1 % TFA in MeCN/H2O (1:1, 300-500 µL). Legen Sie die HPLC Vials in den Autosampler der analytischen RP-HPLC.
   2. 250 µL jeder Probe zu injizieren. Verwenden Sie einen Gradienten Elution System von 0,1 % TFA in H₂O (Laufmittel A) und 0,1 % TFA in MeCN (Laufmittel B). Reinigen Sie das Peptid mit einem Gefälle von 10-40 % Laufmittel B über 30 min bei einer Durchflussrate von 1,0 mL/min.
2. MALDI TOF-Massenspektrometrie
   Hinweis: Bestätigen der Identität eines Peptids massenspektrometrisch MALDI TOF (Laufzeit) mit α- Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure als Matrix.
   1. Eine sichtbare Menge des Peptids zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen und lösen Sie es in 10 µL einer 37 mM α- Cyano-4-Hydroxycinnamic sauren Lösung in einer Mischung von 0,1 % TFA in H₂O/MeCN (1:1).
   2. Wirbel die Lösung für 10 s, 2 µL der Probe auf ein bodenziel Stahl anwenden und die Probe an der Luft trocknen.
   3. Verwenden Sie den Reflektor-Modus für die Messungen und ein Peptid Kalibrierstandards für molare Massen unter 6000 g/Mol.
3. Iodoacetamide Derivatisierung
   Hinweis: Da Iodoacetamide mit Thiol-Gruppen reagiert, zeigt Iodoacetamide Derivatisierung der Peptide freie Thiol-Gruppen. Daher dient das Fehlen von freien Thiol-Gruppen zur Reaktionskontrolle über MS bei der 1^St -Oxidation.
   1. Das Peptid in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,8, 100 µL; 0,05 mM) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu lösen. Die peptidlösung 100 µL der Iodoacetamide in 10 mM Phosphatpuffer (4 mM) hinzu und schütteln Sie die Reaktion für 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Das Reaktionsgemisch Gefriertrocknen und bei-20 ° c Lagern
   2. Verwenden Sie eine Filter-PIPETTENSPITZE C18-Konzentration und den Zustand der Spitze mit 10 µL von 80 % (3 mal), 50 % (3 mal), 30 % (3 mal) und 0 % (3 mal) MeCN in H₂O (+ 0,1 % TFA).
   3. Lösen sich die Probe aus Schritt 6.3.1 in 1 µL von 0,1 % TFA in H₂O und die PIPETTENSPITZE Filter die Lösung hinzufügen. Pipette vorsichtig rauf und runter, so dass das Peptid an die Perle bindet. H₂O aus der Pipettenspitze entfernen und spülen Sie die Filter-PIPETTENSPITZE mit 10 µL von 0,1 % TFA in H₂O.
   4. Fügen Sie 2 µl von 0,1 % TFA in H₂O/MeCN (1:1) mit einem anderen PIPETTENSPITZE (ohne Filter) auf die Perle, das Peptid enthält. Das Filtrat auf Stahl bodenziel anwenden und die Probe an der Luft trocknen.
   5. Gelten Sie 1 µL einer 37 mM α-Cyano-4-Hydroxycinnamic sauren Lösung in einer Mischung von 0,1 % TFA in H₂O/MeCN (1:1) auf den Boden Stahl gezielt mit der Probe und an der Luft Trocknen der Probenmaterials.
   6. Verwenden Sie den Reflektor-Modus für die Messungen und ein Peptid Kalibrierstandards für molare Massen unter 6000 g/Mol.
4. Aminosäure-Analyse
   Hinweis: Analysieren Sie die genauen Peptid-Konzentration sowie die Aminosäure-Zusammensetzung des Peptids mit einer Aminosäure-Analyzer.
   1. Übertragen Sie 100 µg des reinen Peptids (2604 g/Mol; 0,04 µmol) auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und lösen Sie des Pulvers in 200 µL 6 M HCl auf.
   2. 200 µL der Lösung in einer Glasampulle und spülen die 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zweimal mit 200 µL 6 M HCl. übertragen die Spüllösung in die Glasampulle sowie.
   3. Schließen Sie die Ampulle, durch den Hals der Ampulle mit einem Bunsenbrenner Flamme erhitzen. Setzen Sie die Ampulle in ein Glasrohr. Legen Sie sie in einem Heizblock für 24 h bei 110 ° C für Hydrolyse.
   4. Öffnen der Ampulle und die Lösung zu einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen. Waschen Sie die Ampulle (3 x 200 µL) und die Kappe (3 x 100 µL) mit bidestilliertem H₂O und in den Microcentrifuge Schlauch übertragen.
   5. Die Lösung für 6 h bei 60 ° C und 210 X g in eine rotierende Vakuum Konzentrator Zentrifuge. Hydrolysierte Produkt in 192 µL Probe Verdünnungspuffer (200 µM) auflösen und die Lösung in einen Mikro-zentrifugale Filter übertragen.
   6. Zentrifugieren Sie die Probe für 1 min auf 2300 x g und Transfer 100 µL das Filtrat in ein Probenröhrchen Aminosäure Analyse. Legen Sie das Rohr in der Aminosäure-Analyzer und starten Sie die Auswertung. Ein Aminosäure Standard wird zur Kalibrierung verwendet.

7. MS/MS-Analyse von Disulfid-Konnektivität

1. Partielle Reduktion und Alkylierung¹⁷
   1. Auflösen von 600 µg des reinen Peptids (2604 g/Mol; 0,23 µmol) in 1,2 mL 0,05 M Citrat-Puffer (pH 3,0; 0,14 mM-Peptid-Konzentration) mit 7,5 mg tris(2-carboxyethyl) Phosphin (0,02 M, DÄMMUND; 0,03 Mmol).
   2. Die Mischung bei Raumtemperatur inkubieren und mehrere Reaktion Kontrollproben (100 µL) von 0 min bis 30 min bis hin zu nehmen.
   3. Mischen Sie die Proben in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 300 µL Puffer Alkylierung (0,5 M Tris-Acetat, pH 8.0; 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA); 1,1 M Iodoacetamide), die Reaktion zu stoppen und Carbamidomethylation der freien Thiol-Gruppen durchführen.
   4. Stoppen Sie die Reaktion nach 5 min durch Zugabe von 100 µL 10 % TFA (H₂O) und laden die Proben auf Trockeneis. Bereiten Sie HPLC-Proben wie in Schritt 6.1.2 beschrieben vor und injizieren Sie 400 µL. (Abb. 2A)
   5. Verwenden Sie einen Gradienten Elution System von 0,1 % TFA in H₂O (Laufmittel A) und 0,1 % TFA in MeCN (Laufmittel B). Analysieren die Peptide, die durch die Kombination von eine isokratische Trennung (10 % Laufmittel B für 15 min) und dann eine spätere Gefälle von 10-35 % Laufmittel B mehr als 25 min bei einer Flussrate von 10 mL/min erkennen die Peaks bei 220 nm.
   6. Sammeln Sie die Fraktionen in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Gefriertrocknen Sie Peptide. (Abbildung 2B)
   7. Übertragen Sie eine kleine Menge der einzelnen Fraktionen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch für MS/MS-Analyse der oxidierten Formen (weiter bei Schritt 7.1.12).
   8. Auflösen der verbleibenden Peptid (10-100 µg) in 0,1 % TFA in H₂O (10-50 µL) und einem entsprechenden Volumen einer 100 mM DÄMMUND Lösung (in H₂O) hinzufügen, um eine Endkonzentration von DÄMMUND von 10 mM zu erhalten.
   9. Inkubieren Sie die Reaktion für 1 h bei 37 ° C (Abbildung 2C). Das Reaktionsgemisch Gefriertrocknen und bei-20 ° c Lagern
   10. Bereiten Sie MS/MS-Proben wie im Schritt 6.3.2-6.3.5 beschrieben vor.
   11. Führen Sie die MS/MS-Messungen auf einem MALDI-TOF/TOF Massenspektrometer. MS/MS Deckel (Laserinduzierte Zerfall) für die Fragmentierung des Peptids und wählen Sie die Vorläufer Massen von 2 und 4 mal Carbamidomethylated Arten. Verarbeiten und Auswerten der MALDI-Daten, um die gewünschte Disulfid-Konnektivität bestätigen.

(8) NMR-Experimente und Strukturanalyse

1. Lösen sich ca. 0,3-2 mg des Produktes reiner Peptid in 500 µL von H₂o₂O (90: 10) und Überführung der Mischung in ein NMR-reaktionscup.
2. Vorbereitung der Probenmaterials für Messungen an einem NMR-Spektrometer
3. 2-dimensionale Aufzeichnung [¹H,¹H] - DQF - COSY (doppelte Quantum gefiltert Korrelation Spektroskopie), [¹H,¹H] - TOCSY (total korrelierte Spektroskopie), [¹H,¹H] - NOESY (nuclear Overhauser Enhancement Spektroskopie) und [¹H,¹³C]-HSQC-(Heteronuclear einzelnen Quanten-Kohärenz) Spektren mit Wasser Unterdrückung.
4. Weisen Sie die Proton-Resonanzen der aufgenommenen Spektren und erstellen Sie die Atom-Zuordnung aus NOESY-Spektren. Vergleichen Sie die Intensitäten in den NOESY-Spektren die Obergrenze Entfernung Abhängigkeiten zwischen verschiedenen Atomen in das Peptid festlegen. Verwenden Sie die Intensität der germinal Protonen für Peak-Intensität Kalibrierung.
5. Struktur-Berechnung durchführen und Raffinesse mit einem Computer Programm zur Visualisierung von molekularen und verwenden die identifizierten Disulfid Konnektivitäten von Step 7 als zusätzliche Beschränkungen (Abbildung 3).
6. Wählen Sie die Strukturen mit den niedrigsten Energien und verwenden Sie es für Molekulardynamiksimulationen (MD).

15 verschiedene Disulfid überbrückt Isomere von µ-vor PIIIA synthetisiert und charakterisiert im Detail (Abbildung 1). Disulfid-Bindungen sind mit teilweiser Abbau und MS/MS-Analyse (Abbildung 2) gekennzeichnet. NMR-Analyse der verschiedenen Isomeren erfolgt (Abbildung 3), um die einzelnen Peptid-Strukturen zu offenbaren. Insbesondere ist eine Kombination aus RP-HPLC, MS/MS-Fragmentierung und NMR-Analyse für die eindeutige Identifizierung der Disulfid-Konnektivität erforderlich.

Abbildung 1 : Die selektive Disulfid Bindung Bildung von native µ-PIIIA über die schützende Konzernstrategie. (A) Deprotection von der Trt-geschützte Cysteine während der Peptid-Spaltung aus dem Harz. (B) die erste Disulfid Brücke Bildung von ungeschützten Cysteine. (C) Deprotection und Disulfid-Brückenbildung des Acm Cysteine geschützt. (D) Deprotection und Disulfid-Brückenbildung des tBu geschützt Cysteine. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2 : Teilreduktion Workflow für die Disulfid Bindung Zuordnung von MS/MS-Analyse. (A) Teilreduktion und Alkylierung des Peptids. (B) HPLC-Reinigung von Kontrollproben andere Reaktion. (C) Reduzierung der gereinigten Proben. Teilweise Carbamidomethylated Arten (zwei Peptide in der Mitte) Hafen Informationen über die Disulfid-Konnektivität, die von MS/MS-Analyse bestimmt wird. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Heimer, p. Et al. Konformationsänderungen µ-vor PIIIA Isomere Revisited: Auswirkungen von Cystein Pairing auf Disulfid-Bond Zuordnung und Strukturaufklärung. Analytische Chemie. 90 (5), 3321-3327 (2018). Copyright (2018) American Chemical Society. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3 : Die sequentielle Wanderung und die resultierende NMR Lösungsstruktur von einer starren (links) und eine flexible (rechts) µ-PIIIa Isomer. Die 20 Strukturen mit den niedrigsten Energien sowie die Disulfid-Konnektivität der verschiedenen Isomeren werden angezeigt. Der Vergleich der Root-Mean-Square Abweichung (RMSD) Werte verdeutlicht, dass eine starre Peptid meist zu einer besser gelöst NMR-Struktur führt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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