Synthese und Strukturaufklärung von µ-vor PIIIA Isomere mit verschiedenen Disulfid Verschaltungen

Pascal Heimer; Thomas Schmitz; Charlotte A. Bäuml; Diana Imhof

doi:10.3791/58368

Methodenartikel

Synthese und Strukturaufklärung von µ-vor PIIIA Isomere mit verschiedenen Disulfid Verschaltungen

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DOI:

10.3791/58368

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2. Oktober 2018

Pascal Heimer^*¹ , Thomas Schmitz^*¹ , Charlotte A. Bäuml^*¹ , Diana Imhof¹

¹Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn

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Zusammenfassung

Cystein-Rich-Peptide Falten in verschiedene dreidimensionale Strukturen abhängig von ihrer Disulfid-Konnektivität. Gezielte Synthese von einzelnen Disulfid Isomere ist erforderlich, wenn Puffer Oxidation nicht zu dem gewünschten Disulfid-Konnektivität führt. Das Protokoll geht es um die selektive Synthese von 3-Disulfid-gebundenen Peptide und ihre strukturellen Analyse mit NMR und MS/MS-Studien.

Zusammenfassung

Peptide mit einer hohen Anzahl von Cysteine werden in der Regel über die dreidimensionale Struktur von ihrer Disulfid-Konnektivität beeinflusst. Es ist somit sehr wichtig, um unerwünschte Disulfid Bindung Bildung bei der Peptidsynthese zu vermeiden, da es ein ganz anderes Peptid-Struktur führen kann und damit veränderte Bioaktivität. Die korrekte Bildung von Mehrfachbindungen Disulfid in ein Peptid ist jedoch schwer zu bekommen mit selbst Falten Standardmethoden wie konventionelle Puffer Oxidation Protokolle, weil mehrere Disulfid Verschaltungen gebildet werden können. Dieses Protokoll stellt eine erweiterte Strategie für die gezielte Synthese von mehreren Disulfid überbrückt Peptide, die durch Oxidation der Puffer in hoher Qualität und Quantität synthetisiert werden kann nicht erforderlich. Die Studie zeigt die Anwendung eine deutliche schützende Gruppe Strategie für die Synthese von allen möglichen 3-Disulfid-gebundenen Peptid Isomere von µ-vor PIIIA gezielt. Die Peptide werden von Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese mit einer schützenden Strategie für definierte Disulfid Bindung Bildung vorbereitet. Die jeweiligen Paare von Cysteine sind geschützt mit Trityl (Trt), Acetamidomethyl (Acm) und Tert-Butyl (tBu) Schutz Gruppen um sicherzustellen, dass während jeder Oxidationsschritt nur die erforderlichen Cysteine deprotected und verknüpft sind. Neben der gezielten Synthese ist eine Kombination von mehreren analytischen Methoden verwendet, um die korrekte Faltung und Erzeugung von das gewünschte Peptid-Strukturen zu klären. Der Vergleich der verschiedenen 3-Disulfid-gebundenen Isomeren zeigt, wie wichtig es ist, dass genaue Bestimmung und Wissen über die Disulfid-Konnektivität für die Berechnung der dreidimensionalen Struktur und für die Interpretation der biologischen Aktivität der Peptid-Isomeren. Die analytische Charakterisierung beinhaltet die genaue Disulfid Bindung Aufklärung über Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Analyse, die mit teilweise reduziert und alkyliert Derivate von der intakten Peptid-Isomer produziert durch eine angepasste Protokoll durchgeführt wird. Darüber hinaus werden die Peptid-Strukturen mit 2D Kernspinresonanz (NMR) Experimente und das Wissen aus der MS/MS-Analyse bestimmt.

Einleitung

Die Verwendung von bioaktiven Peptiden in der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung ist hoch anerkannt, weil sie potente und hoch selektive Verbindungen für bestimmte biologische Ziele¹darstellen. Für ihre Bioaktivität ist jedoch die dreidimensionale Struktur von großer Bedeutung um Struktur-Aktivitäts-Beziehungen Studien²^,³^,⁴durchzuführen. Neben der primären Aminosäure-Sequenz, die die gesamte Konformation beeinflusst, stabilisieren Disulfid Anleihen deutlich die Struktur der Cystein-Rich-Peptide⁵. Mehreren Disulfid überbr....