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Synthese und Strukturaufklärung von µ-vor PIIIA Isomere mit verschiedenen Disulfid Verschaltungen

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DOI:

10.3791/58368

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2. Oktober 2018

 ,  ,  , 
1Pharmaceutical Biochemistry and Bioanalytics, Pharmaceutical Institute, University of Bonn

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Zusammenfassung

Cystein-Rich-Peptide Falten in verschiedene dreidimensionale Strukturen abhängig von ihrer Disulfid-Konnektivität. Gezielte Synthese von einzelnen Disulfid Isomere ist erforderlich, wenn Puffer Oxidation nicht zu dem gewünschten Disulfid-Konnektivität führt. Das Protokoll geht es um die selektive Synthese von 3-Disulfid-gebundenen Peptide und ihre strukturellen Analyse mit NMR und MS/MS-Studien.

Zusammenfassung

Peptide mit einer hohen Anzahl von Cysteine werden in der Regel über die dreidimensionale Struktur von ihrer Disulfid-Konnektivität beeinflusst. Es ist somit sehr wichtig, um unerwünschte Disulfid Bindung Bildung bei der Peptidsynthese zu vermeiden, da es ein ganz anderes Peptid-Struktur führen kann und damit veränderte Bioaktivität. Die korrekte Bildung von Mehrfachbindungen Disulfid in ein Peptid ist jedoch schwer zu bekommen mit selbst Falten Standardmethoden wie konventionelle Puffer Oxidation Protokolle, weil mehrere Disulfid Verschaltungen gebildet werden können. Dieses Protokoll stellt eine erweiterte Strategie für die gezielte Synthese von mehreren Disulfid überbrückt Peptide, die durch Oxidation der Puffer in hoher Qualität und Quantität synthetisiert werden kann nicht erforderlich. Die Studie zeigt die Anwendung eine deutliche schützende Gruppe Strategie für die Synthese von allen möglichen 3-Disulfid-gebundenen Peptid Isomere von µ-vor PIIIA gezielt. Die Peptide werden von Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese mit einer schützenden Strategie für definierte Disulfid Bindung Bildung vorbereitet. Die jeweiligen Paare von Cysteine sind geschützt mit Trityl (Trt), Acetamidomethyl (Acm) und Tert-Butyl (tBu) Schutz Gruppen um sicherzustellen, dass während jeder Oxidationsschritt nur die erforderlichen Cysteine deprotected und verknüpft sind. Neben der gezielten Synthese ist eine Kombination von mehreren analytischen Methoden verwendet, um die korrekte Faltung und Erzeugung von das gewünschte Peptid-Strukturen zu klären. Der Vergleich der verschiedenen 3-Disulfid-gebundenen Isomeren zeigt, wie wichtig es ist, dass genaue Bestimmung und Wissen über die Disulfid-Konnektivität für die Berechnung der dreidimensionalen Struktur und für die Interpretation der biologischen Aktivität der Peptid-Isomeren. Die analytische Charakterisierung beinhaltet die genaue Disulfid Bindung Aufklärung über Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-Analyse, die mit teilweise reduziert und alkyliert Derivate von der intakten Peptid-Isomer produziert durch eine angepasste Protokoll durchgeführt wird. Darüber hinaus werden die Peptid-Strukturen mit 2D Kernspinresonanz (NMR) Experimente und das Wissen aus der MS/MS-Analyse bestimmt.

Einleitung

Die Verwendung von bioaktiven Peptiden in der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung ist hoch anerkannt, weil sie potente und hoch selektive Verbindungen für bestimmte biologische Ziele1darstellen. Für ihre Bioaktivität ist jedoch die dreidimensionale Struktur von großer Bedeutung um Struktur-Aktivitäts-Beziehungen Studien2,3,4durchzuführen. Neben der primären Aminosäure-Sequenz, die die gesamte Konformation beeinflusst, stabilisieren Disulfid Anleihen deutlich die Struktur der Cystein-Rich-Peptide5. Mehreren Disulfid überbrückt Peptide enthalten Conotoxine wie µ-PIIIA von Conus Purpurascens die sechs Cysteine in seiner Sequenz enthält. Diese hohe Cystein-Inhalte ermöglicht theoretisch die Bildung von 15 Disulfid-Isomere. Die richtige Disulfid-Konnektivität ist sehr wichtig für die biologische Aktivität6,7. Allerdings ist stellt sich die Frage, ob gibt es mehrere bioaktive Konformation des natürlich vorkommenden Peptide und wenn so, welche diese Isomere die höchste biologische Aktivität besitzt? Bei µ-Conotoxine, sind die biologischen Zielen Voltage-gated Natrium-Ionenkanäle und µ-PIIIA ist insbesondere für UntertypenV1.2, Na Na stärksteV1.4 und NaV1.73.

Die Synthese von Peptiden Disulfid überbrückt kann mit verschiedenen Methoden erreicht werden. Die praktischste Methode für die Bildung von Disulfid-Bindungen innerhalb ein Peptid ist der sogenannte oxidative selbst Falten Ansatz. Hier wird die lineare Vorläufer des gewünschten zyklische Peptid synthetisiert zuerst mit Festphasen-Peptidsynthese, die nach die Spaltung von Polymeren Unterstützung Oxidation in einem Puffersystem unterworfen. Redox-aktiven Substanzen wie reduzierte und oxidierte Glutathion (GSH/GSSG) werden häufig hinzugefügt, um die Bildung von Disulfid-Bindungen zu fördern. Der größte Nachteil der Puffer unterstützt Self Faltung ist, dass die Disulfid-Bindungen nicht selektiv in einer schrittweisen Weise gebildet werden. Im Vergleich zu nativen Peptid, bei dem oft nur eine bestimmte Disulfid Isomer beschrieben wird, ist es möglich, zahlreiche andere Isomere mit diesem Ansatz8zu erhalten. µ-PIIIA nachweislich bereits mindestens drei unterschiedlich gefaltet Isomere auf selbst in einer früheren Studie3Falten führen. Die Trennung von solch ein Isomer Mischung ist eher schwierig, da ähnliche Retentionszeiten, wenn chromatographische Reinigung Methoden9verwenden. Die gezielte Synthese von spezifischen Isomer ist daher vorteilhaft. Insbesondere Produkte, die ein Isomer mit definierten Disulfid-Konnektivität, eine besondere Strategie erforderlich ist, in denen das Disulfid Anleihen werden sukzessive geschlossen. Daher ist der lineare Vorläufer tragen verschiedene Schutzgruppen auf die einzelnen Cystein-Paare auf die Polymer-Unterstützung synthetisiert. Nach der Beseitigung der Cystein-Paare sind einzeln und nacheinander deprotected und verknüpft in eine Oxidationsreaktion zu der gewünschten Disulfid Anleihen10,11,12,13, 14 , 15 , 16. nach der Synthese und der Reinigung des reaktionsproduktes, es ist verpflichtet, die Identität und die Disulfid-Konnektivität bestätigen durch geeignete analytische Methoden. Zahlreiche analytische Methoden stehen zur Verfügung für die Aufklärung der primären Aminosäuresequenz, zB., MS/MS, während die Bestimmung der Disulfid-Konnektivität noch viel weniger untersuchten bleibt. Abgesehen von der Komplexität der solche mehrere Disulfid-gebundenen Peptide, produktbezogene Verunreinigungen (zB., von Disulfid kriechen), aufgrund der Probe Vorbereitung und Aufarbeitung können weiter zu komplizieren Analyse. In diesem Beitrag zeigen wir, dass die Verwendung einer Kombination von verschiedenen analytischen Techniken notwendig ist, die Identität der Disulfid Anleihen in der µ-PIIIA Isomere eindeutig zu klären. Wir haben Chromatographische Methoden mit Massenspektrometrie kombiniert und die gleichen Proben, NMR-Spektroskopie. In Matrix-unterstützte Laser desorption/ionization(MALDI) MS/MS-Analyse haben wir die Disulfid-Bindungen mit teilweiser Abbau und Iodoacetamide Derivatisierung, weil Top-Down-Analyse nicht möglich, dass dieses Peptid ist identifiziert. 2D NMR-Experimente wurden durchgeführt, um eine dreidimensionale Struktur jedes Isomer zu erhalten. So kann es durch die Kombination von verschiedenen anspruchsvollen Analysemethoden, richtig die Disulfid-Konnektivität und die dreidimensionale Struktur des Komplexes mehrere Disulfid-gebundenen Peptide7aufzuklären.

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Protokoll

Hinweis: Alle hierin verwendeten Aminosäuren wurden in der L-Konfiguration. Die Abkürzungen von Aminosäuren und Aminosäure-Derivate wurden entsprechend den Empfehlungen der Nomenklatur Ausschuss der IUB und die IUPAC-IUB Joint Commission on biochemische Nomenklatur verwendet.

(1) Festphasen-Peptidsynthese (SPPS)

Hinweis: Führen Sie die Synthese mit einem Festphasen-Peptid-Synthesizer. Führen Sie die Synthese von linearen Peptid Vorläufer der allgemeinen Sequenz ZRLCCGFOKSCRSRQCKOHRCC-NH2 Standardprotokolls für 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Chemie. Gelten die folgenden geschützte Aminosäuren: Pyr (Boc (Tert-Butyloxycarbonyl)), Arg (Pbf (2,2,4,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-Sulfonyl)), Asn(Trt), Asp(tBu), Hyp(tBu), Lys(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt), Glu(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Thr(tBu) und seine (Trt). Schützen Sie die Cystein-Paare mit Trt, Acm oder tBu-Gruppen nach der beabsichtigten Disulfid-Konnektivität.

  1. Vorbereitung
    1. Trocknen der Fmoc Rink-Amid-Harz (laden: 0,28 Mmol/g) mit einem Gefriertrockner über Nacht.
    2. Geben Sie die gewünschte Peptidsequenz (1-Buchstaben-Code) in das Programm des Synthesizers. Das Programm berechnet die benötigte Menge für jeden einzelnen Reagenz und zeigt die Lösungsmittel Mengen.
    3. Wiegen Sie die einzelnen Reagenzien (Aminosäuren, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium Hexafluorophosphate)) gemäß dem Protokoll und lösen sie in Dimethylformamid (DMF auf), eine Endkonzentration von 2,4 M (Aminosäuren) und 0,6 M ( HBTU), beziehungsweise.
    4. Die verschiedenen Reagenzien zu übertragen (Aminosäuren, HBTU, N-Methylmorpholine (NMM, 50 % in DMF), Piperidin (20 % in DMF), DMF, Dichlormethan (DCM)) zu den entsprechenden Gefäßen und legen Sie sie in die entsprechenden Schläger von der Festphasen-Peptid-Synthesizer.
    5. Die Reaktion Spalten 100 mg trocken Harz hinzu und setzen Sie sie in den Schläger des Synthesizers. Starten der Festphasen-Peptid-Synthesis.
  2. SPPS-Protokoll (bereitgestellt von Synthesizer)
    Hinweis: Das Protokoll gilt für 100 mg des Harzes (laden: 0,28 Mmol/g) hinzugefügt, um eine Reaktion Spalte für 28 µmol Skala.
    1. Vorbereitung des Harzes
      1. Spülen Sie das Harz mit 2500 µL DMF, 1400 µL DCM und 1400 µL DMF.
      2. Spülen Sie das Harz mit Luft zu, bis das Lösungsmittel entfernt wird und spülen Sie das Harz mit 2500 µL DMF.
    2. Spaltung von der Fmoc-Gruppe zu schützen
      1. Fügen Sie 20 % Piperidin in DMF (1000 µL) die Lösung aus dem Harz, der Harz und warten 6 min. entfernen. Wiederholen Sie Schritt 1.2.2.1.
      2. Spülen Sie zweimal mit DMF (1St 4000 µL, 2Nd1400 µL), spülen Sie das Harz mit Luft zu, bis das Lösungsmittel entfernt wird und zweimal mit 2000 µL DMF abspülen.
    3. Kupplung-Reaktion
      1. Die folgenden Reagenzien in einem separaten Fläschchen mischen: HBTU (450 µL; 0,6 M im DMF; 270 µmol; 9,6 gl.), NMM (125 µL; 50 % in DMF; 568 µmol; 20 GL.), Fmoc-Aminosäure (420 µL; 2,4 M im DMF; 1,01 Mmol; 36 GL.). Fügen Sie die Mischung auf das Harz und warten Sie 13 min. entfernen die Lösung aus dem Harz. Wiederholen Sie Schritt 1.2.3.1.
      2. Waschen Sie mit 3000 µL DMF. Zweimal mit 1400 µL DMF waschen. Zweimal mit 2000 µL DMF waschen.
      3. Wiederholen Sie 1.2.2 und 1.2.3 entsprechend der Anzahl der Aminosäuren in der Peptidsequenz.
    4. Endgültige Fmoc Spaltung und Harz-Waschanlagen
      1. Fügen Sie 20 % Piperidin in DMF (1000 µL) die Lösung aus dem Harz, der Harz und warten 6 min. entfernen. Wiederholen Sie Schritt 1.2.4.1..
      2. Zweimal mit DMF (1St 4000 µL, 2Nd 1400 µL) spülen Sie und spülen Sie das Harz mit Luft. Zweimal mit 2000 µL DMF, 4 mal mit 1400 µL von DCM, spülen und zweimal mit Luft zu spülen.
  3. Aufarbeitung
    1. Lyophilize des Harzes aus der Reaktion, die Spalten über Nacht nach die Synthese abgeschlossen ist.

(2) Peptid Spaltung aus dem Harz (Abb. 1A)

Hinweis: Bei der Spaltung werden alle Aminosäure-Seitenketten mit Ausnahme von Cys(Acm) und Cys (tBu) deprotected. Das Protokoll gilt für 100 mg des Harzes.

  1. Kombinieren Sie das gefriergetrocknete Harz in einer 12 ml Tube und auf 0 ° C auf Eis abkühlen.
  2. Das Harz fügen Sie 150 µL einer Schnitzeljagd-Mischung (vorbereitet von 0,75 g Phenol, 0,5 mL Thioanisole, Ethanedithiol 0,25 mL) und 1 mL Trifluoroacetic Säure (TFA, 95 % in Wasser (H2O hinzu)) auf dem Eis. Lassen Sie sanft Schütteln für 3 h bei Raumtemperatur.
  3. Die Mischung durch ein Glasfritte Filtern und das Filtrat in Röhren einzeln gefüllt mit eiskalten Diethylether (1 mL der Spaltung Mischung pro 8-10 mL Diethylether) zu sammeln. Das Peptid ausfällt als weißer Feststoff.
  4. Spülen Sie den Filterkuchen mit zusätzlichen TFA (95 % in H2O, ca. 1-3 mL).
  5. Schließen Sie die Rohre mit dem Niederschlag und Zentrifugieren Sie (3400 X g) die Suspensionen für 1 min, abgießen Sie überstand und waschen Sie die Pellets mit ca. 8-10 mL eiskaltes Diethylether. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
  6. Lassen Sie die Pellets stehen ohne Stopfen für 5 min um verbleibenden Spuren von Diethylether entfernen. Auflösen der Rohprodukt Pellets in 1 mL der Tert-Butanol (80 % in H2O). Gefriertrocknen Sie Peptide (-80 ° C).

3. Reinigung der linearen Vorstufe mit semi-präparative Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)

Hinweis: Reinigen der rohen Peptide durch Semi-präparative reversed-Phase (RP) HPLC, ausgestattet mit einer C18-Säule (5 µm Partikelgröße, 100 Å Porengröße, 250 x 32 mm) und einem 3,6 mL Injektionsschleife. Verwenden Sie einen Gradienten Elution System von 0,1 % TFA in H2O (Laufmittel A) und 0,1 % TFA in Acetonitril (MeCN) / h2O (9:1, Laufmittel B). Erkennen die Peaks bei 220 nm.

  1. Eine 15 mL Tube ca. 70 mg das Roh-Peptid hinzu und löst das solide Peptid im Volumen von HPLC-Probenschleife (zB., 3,6 mL). Verwenden Sie eine Mischung von 0,1 % TFA in MeCN/H2O (1:1). Vortex bis komplette Auflösung und Zentrifuge (3400 X g) die Lösung für 1 min.
  2. Erarbeiten der Probe (3,6 mL) in einer 5 mL Spritze und Spritzen die Probe ohne Luftblasen in die Probenschleife. In das HPLC-System injiziert. Die Peptid-Mischung mit einer Steigung von 0-50 % Laufmittel B über 120 min bei einer Durchflussrate von 10 mL/min zu trennen.
  3. Die Fraktionen in Einzelrohre zu sammeln, wie sie erscheinen. Nach der abgeschlossen ist, bereiten Sie ausgewählte Brüche für Massenspektrometrie (MS) und HPLC-Analytik (Schritt 6.1-6.2). Gefriertrocknen Brüche und lagern bei-20 ° C.
  4. Kombinieren Sie nach MS und HPLC Analyse die sortenreine Fraktionen von linearen Peptid und bereiten Sie die Proben für die ersten Oxidation.

(4) selektive Bildung von Disulfid-Bindungen

  1. 1 St Oxidation (Abbildung 1(B)
    Hinweis: Während der Peptid-Spaltung aus dem Harz, die Cys(Trt) sind deprotected, führt zu zwei ungeschützte Cys-Rückstände die Oxidation der ersten Disulfid Bindung anschließend ausgesetzt sind. Das folgende Protokoll gilt für 15 mg linear gereinigten Peptid (2864.5 g/Mol; 5,2 µmol; 1 GL.).
    1. Auflösen der linearen Peptid (15 mg) in 105 mL Isopropanol/H2O-Gemisch (1:2; 0,05 mM; pH 8,5 mit Natriumhydroxid (NaOH) eingestellt) und lassen Sie sanft schütteln in Luft unter Rahmenbedingungen für 12-48 h.
    2. Überwachen Sie die Oxidationsreaktion über HPLC und MS. Confirm die Bildung der ersten Brücke von Iodoacetamide (IAA) Derivatisierung (Schritt 6).
    3. Gefriertrocknen Sie das Peptid und verwenden Sie es ohne weitere Reinigung für die 2Nd -Oxidation.
  2. 2Nd Oxidation (Abbildung 1C)
    Hinweis: Bei der zweiten Oxidation der Deprotection von der Acm-geschützte Cysteine und die Bildung der zweiten Brücke sind katalysiert durch Jod. Das Protokoll gilt für 15 mg Peptid nach der 1St -Oxidation (2862.5 g/Mol; 5,2 µmol; 1 GL.)
    1. Das Peptid (15 mg; Endkonzentration von 0,05 mM) in 105 mL Isopropanol/H2O/1 M Salzsäure (HCl) Mischung (80:12.5:7.5) auflösen.
    2. 158 µL einer 0,1 M-Jod-Lösung in Methanol (MeOH) hinzufügen (15,7 µmol; 3 GL.) bis zur Lösung. Rühren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur 3-52 h, dh., bis die Oxidation abgeschlossen ist.
    3. Überwachen Sie die Oxidationsreaktion über HPLC und MS. Confirm die Bildung der zweiten Disulfid Bindung durch Iodoacetamide (IAA) Derivatisierung (Schritt 6).
    4. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 79 µL einer 1 M-Ascorbinsäure-Lösung in H2O (78.8 µmol; 15 GL.). Gefriertrocknen Sie das Reaktionsgemisch und verwenden Sie das Pulver für die 3rd -Oxidation.
  3. 3rd -Oxidation (Abbildung 1D)
    Hinweis: Die letzten Oxidation führt zu die Deprotection tBu geschützt Cysteine und zur Bildung von der dritten Disulfid-Brücke. Das Protokoll gilt für 15 mg Peptid nach der 2Nd -Oxidation (2718.3 g/Mol; 5,5 µmol; 1 GL.).
    1. Das Peptid (15 mg, Endkonzentration von 1 mM) in 5,5 mL TFA auflösen. Es enthält eine Schnitzeljagd Mischung bestehend aus 11,2 mg Diphenylsulfoxide (55 µmol; 10 EQ), 60.2 µL Anisole (0,6 Mmol; 100 EQ) und 97,2 µL des Trichloromethylsilane (0,8 Mmol; 150 GL.). Rühren Sie die Mischung für 3-5 h bei Raumtemperatur.
    2. Überwachen Sie die Oxidationsreaktion über HPLC und MS. Confirm die Bildung der dritten Disulfid Bindung durch Iodoacetamide (IAA) Derivatisierung (Schritt 6).
    3. Das Peptid in den Rohren mit kalten Diethylether (0 ° C, 1 mL der Reaktionslösung pro 8-10 mL Diethylether) ausgefällt.
    4. Zentrifugieren der Suspensionen (3400 X g, 1 min), den überstand abgießen und waschen die Pellets wiederholt (4 mal) mit ca. 8-10 mL kalte Diethylether (0 ° C). Lassen Sie die Pellets auf Luft (3 min) trocknen.
    5. Lösen sich die Pellets in 1 mL 80 % Tert-Butanol (in H2O), Gefriertrocknen das Peptid und bei-20 ° c Lagern

(5) Peptid-Reinigung

Hinweis: Reinigen der oxidierten Peptide durch Semi-präparative RP HPLC mit einer C18-Säule ausgestattet (10 µm Partikelgröße, 300 Å Porengröße, 250 x 22 mm) und einem 3,6 mL Injektionsschleife. Verwenden Sie einen Gradienten Elution System von 0,1 % TFA in H2O (Laufmittel A) und 0,1 % TFA MeCN/H2O (9:1, Laufmittel B). Erkennen die Peaks bei 220 nm.

  1. Eine 15 mL Tube 15 mg gefriergetrocknetes Rohprodukt aus Schritt 4.3.5 hinzufügen. Das Rohprodukt in das Volumen der HPLC-Probenschleife auflösen (zB., 3,6 mL). Verwenden Sie eine Mischung von 0,1 % TFA in MeCN/H2O (1:1). Vortex bis komplette Auflösung und Zentrifuge (3400 X g) die Lösung für 1 min.
  2. Die 3,6 mL Mischung in einer 5 mL Spritze erarbeiten Sie und injizieren Sie die Probe ohne Luftblasen in die Injektionsschleife. Starten Sie die Injektion in der HPLC-Anlage. Reinigen Sie die Peptid-Mischung mit einer Steigung von 0-50 % Laufmittel B über 120 min bei einer Durchflussrate von 10 mL/min.
  3. Die Fraktionen in Einzelrohre zu sammeln, wie sie erscheinen. Nach Abschluss die Ausführung bereiten Sie ausgewählte Brüche für MS und HPLC Analyse (Schritt 6.1-6.2). Gefriertrocknen aller Fraktionen und lagern bei-20 ° C.
  4. Nach Abschluss die Ausführung bereiten Sie ausgewählte Brüche für MS und HPLC Analyse (Schritt 6.1-6.2). Gefriertrocknen aller Fraktionen und lagern bei-20 ° C.

(6) Peptid Analytics

  1. Analytische HPLC
    Hinweis: Bestätigen Sie die Reinheit eines Peptids durch analytische RP-HPLC, ausgestattet mit einer C18-Säule (5 µm Partikelgröße, 300 Å Porengröße, 250 x 4.6 mm) und einer 500 µL Injektionsschleife. Verwenden Sie einen Gradienten Elution System von 0,1 % TFA in H2O (Laufmittel A) und 0,1 % TFA in MeCN (Laufmittel B). Erkennen die Peaks bei 220 nm.
    1. Eine Probe der Peptid-Fraktionen zu übertragen oder Reaktion Steuerelemente in einer HPLC Fläschchen und lösen Sie es in einer Mischung von 0,1 % TFA in MeCN/H2O (1:1, 300-500 µL). Legen Sie die HPLC Vials in den Autosampler der analytischen RP-HPLC.
    2. 250 µL jeder Probe zu injizieren. Verwenden Sie einen Gradienten Elution System von 0,1 % TFA in H2O (Laufmittel A) und 0,1 % TFA in MeCN (Laufmittel B). Reinigen Sie das Peptid mit einem Gefälle von 10-40 % Laufmittel B über 30 min bei einer Durchflussrate von 1,0 mL/min.
  2. MALDI TOF-Massenspektrometrie
    Hinweis: Bestätigen der Identität eines Peptids massenspektrometrisch MALDI TOF (Laufzeit) mit α- Cyano-4-Hydroxycinnamic Säure als Matrix.
    1. Eine sichtbare Menge des Peptids zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen und lösen Sie es in 10 µL einer 37 mM α- Cyano-4-Hydroxycinnamic sauren Lösung in einer Mischung von 0,1 % TFA in H2O/MeCN (1:1).
    2. Wirbel die Lösung für 10 s, 2 µL der Probe auf ein bodenziel Stahl anwenden und die Probe an der Luft trocknen.
    3. Verwenden Sie den Reflektor-Modus für die Messungen und ein Peptid Kalibrierstandards für molare Massen unter 6000 g/Mol.
  3. Iodoacetamide Derivatisierung
    Hinweis: Da Iodoacetamide mit Thiol-Gruppen reagiert, zeigt Iodoacetamide Derivatisierung der Peptide freie Thiol-Gruppen. Daher dient das Fehlen von freien Thiol-Gruppen zur Reaktionskontrolle über MS bei der 1St -Oxidation.
    1. Das Peptid in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,8, 100 µL; 0,05 mM) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zu lösen. Die peptidlösung 100 µL der Iodoacetamide in 10 mM Phosphatpuffer (4 mM) hinzu und schütteln Sie die Reaktion für 2 h bei Raumtemperatur im Dunkeln. Das Reaktionsgemisch Gefriertrocknen und bei-20 ° c Lagern
    2. Verwenden Sie eine Filter-PIPETTENSPITZE C18-Konzentration und den Zustand der Spitze mit 10 µL von 80 % (3 mal), 50 % (3 mal), 30 % (3 mal) und 0 % (3 mal) MeCN in H2O (+ 0,1 % TFA).
    3. Lösen sich die Probe aus Schritt 6.3.1 in 1 µL von 0,1 % TFA in H2O und die PIPETTENSPITZE Filter die Lösung hinzufügen. Pipette vorsichtig rauf und runter, so dass das Peptid an die Perle bindet. H2O aus der Pipettenspitze entfernen und spülen Sie die Filter-PIPETTENSPITZE mit 10 µL von 0,1 % TFA in H2O.
    4. Fügen Sie 2 µl von 0,1 % TFA in H2O/MeCN (1:1) mit einem anderen PIPETTENSPITZE (ohne Filter) auf die Perle, das Peptid enthält. Das Filtrat auf Stahl bodenziel anwenden und die Probe an der Luft trocknen.
    5. Gelten Sie 1 µL einer 37 mM α-Cyano-4-Hydroxycinnamic sauren Lösung in einer Mischung von 0,1 % TFA in H2O/MeCN (1:1) auf den Boden Stahl gezielt mit der Probe und an der Luft Trocknen der Probenmaterials.
    6. Verwenden Sie den Reflektor-Modus für die Messungen und ein Peptid Kalibrierstandards für molare Massen unter 6000 g/Mol.
  4. Aminosäure-Analyse
    Hinweis: Analysieren Sie die genauen Peptid-Konzentration sowie die Aminosäure-Zusammensetzung des Peptids mit einer Aminosäure-Analyzer.
    1. Übertragen Sie 100 µg des reinen Peptids (2604 g/Mol; 0,04 µmol) auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und lösen Sie des Pulvers in 200 µL 6 M HCl auf.
    2. 200 µL der Lösung in einer Glasampulle und spülen die 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch zweimal mit 200 µL 6 M HCl. übertragen die Spüllösung in die Glasampulle sowie.
    3. Schließen Sie die Ampulle, durch den Hals der Ampulle mit einem Bunsenbrenner Flamme erhitzen. Setzen Sie die Ampulle in ein Glasrohr. Legen Sie sie in einem Heizblock für 24 h bei 110 ° C für Hydrolyse.
    4. Öffnen der Ampulle und die Lösung zu einem 2 mL Microcentrifuge Schlauch übertragen. Waschen Sie die Ampulle (3 x 200 µL) und die Kappe (3 x 100 µL) mit bidestilliertem H2O und in den Microcentrifuge Schlauch übertragen.
    5. Die Lösung für 6 h bei 60 ° C und 210 X g in eine rotierende Vakuum Konzentrator Zentrifuge. Hydrolysierte Produkt in 192 µL Probe Verdünnungspuffer (200 µM) auflösen und die Lösung in einen Mikro-zentrifugale Filter übertragen.
    6. Zentrifugieren Sie die Probe für 1 min auf 2300 x g und Transfer 100 µL das Filtrat in ein Probenröhrchen Aminosäure Analyse. Legen Sie das Rohr in der Aminosäure-Analyzer und starten Sie die Auswertung. Ein Aminosäure Standard wird zur Kalibrierung verwendet.

7. MS/MS-Analyse von Disulfid-Konnektivität

  1. Partielle Reduktion und Alkylierung17
    1. Auflösen von 600 µg des reinen Peptids (2604 g/Mol; 0,23 µmol) in 1,2 mL 0,05 M Citrat-Puffer (pH 3,0; 0,14 mM-Peptid-Konzentration) mit 7,5 mg tris(2-carboxyethyl) Phosphin (0,02 M, DÄMMUND; 0,03 Mmol).
    2. Die Mischung bei Raumtemperatur inkubieren und mehrere Reaktion Kontrollproben (100 µL) von 0 min bis 30 min bis hin zu nehmen.
    3. Mischen Sie die Proben in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch mit 300 µL Puffer Alkylierung (0,5 M Tris-Acetat, pH 8.0; 2 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA); 1,1 M Iodoacetamide), die Reaktion zu stoppen und Carbamidomethylation der freien Thiol-Gruppen durchführen.
    4. Stoppen Sie die Reaktion nach 5 min durch Zugabe von 100 µL 10 % TFA (H2O) und laden die Proben auf Trockeneis. Bereiten Sie HPLC-Proben wie in Schritt 6.1.2 beschrieben vor und injizieren Sie 400 µL. (Abb. 2A)
    5. Verwenden Sie einen Gradienten Elution System von 0,1 % TFA in H2O (Laufmittel A) und 0,1 % TFA in MeCN (Laufmittel B). Analysieren die Peptide, die durch die Kombination von eine isokratische Trennung (10 % Laufmittel B für 15 min) und dann eine spätere Gefälle von 10-35 % Laufmittel B mehr als 25 min bei einer Flussrate von 10 mL/min erkennen die Peaks bei 220 nm.
    6. Sammeln Sie die Fraktionen in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Gefriertrocknen Sie Peptide. (Abbildung 2B)
    7. Übertragen Sie eine kleine Menge der einzelnen Fraktionen zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch für MS/MS-Analyse der oxidierten Formen (weiter bei Schritt 7.1.12).
    8. Auflösen der verbleibenden Peptid (10-100 µg) in 0,1 % TFA in H2O (10-50 µL) und einem entsprechenden Volumen einer 100 mM DÄMMUND Lösung (in H2O) hinzufügen, um eine Endkonzentration von DÄMMUND von 10 mM zu erhalten.
    9. Inkubieren Sie die Reaktion für 1 h bei 37 ° C (Abbildung 2C). Das Reaktionsgemisch Gefriertrocknen und bei-20 ° c Lagern
    10. Bereiten Sie MS/MS-Proben wie im Schritt 6.3.2-6.3.5 beschrieben vor.
    11. Führen Sie die MS/MS-Messungen auf einem MALDI-TOF/TOF Massenspektrometer. MS/MS Deckel (Laserinduzierte Zerfall) für die Fragmentierung des Peptids und wählen Sie die Vorläufer Massen von 2 und 4 mal Carbamidomethylated Arten. Verarbeiten und Auswerten der MALDI-Daten, um die gewünschte Disulfid-Konnektivität bestätigen.

(8) NMR-Experimente und Strukturanalyse

  1. Lösen sich ca. 0,3-2 mg des Produktes reiner Peptid in 500 µL von H2o2O (90: 10) und Überführung der Mischung in ein NMR-reaktionscup.
  2. Vorbereitung der Probenmaterials für Messungen an einem NMR-Spektrometer
  3. 2-dimensionale Aufzeichnung [1H,1H] - DQF - COSY (doppelte Quantum gefiltert Korrelation Spektroskopie), [1H,1H] - TOCSY (total korrelierte Spektroskopie), [1H,1H] - NOESY (nuclear Overhauser Enhancement Spektroskopie) und [1H,13C]-HSQC-(Heteronuclear einzelnen Quanten-Kohärenz) Spektren mit Wasser Unterdrückung.
  4. Weisen Sie die Proton-Resonanzen der aufgenommenen Spektren und erstellen Sie die Atom-Zuordnung aus NOESY-Spektren. Vergleichen Sie die Intensitäten in den NOESY-Spektren die Obergrenze Entfernung Abhängigkeiten zwischen verschiedenen Atomen in das Peptid festlegen. Verwenden Sie die Intensität der germinal Protonen für Peak-Intensität Kalibrierung.
  5. Struktur-Berechnung durchführen und Raffinesse mit einem Computer Programm zur Visualisierung von molekularen und verwenden die identifizierten Disulfid Konnektivitäten von Step 7 als zusätzliche Beschränkungen (Abbildung 3).
  6. Wählen Sie die Strukturen mit den niedrigsten Energien und verwenden Sie es für Molekulardynamiksimulationen (MD).

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Ergebnisse

15 verschiedene Disulfid überbrückt Isomere von µ-vor PIIIA synthetisiert und charakterisiert im Detail (Abbildung 1). Disulfid-Bindungen sind mit teilweiser Abbau und MS/MS-Analyse (Abbildung 2) gekennzeichnet. NMR-Analyse der verschiedenen Isomeren erfolgt (Abbildung 3), um die einzelnen Peptid-Strukturen zu offenbaren. Insbesondere ist eine Kombination aus RP-HPLC, MS/MS-Fragmentierung und NMR-Ana...

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Diskussion

Die Methode, die hier beschriebenen für die Synthese von Cystein-Rich-Peptide wie µ-PIIIA stellt eine Möglichkeit, selektiv Disulfid-gebundenen Isomere von der gleichen Aminosäuresequenz zu produzieren. Daher etablierte Methoden wie Fmoc-basierten Solid phase Peptid-Synthese-18 und eine definierten Schutz Strategie für die Regioselective Bildung von Disulfid-Bindungen wurden gebrauchte16. Die Festphasen-Peptidsynthese kann Aminosäure-Sequenzen auf einem Polymer-Träger (Harz...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir möchten danken A. Resemann, F. J. Mayer und D. Suckau von Bruker Daltonics GmbH Bremen; D. Tietze, A. A. Tietze, V. Schmidts und C. Thiele von der technischen Universität Darmstadt; O. Ohlenschläger der FLI Jena, M. Engeser an der Universität Bonn; K. Kramer, A. Wertung und H. Nakagami vom Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung, Köln; Susanne Neupert vom Institut für Zoologie, Köln; und Biomolekulare Magnetresonanz-Spektroskopie Einrichtungen der Universität Frankfurt für technische Unterstützung, Ausbildungsmodule, und Zugang zu Instrumenten. Finanzieller Unterstützung von der Universität Bonn, D.I. wird dankbar anerkannt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
PS PEG2000 Fmoc Rink-Amid-HarzVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM
Pyr(Boc)BachemA-3850
Arg(Pbf)Iris BiotechFSC1010
Asn(Trt)BachemB-1785
Asp(tBu)Iris BiotechFSP1020
Hyp(tBu)Iris BiotechFAA1627
Lys(Boc)BachemB-1080
Ser(tBu)Iris BiotechFSC1190
Gln(Trt)Iris BiotechFSC1043
Glu(tBu)Iris BiotechFSP1045
Trp(Boc)Iris BiotechFSC1225
Tyr(tBu)Sigma Aldrich47623
Thr(tBu)Iris BiotechFSP1210
His(Trt)Iris BiotechFDP1200
2-(1H-Benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorphosphatSigma Aldrich8510060entzündbar
DMFFisher ScientificD119entzündlich, giftig
DCMFisher ScientificD37krebserregendes
PiperidinAlfa AesarA12442entzündlich, giftig, ätzend
N-Methyl-MorpholinSigma Aldrich224286
Cys(Acm)Iris BiotechFAA1506
Cys(Trt)BachemE-2495
Cys(tBu)BachemB-1220
TrifluoressigsäureSigma Aldrich74564Giftiges, ätzendes
PhenolMerck1002060Giftig
ThioanisolAlfa AesarA14846
EthanedithiolFluka Analytical2390
DiethyletherVWR100,921Entzündbares
tert-ButanolAlfa AesarL12338Entzündbares
AcetonitrilFisher ScientificA998Entzündbares
WasserFisher ScientificW5
IsopropanolVWRACRO42383Entzündbares
NatriumhydroxidAppliChemA6579,1000Ätzendes
JodacetamidSigma AldrichI6125
JodSigma AldrichI0385
SalzsäureMerck110165Ätzende
AscorbinsäureSigma AldrichA4403
DiphenylsulfoxidSigma AldrichP35405
AnisolSigma Aldrich96109Entzündbares
TrichlormethylsilanSigma AldrichM85301Entzündbarer
ProbenverdünnungspufferLaborservice Onken
NatriumdihydrogenphosphatSigma Aldrich106370
DinatriumhydrogenphosphatSigma Aldrich795410
(2-carboxyethyl)phosphinhydrochloridSigma AldrichC4706
ZitronensäureSigma Aldrich251275
NatriumcitratdihydratSigma AldrichW302600
Tris-acetatCarl Roth, 7125
EthylendiamintetraessigsäureSigma AldrichE26282 
Peptid-Kalibrierstandard IIBruker Daltonics GmbH8222570
Name der AusrüstungFirma
Festphasen-PeptidsynthesizerIntavis Bioanalytical Instruments AGEPS 221
Lyophilisator Martin Christ GmbH  Alpha 1-2 Ldplus
semipräparativeHPLC JascoSystem PV-987
Eurospher 100 C18 Säule (RP, 5 µ m Korngröße, 100 & Aring; Porengröße, 250 x 32 mm)Knauer25QE181E2JAufreinigung der linearen
Peptidsäule Vydac 218TP1022 (RP C18, 10 µ m Korngröße, 300 & Aring; Porengröße, 250 x 22 mm)Hichrom-VWRHICH218TP1022Aufreinigung des oxidierten Peptids analytische
HPLC ShimadzuSystem LC-20AD
Vydac 218TP54 Säule (C18 RP, 5 & Mikro; m Korngröße, 300 & Aring; Porengröße, 250 x 4,6 mm) Hichrom-VWRHICH218TP54analytische Säule
geschliffenes Stahltarget (MTP 384)Bruker Daltonics GmbHNC0910436MALDI-Aufbereitung 
C18-Konzentrationsfilter (ZipTip)Merck KGaAZTC18S096MALDI Zubereitung 
MALDI MassenspektrometerBruker Daltonics GmbH ultraflexIII TOF/TOF
AminosäureanalysatorEppendorf-Biotronik GmbHLC 3000 System
NMR-Spektrometer Bruker Avance IIIBruker Daltonics GmbHBruker Avance III 600 MHz
Computerprogramm zur molekularen Visualisierungvon YASARA Biosciences GmbHYasara StrukturenNMR-Strukturberechnung
Computerprogramm zur MALDI-DatenauswertungBruker Daltonics GmbHflexAnalysis, BioToolsMS/MS Fragmentierung
analoger WirbelmischerVWRVM 3000
MikrozentrifugeEppendorf5410
ZentrifugeHettichEBA 20
RotationsvakuumkonzentratorChrist2-18 Cdplus
AnalysenwaageA& D InstrumentsGR-202-EC

Referenzen

  1. Fosgerau, K., Hoffmann, T. Peptide therapeutics: Current status and future directions. Drug Discovery Today. 20 (1), 122-128 (2015).
  2. Gongora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).
  3. Tietze, A. A., et al. Structurally diverse µ-conotoxin PIIIA isomers block sodium channel NaV1.4. Angewandte Chemie - International Edition. 51 (17), 4058-4061 (2012).
  4. Carstens, B. B., et al. Structure-Activity Studies of Cysteine-Rich α-Conotoxins that Inhibit High-Voltage-Activated Calcium Channels via GABABReceptor Activation Reveal a Minimal Functional Motif. Angewandte Chemie - International Edition. 55 (15), 4692-4696 (2016).
  5. Zhang, Y., Schulten, K., Gruebele, M., Bansal, P. S., Wilson, D., Daly, N. L. Disulfide bridges: Bringing together frustrated structure in a bioactive peptide. Biophysical Journal. 110 (8), 1744-1752 (2016).
  6. Nielsen, K. J., et al. Solution structure of µ-conotoxin PIIIA, a preferential inhibitor of persistent tetrodotoxin-sensitive sodium channels. Journal of Biological Chemistry. 277 (30), 27247-27255 (2002).
  7. Heimer, P., et al. Conformational µ-Conotoxin PIIIA Isomers Revisited: Impact of Cysteine Pairing on Disulfide-Bond Assignment and Structure Elucidation. Analytical Chemistry. 90 (5), 3321-3327 (2018).
  8. Chang, J. Y. Diverse pathways of oxidative folding of disulfide proteins: Underlying causes and folding models. Biochemistry. 50 (17), 3414-3431 (2011).
  9. Böhm, M., et al. Novel insights into structure and function of factor XIIIa-inhibitor tridegin. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (24), 10355-10365 (2014).
  10. Postma, T. M., Albericio, F. Disulfide Formation Strategies in Peptide Synthesis. European Journal of Organic Chemistry. 2014 (17), 3519-3530 (2014).
  11. Albericio, F., Isidro-llobet, A., Mercedes, A. Amino Acid-Protecting Groups. Chemical Reviews. 109 (6), 2455-2504 (2009).
  12. Annis, I., Hargittai, B., Barany, G. Disulfide bond formation in peptides. Methods in Enzymology. 289 (1988), 198-221 (1997).
  13. Kamber, B., et al. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation of S-Trityl-cysteine and S-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helvetica Chimica Acta. 63 (4), 899-915 (1980).
  14. Bosch, D. E., Zielinski, T., Lowery, R. G., Siderovski, D. P. Evaluating Modulators of Regulator of G-Protein Signaling (RGS) Proteins. Current Protocols in Pharmacology. 56 (2.8), 1-15 (2012).
  15. Mochizuki, M., Tsuda, S., Tanimura, K., Nishiuchi, Y. Regioselective formation of multiple disulfide bonds with the aid of postsynthetic S-tritylation. Organic Letters. 17 (9), 2202-2205 (2015).
  16. Peigneur, S., et al. δ-conotoxins synthesized using an acid-cleavable solubility tag approach reveal key structural determinants for NaV subtype selectivity. Journal of Biological Chemistry. 289 (51), 35341-35350 (2014).
  17. Heimer, P., et al. Application of Room-Temperature Aprotic and Protic Ionic Liquids for Oxidative Folding of Cysteine-Rich Peptides. ChemBioChem. 15 (18), 2754-2765 (2014).
  18. Kates, S. A., Albericio, F. Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide. , Marcel Dekker Inc. New York. (2000).
  19. Wüthrich, K. NMR studies of structure and function of biological macromolecules (Nobel lecture). Angewandte Chemie - International Edition. 42 (29), 3340-3363 (2003).

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities
Posted by JoVE Editors on 11/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Synthesis and Structure Determination of µ-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities. The Protocol and Materials sections were updated.

Step 1.1.3 in the Protocol section was updated from:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 2.4 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

to:

Weigh the individual reagents (amino acids, HBTU (2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)) according to the protocol and dissolve them in dimethylformamide (DMF) to a final concentration of 0.6 M (amino acids) and 0.6 M (HBTU), respectively.

Step 1.2 in the Protocol section was updated from:

NOTE: The protocol applies to 100 mg of resin (loading: 0.28 mmol/g) added to one reaction column for 28 μmol scale.

to:

NOTE: The standardized protocol usually applies to 100 mg of resin (loading: 0.53 mmol/g) added to one reaction column for 53 μmol scale leading to the following equivalents: 5 eq. HBTU, 10 eq. NMM, 5 eq. amino acid. In case of PIIIA, however, a loading of 0.28 mmol/g (28 µmol scale) is used, which results in the specified higher equivalents.

Step 1.2.3.1 in the Protocol section was updated from:

HBTU (450 µL; 0.6 M in DMF; 270 µmol; 9.6 eq.), NMM (125 µL; 50% in DMF; 568 µmol; 20 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 2.4 M in DMF; 1.01 mmol; 36 eq.).

to:

HBTU (415 µL; 0.6 M in DMF; 249 µmol; 9 eq.), NMM (112 µL; 50% in DMF; 510 µmol; 18 eq.), Fmoc-amino acid (420 µL; 0.6 M in DMF; 252 µmol; 9 eq.).

The first item in the Materials table was updated from:

Fmoc Rink amide resinNovabiochem855001

to:

PS PEG2000 Fmoc Rink-amide ResinVarian, Inc.PL3867-3764AmphiSpheres 40 RAM

Schlagwörter

Disulfidbr ckenbildungPeptidsyntheseFestphasensyntheseTandem MassenspektrometrieKernspinresonanzspektroskopieselektive OxidationHPLC ReinigungAminos ureanalysePeptidcharakterisierung

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