Hier teilen wir Methoden zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch, eine definierende Konzept der ernährungsphysiologischen Energetik und Proton Leck, die primäre Ursache der Ineffizienz im mitochondrialen Erzeugung von ATP. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie verloren Nährstoff Auslastung zu helfen, mitochondriale Funktion ausgewertet werden soll.
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Methodenartikel
Messung der Leber mitochondriale Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik zur Abschätzung der mitochondrialen Atmung in Holstein Milchvieh
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Sauerstoffverbrauch, Proton Motive force (PMF) und Proton Leck sind Messungen der mitochondrialen Atmung, oder wie gut Mitochondrien ATP NADH und FADH umsetzen können. Da Mitochondrien auch der primäre Standort für Sauerstoff und Nährstoff Oxidation zu Kohlendioxid und Wasser, wie effizient sie Sauerstoff und produzieren ATP direkt bezieht sich auf die Effizienz der Nährstoff Stoffwechsel Nährstoffbedarf des Tieres, und Gesundheit des Tieres. Der Zweck dieser Methode ist es, mitochondriale Atmung zu untersuchen, die verwendet werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Medikamente, Ernährung und Umwelteinflüsse auf mitochondrialen Stoffwechsel untersuchen. Die Ergebnisse enthalten Sauerstoffverbrauch gemessen als Proton abhängigen Atmung (Zustand 3) und Proton Leck abhängigen Atmung (Zustand 4). Das Verhältnis von Staat 3 / staatliche 4 Atmung ist definiert als Atmungskontrolle Verhältnis (RCR) und mitochondriale energetischen Effizienz darstellen kann. Mitochondriale Proton Leck ist ein Prozess, der Ableitung der mitochondrialen Membranpotentials (MMP) ermöglicht durch abkoppeln Oxidative Phosphorylierung von ADP verringern die Effizienz der ATP-Synthese. Sauerstoff und TRMP + empfindliche Elektroden mit mitochondrialen Substrate und Elektronentransport-Kette-Inhibitoren sind zur Messung der Status 3 und Staat 4 Atmung, Mitochondrien-Membran PMF (oder das Potenzial um ATP zu produzieren) und Proton Leck. Einschränkungen dieser Methode sind, dass Lebergewebe so frisch wie möglich sein muss und alle Biopsien und Assays in weniger als 10 h durchgeführt werden müssen. Dies schränkt die Anzahl der Samples, die gesammelt und von einer einzigen Person an einem Tag etwa 5 verarbeitet werden kann. Nur 1 g des Lebergewebes ist jedoch erforderlich, damit in große Tiere wie Milchkühe, die Menge der Probe erforderlich klein im Verhältnis Leber ist und es wenig Erholungszeit benötigt gibt.
Einleitung
Mitochondrien sind sehr empfindlich auf stress und ihre zelluläre Umgebung kann dazu beitragen, eine Vielzahl von Stoffwechselerkrankungen. Sauerstoff-Verbrauch und Proton Leck in den Mitochondrien sind Indikatoren für die Gesundheit der Mitochondrien. In diesem Papier Schätzung mitochondriale Energieeffizienz mit RCR beschriebenen Methoden basierend auf Sauerstoffverbrauch mit und ohne Proton Leck. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie in Nährstoff Auslastung1verloren. Änderungen im Sauerstoff-Verbrauch und Proton Leck erkennen mitochondriale Dysfunktion zur Stoffwechselerkrankung und führt zu verminderter Energie-Effizienz. Diese Methoden können auch verwendet werden, die Wirkung der verschiedenen Behandlungen auf die mitochondriale Atmung prüfen. Das übergeordnete Ziel der Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik ist Funktion der Mitochondrien und energetische Effizienz zu bewerten.
Hepatischen mitochondrialen Dysfunktion wurde mit mehreren Krankheiten bei Milchkühen. Die Fähigkeit des Zellstoffwechsels, wechseln zwischen Kohlenhydrat- und Lipid Kraftstoffe konfrontiert mit einem Energiedefizit in frühen Laktation ist durch die Anzahl und Funktion von Mitochondrien in der Zelle2beeinflusst. Mängel in der Fähigkeit der Mitochondrien zur Anpassung an eine erhöhte Nachfrage nach Energie und erhöhter β-Oxidation führt zu einer Akkumulation von intrazellulären Lipid mit Insulinresistenz verbunden und führen zur Bildung von Fettleber in frühen Laktation Milchkühe. Mitochondrien, können als Ort der Keton-Körper Produktion und Gebrauch, eine Schlüsselrolle in Ketose Milchkühe3spielen. Ein Mangel an Mitochondrien oder mitochondriale Dysfunktion wirken sich Kraftstoff Verfügbarkeit an die Peripherie und in Änderungen der Sauerstoffverbrauch oder RCR niederschlagen.
Mitochondriale Sauerstoff Verbrauch Veränderungen in Reaktion auf eine Entzündung. Sieben Tage alte Masthähnchen wurden randomisiert in eine Gruppe mit Eimeria Maxima und eine Kontrolle Gruppe4infiziert. Masthähnchen, die nicht Kokzidiose Herausforderung unterziehen hatte geringeren Sauerstoffverbrauch durch Proton Leck und höhere RCR darauf hinweist, dass Leber Mitochondrien durch zunehmende Proton Leck auf eine immun Herausforderung zu reagieren. Während Proton Leck und reaktive Spezies Sauerstoffproduktion galt einst als ein Zeichen der Mitochondrien-Membran Dysfunktion und schädlich für Energieeffizienz, jetzt ist es bekannt, dass es wichtig für den Import von Proteinen und Kalzium in Mitochondrien5 , und für die Erzeugung von Wärme1.
Elektron Leck aus der Atmungskette macht Mitochondrien anfällig reaktiven Sauerstoff-Spezies-Produktion und oxidative Schäden an Mitochondrien-Membranproteine, Lipide und mitochondriale DNA. Zunehmendem Alter der Mitochondrien Schäden vor allem an MtDNA verursacht weitere Dysfunktion in den mitochondrialen Stoffwechsel6 und höhere Krankheitsanfälligkeit der Kuh ansammeln kann. In der Praxis fließen viele Nutztiere hohe Zuschläge wie Cu, Zn und Mn antioxidative Funktion zu steigern. Allerdings Fütterung hohe Cu, Zn und Mn verringerte Milchproduktion und erhöhten Sauerstoffverbrauch durch Proton Leck (Zustand 4 Atmung)7.
Frühere Untersuchungen über die Rolle der mitochondrialen Funktion im Bereich der Energieeffizienz bei Rindern konzentriert sich auf Veränderungen in der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und Proton Leck. Nur wenige Studien bei Milchkühen veröffentlicht wurden und die meisten Zeitungen vergleichen Produktionseffizienz in Form von Rest-Futteraufnahme (RFI), mitochondriale Funktion in Rinder. Variabilität in der mitochondrialen Atmung, die Preise untersucht wurden, durch Messung von Zustand 3, Stand 4 und RCR in Lebern von stillenden Holstein-Kühen und laktierenden Rind Rinder (Brangus, Angus und Hereford)8. Die Forscher fanden keinen Zusammenhang in der mitochondrialen Atmung mit Wachstum oder Melken Merkmale für Rinder aber eine Korrelation zwischen mitochondriale Atmung und Melken Merkmale für Holsteins gemeldet. In zwei Studien wurde RFI in Rinder, mitochondriale Atmung Preise (Zustand 3, Stand 4 und RCR) im Muskel Mitochondrien9,10verglichen. Mitochondriale Atmung Preise geändert in Reaktion auf DMI und niedrige Preise wurden weniger effizient Rindfleisch Ochsen zugeordnet. In einer weiteren Studie wurden RFI Ochsen von hohen oder niedrigen RFI Bulls mit mitochondrialen Atmung und Proton Leck Kinetik zwischen den beiden Gruppen von Nachkommen11verglichen. Unterschiede wurden durch Gewinn bestätigt wird, dass die Schlussfolgerung, die gewinnen nicht Auswirkungen mitochondriale Atmung in Rinder hat.
In diesem Papier ein Experiment untersucht Leber RCR als Reaktion auf die Verfütterung von 3 Antioxidans Mineralien an laktierenden Milchkühen die Verwendung von Methoden zur Messung veranschaulicht Sauerstoffverbrauch während Zustand 4 und 3 Atmung und PMF.
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Protokoll
Alle Methoden, Protokoll und hier beschriebenen Studien stimmten mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of California, Davis.
(1) erhalten eine Leberbiopsie aus einer Milchkuh Holstein
Hinweis: Eine Leberbiopsie sollte von einem zugelassenen Tierarzt durchgeführt werden. Leberbiopsien können auf der Molkerei Website durchgeführt werden, wo die Kühe befinden. Laktierenden Milchkühe können weiterhin normalerweise gemolken werden und Milch muss nicht aus der Versorgung mit Lebensmitteln vor oder nach dem Eingriff genommen werden. Es wird empfohlen, mindestens 4 Personen erforderlich sind, um die Leberbiopsie auf eine Milchkuh durchführen: ein Tierarzt die Biopsie, ein Tier-Handler an die Kuh Hüfte zum Schutz der Biopsie Bereich und Tierarzt, eine Laborantin an der Außenseite des Stiftes zu Transf stehen durchführen Werkzeuge, Materialien und Biopsie Probe zum und vom Tierarzt und pflegen die sauberen Bereich, die auf der Rückseite eines Fahrzeugs (Abbildung 1), und einen Techniker zum Abrufen der Leber Probe und beginnen mitochondriale isoliert werden können.
- Einen Monat vor Leberbiopsien, Kühe geben eine Clostridien-Impfung. Erstellen Sie chirurgische Packs durch Autoklavieren chirurgische Handtücher, Biopsie-Instrument, Skalpell Halter und chirurgische Geräte.
- Injizieren Sie einen Tag vor der Leberbiopsie, die Kuh mit Ceftiofur Hydrochlorid 0,044 mL/kg Körpergewicht subkutan in den Hals. Monitor-Kuh-Temperatur, Aufnahme und fäkale Partituren, als Grundlage für die normale Funktion zu verwenden.
- Erstellen von Mitochondrien Isolierung Medien (MIM) Containining 220 mM Mannit, 70 mM Saccharose, 20 mM HEPES, 1 mM EDTA und 0,1 % (w/V) Fettsäure kostenlose BSA, pH 7.4 bei 4 ° C. Etwa 30 mL pro Probe wird benötigt.
- Zurückhalten Sie, Kuh physisch mit einem Headlock mit einem Halfter Bedarf (Abbildung 2). Mit dem Halfter, binden Sie den Kopf auf die linke Seite des Standrohres. Falls erforderlich, eine Freiheitsbeschränkung (Xylazin Hydrochlorid 100 mg/mL IV bei 0,010-0,015 mg/kg Körpergewicht) eingesetzt werden.
- Das Gebiet der Biopsie befindet sich an der rechten Seite 10 - 11. Intercostalneuralgie Raum (Abbildung 3). Zeichnen Sie eine gerade Linie von der richtigen Tuber Coxae, bis zu dem Punkt der rechten Schulter. Die Biopsie-Website ist, wo diese Linie schneidet mit dem 10.-11. Intercostalneuralgie Raum. Sterilisieren Sie das Gebiet der Kuh biopsiert werden durch das Rasieren einer quadratische Fläche von 10 cm (Abbildung 4). Waschen Sie die Stelle mit 10 % Providone Peeling (Abbildung 5) mit kreisenden Bewegungen. Sprühen Sie Bereich mit 70 % Ethanol-Lösung (Abbildung 6). Wiederholte Providone und Ethanol wäscht.
Hinweis: Die Leber ist in einer etwas anderen Position in Holstein Milchvieh im Vergleich zu Rindfleisch. - 2 % Lidocain HCl (10-15 mL) lokal auf den Bereich Anästhesie der Haut und darunter liegenden Muskel und Bindegewebe (Abbildung 7) zu injizieren. Wiederholen Sie die Providone und 70 % Ethanol wäscht.
Hinweis: Sind die Nervenenden in der Haut und Muskel, aber keine inneren Organe, so dass nur eine lokale anesthestic ist erforderlich. Bei den meisten soll die Kuh nur etwas Druck und keine Schmerzen während der Biopsie-Verfahren fühlen. - Machen Sie eine Stichinzision 1-2 cm durch die Haut des 10.-11. Intercostalneuralgie Raumes (Abbildung 8). Übergeben Sie eine Schackelford-Courtney bovine Leberbiopsie Instrument über die Haut und direkt das Biopsie-Instrument in eine leichte kraniale Richtung weiter durch das Diaphragma hindurch und in die Leber (Abbildung 9, Abbildung 10). Eine 1 g Probe der Leber, und entfernen Sie das Instrument (Abbildung 11). Schließen Sie die Haut mit Naht Platzierung (Abbildung 12).
- Legen Sie Leber Probe in einem konischen Rohr mit genügend MIM auf Probe, auf Eis für sofortige Mitochondrien Isolierung zu decken
- Check-Schnitt für jede Rötung, Schwellung, Wärme, oder Schmerzen innerhalb von 24 Stunden nach der Biopsie und injizieren die Kuh mit Ceftiofur Hydrochlorid 0,044 mL/kg Körpergewicht subkutan in den Hals einmal täglich für die nächsten 3 Tage (Abbildung 13). Überwachen Sie die Kuh Temperatur, Aufnahme und fäkale Partituren täglich für 1 Woche nach Leberbiopsie. Wenn Fieber entwickelt, weiter Antibiotika im Ermessen des Tierarztes.
Hinweis: Wenn eine Kuh Anzeichen von Schmerzen zeigt, z. B. treten im Schnitt Website, Recumbancy, Rötung, Wärme oder Reaktion innerhalb 1 h nach der Leberbiopsie berühren kann eine 1 mg/kg Körpergewicht IV Injektion von Flunixin Meglumine verwendet werden, um Schmerzen und Entzündungen zu lindern. Eine zweite Injektion kann bei Bedarf verabreicht werden. - 7 Tage nach der Biopsie Fäden zu entfernen.
2. isolierende Mitochondrien aus Milchkuh Leber
- So bald wie möglich nach die Leber Probe von der Kuh entfernt wird, waschen Sie die Leber Probe in MIM (Schritt 1.3), rote Blutkörperchen zu entfernen und fein hacken die Probe mit einer Schere. Die Leber sollte in ein gekühltes Becherglas mit genügend Isolierung Medien um das Gewebe feucht zu halten gehackt werden.
- Legen Sie die gehackte Leber in eine 30 mL Glasflasche mit einem Teflon-Stößel von 0,16 mm Bodenfreiheit im Eis inkubiert und MIM (1:4 w/V) enthalten.
- Leber Probe in Teflon Stößel bei 500 u / min mit 4 Hübe/min zu homogenisieren.
Hinweis: Die Leber Homogenat wird gehalten in einem Becher Eis verpackt in MIM während des gesamten Prozesses und Abschluss aller folgendermaßen Zentrifugation bei 4 ° C - Homogenat 500 X g für 10 min Zentrifugieren, Pellet zu verwerfen, überstand an einer gekühlten Zentrifugenröhrchen übertragen und anschließend Zentrifugieren des resultierenden Überstands bei 10.000 x g für 10 min die mitochondriale Pellet zu erhalten.
- Aufschwemmen und waschen das Pellet in 10 mL von MIM mit Fettsäure-kostenlose BSA und Zentrifugieren bei 8100 X g für 10 min. verwerfen überstand.
- Aufschwemmen und waschen das Pellet in 10 mL MIM ohne freie Fettsäure BSA und Zentrifugieren bei 8100 X g für 10 min. verwerfen überstand.
- Aussetzen Sie das Pellet in 200 µL der Isolierung Medien und auf Eis bis zum Sauerstoffverbrauch und Proton Leck kinetic Assays.
- Proteinkonzentration der Pellet-Suspension (1/100 Verdünnung) mit Bicinchoninic Säure (BCA) Kit pro des Herstellers Protokoll mit BSA als Standard zu bestimmen. Alle Protein gilt als mitochondriale Protein.
3. Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch (Zustand 3 und staatliche 4)
- Erstellen von Sauerstoff Verbrauch Medien (OCM) von 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes und 1 mM EGTA, entfettet pH 7.4 bei 30 ° C mit 0,3 % BSA. Ca. 3 mL pro Probe wird benötigt. Bereiten Sie auch eine Lösung von 8 μg/mL Oligomycin in Ethanol.
- OCM bei 30 ° c inkubieren Atmung-Kammer, Pumpe und Sauerstoff-Elektrode anordnungsgemäß Hersteller (Oxygraph System) eingerichtet. Die Oxygraph Software sollte bereits auf dem Computer installiert sein.
- 1 mL der OCM in die Atmung Kammer legen und kräftig rühren. Dies wird helfen, sicherzustellen, dass die Lösung mit Luft gesättigt wird.
- Die Atmung Kammer 0,35 mg Protein des mitochondrialen Proteins hinzu und behalten Sie die Temperatur auf 30 ° C.
- Sauerstoff-Verbrauch ca. 5 Minuten aufzeichnen. Die Oxygraph System Datensätze Sauerstoffkonzentration sinkt so wie Atmung erhöht, Sauerstoff-Konzentration. Wenn Sauerstoff-Verbrauch wird konstant (abnehmende Luftlinie), Rekord Sauerstoffverbrauch (Steigung der Linie = Konzentration von Sauerstoff/Zeit). Dies ist Grundlinie Sauerstoffverbrauch.
- Hinzufügen von 1,25 µL 4 mM Rotenon Lösung für komplexe hemmen ich und fügen Sie dann 5 µL 1 M Succinat-Lösung, eine Endkonzentration von 5 mM Succinat in die Atemwege Kammer zu erreichen. Dies ist Stand 4 Atmung.
- Fügen Sie 1 µL 100 mM ADP-Lösung, eine Endkonzentration von 100 μM in der Atmung-Kammer zu erreichen. Sauerstoff-Konzentration sinkt (verstärkte Atmung) und dann nach ca. 5 min eine gerade Linie wird. Sauerstoff-Verbrauch aufzeichnen (Steigung der Linie = Konzentration von Sauerstoff/Zeit). Dies ist Zustand 3 Atmung.
- Optional: Am Ende des Laufs fügen Sie FCCP (Gesamtvolumen 0,2 μM), maximale Atmung zu induzieren hinzu. Atmung für ca. 5 min (ca.) aufnehmen. Wenn Sauerstoff-Verbrauch konstant, Rekord Sauerstoffverbrauch wird. Dies ist die maximale Sauerstoff-Verbrauch.
- Respiratory Control Verhältnis (RCR) unter Verwendung der Gleichung State 3 Sauerstoff-Verbrauch berechnen / State 4 Sauerstoffverbrauch.
- Aspirieren Sie alle Lösungen aus der Atmung-Kammer. Spülen Sie die Kammer mit doppelten deionisiertes Wasser mehrmals.
4. Messung der Mitochondrien-Membran-Potential (MMP) und Proton Motive Force (PMF)
- Lösung von 80 ng/mL Nigericin in Ethanol vorzubereiten.
Hinweis: Diese Chemikalien sind in Ethanol gelöst und alle Anstrengungen unternommen werden sollten, um die Menge von Ethanol zu begrenzen, die weniger als 1 μL hinzugefügt wird, da Ethanol kann das Elektronentransportsystem zu entkoppeln und Mitchondrial Dysfunktion verursachen. - Nach dem gründlich abspülen der Kammer mit doppelten deionisiertes Wasser 1 mL der OCM in die Atmung Kammer legen und mit einer magnetischen Stir Bar kräftig rühren. Dies wird helfen, sicherzustellen, dass die Lösung mit Luft gesättigt wird. Fügen Sie Methyl-Triphenyl-Phosphonium-(TPMP +) sensible Elektrode zur Kammer-Setup hinzu. TPMP + Elektrode sollte mit dem pH-Meter verbunden sein und Werte sind pH-Meter abgelesen.
- Die Atmung Kammer 0,35 mg des mitochondrialen Proteins hinzufügen.
- Fügen Sie 1,25 µL 4 mM Rotenon Lösung für komplexe I. Datensatz Atmung für 2-5 min (ca.) hemmen. Wenn Sauerstoff-Verbrauch konstant, Rekord Sauerstoffverbrauch wird.
- Fügen Sie 0,56 μL 8 μg/mL Oligomycin Lösung für eine Endkonzentration von 2,8 µg Oligomycin 0,35 mg des mitochondrialen Proteins ADP Auslastung zu hemmen. Atmung für 2-5 min (ca.) aufnehmen. Wenn Sauerstoff-Verbrauch konstant, Rekord Sauerstoffverbrauch wird.
- Fügen Sie 0.112 μL 80 ng/mL Nigericin Lösung zur Abschaffung von pH-Gradienten über der inneren mitochondrialen Membran hinzu. Atmung für 2-5 min (ca.) aufnehmen. Wenn Sauerstoff-Verbrauch konstant, Rekord Sauerstoffverbrauch wird.
Hinweis: Rotenone und Oligomycin dienen der Elektronentransport blockieren Kette am Komplex I und ATP-Synthase, beziehungsweise. Nigericin wird hinzugefügt, um transmembranen H + Farbverlauf in einen K +-Gradienten zu konvertieren, die mit einer Elektrode gemessen werden kann. - Bereiten Sie eine Standardkurve für TPMP + durch Zugabe von 5 µL 10 mM TPMP + Lösung auf die mitochondriale Inkubation. Wiederholen Sie diesen Schritt vier weitere Male, bis eine volle Konzentration von 2,5 μM TPMP + hinzugefügt wurden.
- Atmung durch Zugabe von 5 μl 1M Succinat in die Kammer zu initiieren.
- Nehmen Sie Atmung auf, bis Sie eine stabile Spur erreicht haben, und dann titrieren Sie das System durch das Hinzufügen von Malonat. Ergänzungen von Malonat sollte 0,5 µL, 1 µL, 1,5 µL, 3,0 µL, 6.0 µL 9.0 µL, dann 12,5 µL von 0,1 mM Malonat Lösung für aufeinander folgende Ergänzungen der Malonat Konzentrationen in der Inkubation Kammer von 0,1, 0,2, 0,3, 0,6, 1,2 1,8 und 2,5 mM.
- Sammeln von Daten aus den beiden Elektroden (Sauerstoff und TPMP+). Datenerfassungs-Software aus dem Oxygraph-System lässt sich durch simultane Messungen der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch und mitochondriale Membranpotential zu sammeln und Änderungen im Sauerstoff-Verbrauch in Echtzeit beobachten. Abbildung 14 zeigt, wie das Oxygraph-System zeichnet Sauerstoffverbrauch im Laufe des Experiments.
- Berechnen Sie MMP in mV anhand der Nernst-Gleichung:
MMP = 61,5 Log ([TPMP +] hinzugefügt – externe [TPMP +]) X TPMP+ Bindung Korrektur / (0,001 x mg Protein/mL x [TPMP +])
Eine verbindliche Korrektur TPMP + 0.4 µL/mg des mitochondrialen Protein-1 wird verwendet.
Beispielrechnung anhand der Konzentrationen im Protokoll:
MMP = 61,5 X Log (5 µM-2 µM) x 0,4 / (0,001 x 0,35 mg mitochondriale Protein/mL 2 µM)
MMP = 198,9 mV - PMF Schätzung durch Auftragen einer Grafik von MMP vs. Sauerstoffverbrauch (Abbildung 15). PMF wird berichtet, wie Sauerstoff-Verbrauch auf einem Membran-Potential von 165 mV.
Hinweis: Titrieren die Elektronentransport-Kette mit Malonat (0,1 bis 2,5 mM) zeigt die kinetische Reaktion des Proton Leck MMP. Plotten von MMP gegen Sauerstoff-Verbrauch bestimmt dann, Proton Leck Kinetik. PMF wird bestimmt durch die Berechnung der Sauerstoffverbrauch bei einem gemeinsamen Membranpotential (165 mV). - Fügen Sie am Ende des letzten Laufs der Probe FCCP (0,2 μM Gesamtvolumen) maximale Atmung zu induzieren und loslassen TPMP + für Basislinienkorrektur.
- Aspirieren Sie alle Lösungen aus der Atmung-Kammer. Spülen Sie die Kammer mit doppelten deionisiertes Wasser mehrmals. Am Ende des Tages sollte die Kammer auch ein paar Mal mit Ethanol gespült werden.
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Ergebnisse
Positive Ergebnisse zeigen RCR und Proton Leck Kinetik sind in Tabelle 1 und Abbildung 15, bzw. gezeigt. In dieser Studie7, RCR und Protein-Leck Kinetik wurden gemessen in Holstein Kühe mit 70 Tagen in Milch nach Kühe 1 5 unterschiedliche Niveaus der Cu, Zn und Mn für 28 Tage gefüttert worden war. Zustand 4, maximale Proton Leck-abhängige Atmung, hatten eine Tendenz zu Mineralienaufnahme von Cu, Mn und Zn (p &...
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Diskussion
Die kritischsten Punkt im Protokoll ist eine repräsentative Lebergewebe Probe zu erhalten und beginnt die Isolation der Mitochondrien so bald wie möglich nach der Biopsie. Variation in Atmung Messungen ist niedrig (Tabelle 1) durch eine kurze Transportzeit von Kuh ins Labor. Um Verkehr zu reduzieren, wurde ein kleines Labor eingerichtet im Büro der Molkerei und Leber Proben wurden auf der Büro-Labor getrieben, wie jeder gesammelt wurde, so dass Mitochondrien innerhalb 10 min der Biopsie isoliert wurden. ...
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Diese Forschung wurde von Alltech und USDA Luke Mittel durch das Zentrum für Tiergesundheit Essen bei UC Davis School of Veterinary Medicine unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Leberbiopsie | |||
| Ausrüstung | |||
| Instrument für Rinderleberbiopsie | Sontec Instruments Englewood CO | 1103-904 | |
| Nahtmaterial | Fisher Scientific | 19-037-516 | |
| Nahtnadeln | NA | NA | Inklusive mit |
| Nahtskalpellen | Sigma - Aldrich | S2896 / S2646 | # für Griff und Klingen |
| OP-Handtücher | Fisher Scientific | 50-129-6667 | |
| Falcon Röhrchen 50 | mL Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Pinzette | Sigma - Aldrich | Z168750 | |
| 50 mL | Spritzen Fisher Scientific | 22-314387 | |
| Injektionsnadeln (22, 2 1/2) | VWR | MJ8881-200342 | |
| Kuhhalfter | Tractor Supply Co. | ||
| Baumwollabstrich | Fisher Scientific | 14-959-102 | |
| Baumwollgaze Quadrate (4x4) | Fisher Scientific | 22-246069 | |
| Medizinische Schere | Sigma - Aldrich | Z265969 | |
| Chemicals | |||
| Coccidiosis Vaccine 0,75 flasche/Kuh | Bereitgestellt von Tierarzt | ||
| Clostridien Impfstoff | Bereitgestellt vom Tierarzt | ||
| Leberbiopsie Antibiotika excenel 2 cc/100 lbs für 3 Tage | Bereitgestellt von Tierarzt Providone | ||
| Scrub | Aspen Veteterinary Resources | 21260221 | |
| Ethanol 70% | Sigma - Aldrich | 793213 | |
| Xylazinhydrochlorid 100 mg/ml i.v. bei 0,010-0,015 mg/kg Körpergewicht | Bereitgestellt vom Tierarzt | ||
| 2% Lidocain HCl (10-15 ml) | Bereitgestellt vom Tierarzt | ||
| 1 mg/kg IV Injektion von Flunixin, Megluminin | Bereitgestellt vom Tierarzt | ||
| Isolierung von Mitochondrien (Leber) | |||
| Ausrüstung | |||
| Wheaton-Fläschchen 30 mL mit einem Teflon-Stößel von 0,16 mm Abstand | Fisher Scientific | 02-911-527 | |
| Homogenisatormotor | Cole Parmer | EW-04369-10 | |
| Homogenisatorsonde | Cole Parmer | EW-04468-22 | |
| Automatische Pipette (10 mL) | Cole Parmer | SK-21600-74 | |
| Becherglas (500 mL) mit Eis | Fisher Scientific | FB100600 | |
| Gekühlte Mikrofuge | Fisher Scientific | 75-002-441EW3 | |
| Mikrofugenröhrchen (1,5 mL) | Fisher Scientific | AM12400 | |
| Chemicals | |||
| Protein-Assay-Kit (Mikrotiterplatten für Platten-Reader) | abcam | ab102536 | |
| Saccharose | Sigma - Aldrich | S7903-1KG | |
| Tris-HCl | Sigma - Aldrich | T1503-1KG | |
| EDTA | Sigma - Aldrich | EDS-1KG | |
| BSA (fettsäurefrei) | Sigma - Aldrich | A7030-50G | |
| Mannitol | Sigma - Aldrich | M4125-1KG | |
| Deionisiertes Wasser | Sigma - Aldrich | 38796 | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| Zur Herstellung von Mitochondrien-Isolationsmedien verwenden: 220 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 0,1 % (w/v) fettsäurefreies BSA, pH 7,4 bei 4 ° C, hält 2 Tage im Kühlschrank | |||
| Mitochondrial Oxygen Comsuption | |||
| <>Equipment | |||
| Oxygraph Setup + Clark Typ Sauerstoffelektrode | Hansatech (PP Systems) | OXY1 | |
| Thermoregulierte Wasserpumpe | ADInstruments | MLE2001 | |
| Clark Typ Sauerstoffelektrode | NA | NA | |
| Autopipette (1 mL) | Cole Parmer | SK-21600-70 | Im Lieferumfang des Oxy1 |
| Kleiner magnetischer Rührstab | enthalten Fisher Scientific | 14-513-95 | |
| Mikropipette (10 μ L) | Cole Parmer | SK-21600-60 | |
| pH-Messgerät | VWR | ||
| Chemicals | |||
| KCl | Sigma - Aldrich | P9333-1KG | |
| Hepes | Sigma - Aldrich | H3375-500G | |
| KH2PO4 | Sigma - Aldrich | P5655-1KG | |
| MgCl2 | Sigma - Aldrich | M1028-100ML | |
| EGTA | Sigma - Aldrich | E3889-100G | |
| Zur Herstellung von mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsmedien: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes und 1 mM EGTA, pH 7,4 bei 30 μg; C mit 0,3 % entfettetem BSA-Rotenon | |||
| (4 mM Lösung) | Sigma - Aldrich | R8875-5G | |
| Succinat (1 M Lösung) | Sigma - Aldrich | S3674-250G | |
| ADP (100 mM Lösung) | Sigma - Aldrich | A5285-1G | |
| Oligomycin (Lösung von 8 μ; g/mL in Ethanol) | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C2920 | |
| Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force | |||
| Equipment | |||
| TPMP Elektrode | World Precision Instruments. | DRIREF-2 | |
| Chemikalien-Lösungen müssen nicht frisch sein, aber sie müssen zwischen den Durchläufen in einem Gefrierschrank aufbewahrt werden | |||
| Malonat (0,1 mM Lösung) | Sigma - Aldrich | M1296 | |
| Oligomycin (8 μ g/mL in Ethanol), im Gefrierschrank aufbewahren | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Nigericin (80 ng/mL in Ethanol), im Gefrierschrank aufbewahren | Sigma - Aldrich | N7143 | |
| FCCP | Sigma - Aldrich | C3920 | |
| TPMP | Sigma - Aldrich | T200 | |
| TPMP Lösung: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes und 1 mM EGTA, pH 7,4 bei 30 ° C mit 0,3 % entfettetem BSA |
Referenzen
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