Messung der Leber mitochondriale Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik zur Abschätzung der mitochondrialen Atmung in Holstein Milchvieh

Zusammenfassung

Hier teilen wir Methoden zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch, eine definierende Konzept der ernährungsphysiologischen Energetik und Proton Leck, die primäre Ursache der Ineffizienz im mitochondrialen Erzeugung von ATP. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie verloren Nährstoff Auslastung zu helfen, mitochondriale Funktion ausgewertet werden soll.

Zusammenfassung

Sauerstoffverbrauch, Proton Motive force (PMF) und Proton Leck sind Messungen der mitochondrialen Atmung, oder wie gut Mitochondrien ATP NADH und FADH umsetzen können. Da Mitochondrien auch der primäre Standort für Sauerstoff und Nährstoff Oxidation zu Kohlendioxid und Wasser, wie effizient sie Sauerstoff und produzieren ATP direkt bezieht sich auf die Effizienz der Nährstoff Stoffwechsel Nährstoffbedarf des Tieres, und Gesundheit des Tieres. Der Zweck dieser Methode ist es, mitochondriale Atmung zu untersuchen, die verwendet werden, um die Auswirkungen der verschiedenen Medikamente, Ernährung und Umwelteinflüsse auf mitochondrialen Stoffwechsel untersuchen. Die Ergebnisse enthalten Sauerstoffverbrauch gemessen als Proton abhängigen Atmung (Zustand 3) und Proton Leck abhängigen Atmung (Zustand 4). Das Verhältnis von Staat 3 / staatliche 4 Atmung ist definiert als Atmungskontrolle Verhältnis (RCR) und mitochondriale energetischen Effizienz darstellen kann. Mitochondriale Proton Leck ist ein Prozess, der Ableitung der mitochondrialen Membranpotentials (MMP) ermöglicht durch abkoppeln Oxidative Phosphorylierung von ADP verringern die Effizienz der ATP-Synthese. Sauerstoff und TRMP + empfindliche Elektroden mit mitochondrialen Substrate und Elektronentransport-Kette-Inhibitoren sind zur Messung der Status 3 und Staat 4 Atmung, Mitochondrien-Membran PMF (oder das Potenzial um ATP zu produzieren) und Proton Leck. Einschränkungen dieser Methode sind, dass Lebergewebe so frisch wie möglich sein muss und alle Biopsien und Assays in weniger als 10 h durchgeführt werden müssen. Dies schränkt die Anzahl der Samples, die gesammelt und von einer einzigen Person an einem Tag etwa 5 verarbeitet werden kann. Nur 1 g des Lebergewebes ist jedoch erforderlich, damit in große Tiere wie Milchkühe, die Menge der Probe erforderlich klein im Verhältnis Leber ist und es wenig Erholungszeit benötigt gibt.

Einleitung

Mitochondrien sind sehr empfindlich auf stress und ihre zelluläre Umgebung kann dazu beitragen, eine Vielzahl von Stoffwechselerkrankungen. Sauerstoff-Verbrauch und Proton Leck in den Mitochondrien sind Indikatoren für die Gesundheit der Mitochondrien. In diesem Papier Schätzung mitochondriale Energieeffizienz mit RCR beschriebenen Methoden basierend auf Sauerstoffverbrauch mit und ohne Proton Leck. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie in Nährstoff Auslastung¹verloren. Änderungen im Sauerstoff-Verbrauch und Proton Leck erkennen mitochondriale Dysfunktion zur Stoffwechselerkrankung und führt zu verminderter Energie-Effizienz. Diese....

Protokoll

Alle Methoden, Protokoll und hier beschriebenen Studien stimmten mit den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der University of California, Davis.

(1) erhalten eine Leberbiopsie aus einer Milchkuh Holstein

Hinweis: Eine Leberbiopsie sollte von einem zugelassenen Tierarzt durchgeführt werden. Leberbiopsien können auf der Molkerei Website durchgeführt werden, wo die Kühe befinden. Laktierenden Milchkühe können weiterhin normalerweise gemolken werden und Milch muss nicht aus der Versorgung mit Lebensmitteln vor oder nach dem Eingriff genommen werden. Es wird empfohlen, mindestens 4 Personen erfor....

Ergebnisse

Positive Ergebnisse zeigen RCR und Proton Leck Kinetik sind in Tabelle 1 und Abbildung 15, bzw. gezeigt. In dieser Studie⁷, RCR und Protein-Leck Kinetik wurden gemessen in Holstein Kühe mit 70 Tagen in Milch nach Kühe 1 5 unterschiedliche Niveaus der Cu, Zn und Mn für 28 Tage gefüttert worden war. Zustand 4, maximale Proton Leck-abhängige Atmung, hatten eine Tendenz zu Mineralienaufnahme von Cu, Mn und Zn (p &.......

Diskussion

Die kritischsten Punkt im Protokoll ist eine repräsentative Lebergewebe Probe zu erhalten und beginnt die Isolation der Mitochondrien so bald wie möglich nach der Biopsie. Variation in Atmung Messungen ist niedrig (Tabelle 1) durch eine kurze Transportzeit von Kuh ins Labor. Um Verkehr zu reduzieren, wurde ein kleines Labor eingerichtet im Büro der Molkerei und Leber Proben wurden auf der Büro-Labor getrieben, wie jeder gesammelt wurde, so dass Mitochondrien innerhalb 10 min der Biopsie isoliert wurden. .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Leberbiopsie
Ausrüstung
Instrument für Rinderleberbiopsie	Sontec Instruments Englewood CO	1103-904
Nahtmaterial	Fisher Scientific	19-037-516
Nahtnadeln	NA	NA	Inklusive mit
Nahtskalpellen	Sigma - Aldrich	S2896 / S2646	# für Griff und Klingen
OP-Handtücher	Fisher Scientific	50-129-6667
Falcon Röhrchen 50	mL Fisher Scientific	14-432-22
Pinzette	Sigma - Aldrich	Z168750
50 mL	Spritzen Fisher Scientific	22-314387
Injektionsnadeln (22, 2 1/2)	VWR	MJ8881-200342
Kuhhalfter	Tractor Supply Co.
Baumwollabstrich	Fisher Scientific	14-959-102
Baumwollgaze Quadrate (4x4)	Fisher Scientific	22-246069
Medizinische Schere	Sigma - Aldrich	Z265969
Chemicals
Coccidiosis Vaccine 0,75 flasche/Kuh			Bereitgestellt von Tierarzt
Clostridien Impfstoff			Bereitgestellt vom Tierarzt
Leberbiopsie Antibiotika excenel 2 cc/100 lbs für 3 Tage			Bereitgestellt von Tierarzt Providone
Scrub	Aspen Veteterinary Resources	21260221
Ethanol 70%	Sigma - Aldrich	793213
Xylazinhydrochlorid 100 mg/ml i.v. bei 0,010-0,015 mg/kg Körpergewicht			Bereitgestellt vom Tierarzt
2% Lidocain HCl (10-15 ml)			Bereitgestellt vom Tierarzt
1 mg/kg IV Injektion von Flunixin, Megluminin			Bereitgestellt vom Tierarzt
Isolierung von Mitochondrien (Leber)
Ausrüstung
Wheaton-Fläschchen 30 mL mit einem Teflon-Stößel von 0,16 mm Abstand	Fisher Scientific	02-911-527
Homogenisatormotor	Cole Parmer	EW-04369-10
Homogenisatorsonde	Cole Parmer	EW-04468-22
Automatische Pipette (10 mL)	Cole Parmer	SK-21600-74
Becherglas (500 mL) mit Eis	Fisher Scientific	FB100600
Gekühlte Mikrofuge	Fisher Scientific	75-002-441EW3
Mikrofugenröhrchen (1,5 mL)	Fisher Scientific	AM12400
Chemicals
Protein-Assay-Kit (Mikrotiterplatten für Platten-Reader)	abcam	ab102536
Saccharose	Sigma - Aldrich	S7903-1KG
Tris-HCl	Sigma - Aldrich	T1503-1KG
EDTA	Sigma - Aldrich	EDS-1KG
BSA (fettsäurefrei)	Sigma - Aldrich	A7030-50G
Mannitol	Sigma - Aldrich	M4125-1KG
Deionisiertes Wasser	Sigma - Aldrich	38796
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
Zur Herstellung von Mitochondrien-Isolationsmedien verwenden: 220 mM Mannitol, 70 mM Saccharose, 20 mM HEPES, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA und 0,1 % (w/v) fettsäurefreies BSA, pH 7,4 bei 4 ° C, hält 2 Tage im Kühlschrank
Mitochondrial Oxygen Comsuption
<>Equipment
Oxygraph Setup + Clark Typ Sauerstoffelektrode	Hansatech (PP Systems)	OXY1
Thermoregulierte Wasserpumpe	ADInstruments	MLE2001
Clark Typ Sauerstoffelektrode	NA	NA
Autopipette (1 mL)	Cole Parmer	SK-21600-70	Im Lieferumfang des Oxy1
Kleiner magnetischer Rührstab	enthalten Fisher Scientific	14-513-95
Mikropipette (10 μ L)	Cole Parmer	SK-21600-60
pH-Messgerät	VWR
Chemicals
KCl	Sigma - Aldrich	P9333-1KG
Hepes	Sigma - Aldrich	H3375-500G
KH2PO4	Sigma - Aldrich	P5655-1KG
MgCl2	Sigma - Aldrich	M1028-100ML
EGTA	Sigma - Aldrich	E3889-100G
Zur Herstellung von mitochondrialen Sauerstoffverbrauchsmedien: 120 mM KCL, 5 mM KH2PO4, 5 mM MgCl2, 5 mM Hepes und 1 mM EGTA, pH 7,4 bei 30 μg; C mit 0,3 % entfettetem BSA-Rotenon
(4 mM Lösung)	Sigma - Aldrich	R8875-5G
Succinat (1 M Lösung)	Sigma - Aldrich	S3674-250G
ADP (100 mM Lösung)	Sigma - Aldrich	A5285-1G
Oligomycin (Lösung von 8 μ; g/mL in Ethanol)	Sigma - Aldrich	75351
FCCP	Sigma - Aldrich	C2920
Mitochondrial Membrane Potential and Proton Motive Force
Equipment
TPMP Elektrode	World Precision Instruments.	DRIREF-2
Chemikalien-Lösungen müssen nicht frisch sein, aber sie müssen zwischen den Durchläufen in einem Gefrierschrank aufbewahrt werden
Malonat (0,1 mM Lösung)	Sigma - Aldrich	M1296
Oligomycin (8 μ g/mL in Ethanol), im Gefrierschrank aufbewahren	Sigma - Aldrich	75351
Nigericin (80 ng/mL in Ethanol), im Gefrierschrank aufbewahren	Sigma - Aldrich	N7143
FCCP	Sigma - Aldrich	C3920
TPMP	Sigma - Aldrich	T200
TPMP Lösung: 10 mM TPMP, 120 mM KCL, 5 mM Hepes und 1 mM EGTA,  pH 7,4 bei 30 ° C mit 0,3 % entfettetem BSA

Schackelford-Courtney 101966599Bicinchoninsäure (BCA)