Dieses Protokoll soll porcinen Hepatozyten Isolierung und ex-Vivo gen Lieferung um Modelle der metabolischen Krankheiten durch autologe Stammzelltransplantation heilen zu beschreiben. Obwohl dieses Modell einzigartige Vorteile, die erfolgreichen Therapie bevorzugen genießt, ist die Anwendung eine relevante Grundlage um weitere Krankheiten und Indikationen.
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Methodenartikel
Lentivirale Vektor-vermittelte Gentherapie von Hepatozyten Ex Vivo für autologe Transplantation bei Schweinen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Gentherapie ist eine ideale Wahl um viele angeborene Fehler des Stoffwechsels der Leber zu heilen. Ex-Vivo, Lentivirale Vektoren haben erfolgreich eingesetzt bei der Behandlung vieler hämatopoetischer Erkrankungen beim Menschen, da ihre Verwendung bietet stabile Transgene Ausdruck durch den Vektor Fähigkeit in das Wirtsgenom integrieren. Diese Methode demonstriert die Anwendung der ex Vivo Gentherapie von Hepatozyten, ein großes Tier Modell des erblichen Tyrosinemia Typ ich. Dieser Prozess besteht aus 1) Isolierung der primäre Hepatozyten von autologen Empfängerin/Tier, 2) ex Vivo gen Lieferung per Hepatozyten Transduktion Lentivirale Vektor mit 3) autologe Transplantation von korrigierten Hepatozyten-Portal Vene Injektion. Erfolg der Methode im allgemeinen stützt sich auf effiziente und sterile Entfernung der Leber Resektion, sorgfältiger Umgang mit der ausgeschnittenen Probe zur Isolierung von lebensfähigen Hepatozyten für wieder anwachsen, hochprozentigen Transduktion der isolierten Zellen ausreichend und aseptische Eingriffe durchweg um Infektionen zu vermeiden. Technisches Versagen bei jedem dieser Schritte führt zu niedrigen Ertrag von lebensfähigen ausgestrahlt Hepatozyten für autologe Transplantation oder Infektion des Tieres Spender/Empfänger. Das Schwein-Modell des menschlichen Typ 1 erbliche Tyrosinemia (HT-1) für diese Vorgehensweise gewählt ist eindeutig eine solche Methode, zugänglicher, wie auch ein kleiner Prozentsatz der Engraftment korrigierten Zellen zur Wiederbesiedlung der Leber mit gesunden Zellen basierend auf einem leistungsstarken führt selektiven Vorteil gegenüber Native-Kranke Hepatozyten. Obwohl dieses Wachstum-Auswahl nicht wahr für alle Indikationen werden, dieser Ansatz ist eine Grundlage für die Expansion in andere Indikationen und ermöglicht die Manipulation dieser Umgebung zu Adresse zusätzliche Krankheiten, sowohl in der Leber und darüber hinaus, während Steuerung für die Exposition gegenüber viralen Vektoren und Gelegenheit für Ziel-Toxizität und Tumorigenität.
Einleitung
Angeborene Fehler der Stoffwechsel der Leber sind eine Familie von Erbkrankheiten, die gemeinsam so viele wie 1 in 800 Lebendgeburten1betreffen. Viele dieser Krankheiten sind einzelne gen Mängel2 und funktional durch die Einführung einer einzigen korrigierten Kopie des betroffenen Gens in einer ausreichenden Anzahl von Hepatozyten3geheilt werden können. Der tatsächliche Prozentsatz der Hepatozyten, die korrigiert werden muss hängt von der Krankheit4 und ist weitgehend abhängig von der Art des Proteins, die es kodiert, zum Beispiel ausgeschiedenen Proteine gegen cytoplasmati....
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Protokoll
Alle tierische Verfahren wurden wurden nach institutionellen Richtlinien durchgeführt und überprüft und genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) vor der Durchführung der Studie. Hier beschriebene Verfahren wurden auf männlichen und weiblichen großen weißen Bauernhof Schweine (50 % Landrace/50% Large White genetischen Hintergrund) bis zu 3 Monate alt durchgeführt, die gesund und für Chirurgie geeignet erachtet werden. Die Tiere sind sozial untergebracht, es sei denn, durch institutionelle tierärztliche Versorgung Mitarbeiter als unvereinbar angesehen. Tiere sind angemessene Höhe der Chow zweimal tägliche und beobachteten klinische....
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Ergebnisse
Die Leber Resektion und autologe Transplantation sind schematisch in Abbildung 1dargestellt. In einer repräsentativen Gruppe von 5 Schweine, die hepatischen Resektion unterzogen, hatten die meisten Erträge von > 1 x 109 Hepatozyten mit ca. 80 % Lebensfähigkeit (Tabelle 2), bietet viele Zellen für jede Art von gewünschten Manipulationen, einschließlich gen Therapie. Nachfolgende Kultur nicht transplantiert Teil der vorbereiteten .......
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Diskussion
Dieser Bericht beschreibt eine ex Vivo autologe gen Therapieansatz um ein porcinen Modell HT-1 zu heilen. Es geht um eine partielle Hepatektomie, gefolgt von ex-Vivo Hepatozyten Isolation und Transduktion von isolierten Hepatozyten mit Lenti Virus tragen das korrigierende Transgen. Korrigierte autologe Hepatozyten sind dann zurück zum FAH mangelhaft Tier durch die Pfortader8transplantiert. Obwohl die beschriebenen Verfahren auf alle großen Tiermodellen mit einigen Änderungen anwe.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Die Autoren danken Duane Meixner für Kompetenz bei der Durchführung der Pfortader Einspritzung, Steve Krage, Joanne Pederson und Lori Hillin für Unterstützung bei chirurgischen Eingriffen. Diese Arbeit wurde durch die Kinder Krankenhaus von Minnesota-Stiftung und Regenerationsmedizin Minnesota unterstützt. R.D.H. wurde durch eine NIH K01 DK106056 Award und eine Mayo-Klinik-Zentrum für Regenerative Medizin Career Development Award finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2-(2-Nitro-4-trifluormethylbenzoyl)-1,3-cyclohexandion (NTBC) | Yecuris | 20-0027 | |
| 12 mm Trokar | Covidien | B12STS | |
| 5 mm Trokar | Covidien | B5SHF | |
| Endo-Chirurgie-Klammergerät 60 | Covidien | EGIA60AMT | |
| Endo-Chirurgie-Klammergerät 45 | Covidien | EGIA45AVM | |
| Endo Chirurgisches Klammergerät 30 | Covidien | SIG30AVM | |
| Endo-Fangbeutel | Covidien | 173050G | |
| 0 PDS | Ethicon | Z340H | |
| 2-0 Vicryl | Ethicon | J459H | |
| 4-0 Vicryl | Ethicon | J426H | |
| Dermabond | Ethicon | DNX12 | Steriler Verband |
| Williams'-E Pulver | Gibco | ME16060P1 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S8875-1KG | |
| HEPES | Fisher | BP310-1 | |
| Kugelschreiber/Streik | Gibco | 15140-122 | |
| Fötales Rinderserum | Corning | 35-011-CV | |
| NaCl (g/L) | Sigma Aldrich | S1679-1KG | |
| KCl (g/L) | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| EGTA (g/L) | Oakwood Chemical | 45172 | |
| N-Acetyl-L-Cystein | Oakwood Chemical | 3631 | |
| N-A-C, g/L) | Sigma Aldrich | A9165-100G | |
| CaCl2 2H2O (g/L) | Sigma Aldrich | 223506-500G | |
| Kollagenase D (mg/ml) | Crescent Chemical | 17456.2 | |
| Dulbecco's modifiziertes Adlermedium (DMEM) | Corning | 15-013-CV | |
| Dexamethason | Fresenius Kabi | NDC6337 | |
| Epidermaler Wachstumsfaktor | Gibco | PHG0314 |
Referenzen
- Mak, C. M., Lee, H. C., Chan, A. Y., Lam, C. W. Inborn errors of metabolism and expanded newborn screening: review and update. Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. 50 (6), 142-162 (2013).
- Hansen, K., Horslen, S. Metabolic liver disease in childr....
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Nachdrucke und Genehmigungen
