Diese Methode der Trypanosomen Trennung vom Blut hängt ihre Oberflächenladung wird weniger negativ als Blut Säugerzellen. Infiziertem Blut ist platziert und auf ein Anion-Exchanger Spalte behandelt. Diese Methode, die passende Diagnose für afrikanische Trypanosomiasis, bietet gereinigte Parasiten für immunologische, biologische, biochemische, pharmazeutische und molekularbiologischen Untersuchungen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Reinigung der extrazellulären Trypanosomen, einschließlich Afrika, aus Blut von Anionen-Austauscher (Diethylaminoethyl-Zellulose Spalten)
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Diese Methode ermöglicht die Trennung von Trypanosomen, Parasiten verantwortlich für tierische und menschliche afrikanische Trypanosomiasis (Hut), von infiziertem Blut. Dies ist die beste Methode für die Diagnose der ersten Phase HAT und außerdem dieser Parasit Reinigungsverfahren ermöglicht serologische und Forschung Untersuchungen.
Hut wird durch Tsetse-Fliege übertragen Trypanosomen Trypanosomen rhodesiense verursacht und T. B. Rhodesiense. Damit verbundenen Trypanosomen sind die Erreger der Tier Trypanosomiasis. Trypanosomen-Erkennung ist essentiell für Hut-Diagnose, Behandlung und Nachsorge. Die hier beschriebene Technik ist die empfindlichste Parasit Erkennung Technik, angepasst auf Freilandbedingungen für die Diagnose von T. B. rhodesiense Hut und kann innerhalb einer Stunde abgeschlossen sein. Blut wird auf ein Anion-Exchanger Säule (DEAE Zellulose) vorher eingestellten pH-Wert 8 geschichtet und Elution Puffer hinzugefügt. Stark negativ geladenen Blutzellen werden auf die Säule adsorbiert, während die weniger negativ geladenen Trypanosomen durchlaufen. Gesammelten Trypanosomen sind pelleted durch Zentrifugation und beobachtet von Mikroskopie. Darüber hinaus sind Parasiten ohne Zellschädigung bereit, unter Beibehaltung ihrer Infektiosität.
Gereinigte Trypanosomen sind erforderlich für immunologische Tests; Sie sind in der Trypanolysis-Assay, der Goldstandard in der Hut Serologie eingesetzt. Gefärbte Parasiten sind in der Karte Agglutination Test (CATT) für Feld Serologie genutzt. Antigene von gereinigten Trypanosomen wie Variante Oberfläche Glykoprotein, Exoantigens, sind auch in verschiedenen Immunassays verwendet. Die hier beschriebene Vorgehensweise richtet sich an afrikanischen Trypanosomen; Infolgedessen haben Chromatographie Bedingungen zu jeder Trypanosomen-Stamm, und ganz allgemein an das Blut der einzelnen Arten der Host Säugetier angepasst werden.
Diese faszinierenden Krankheitserreger sind leicht gereinigt und zur Verfügung in biochemische, molekulare und Zelle Biologie Studien einschließlich Kokultur mit Wirtszellen zu untersuchen, Wirt-Parasit-Beziehungen auf der Ebene der Membranrezeptoren, Signal- und gen Ausdruck; Drogen Sie-Tests in Vitro; Untersuchung von gen-Löschung, Mutation oder Überexpression auf metabolische Prozesse, Zellskelett Biogenese und Parasiten überleben.
Einleitung
Die vorgestellte Methode beschrieben hier ermöglicht die Trennung von Trypanosomen, Parasiten verantwortlich für tierische und menschliche afrikanische Trypanosomiasis (Hut), aus Blut. Dies ist die beste Methode für die Diagnose der ersten Phase HAT und außerdem ermöglicht dieser Parasit Reinigungsverfahren robuste serologische und Forschung Untersuchung.
Hut, verursacht durch Tsetse-Fliege übertragen Trypanosomen Trypanosomen rhodesiense und T. B. Rhodesiense1. Diese Protozoen Parasiten vermehren extrazellulär in Blut, Lymphe und interstitiellen Flüssigkeiten in der ersten Phase der Erkran....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Untersuchungen gemäß den Leitlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (NIH Publikation Nr. 85±23, revidiert 1996). Protokolle wurden von unseren lokalen Ethikkommission genehmigt.
(1) Tiere
- Halten Sie weibliche Schweizer (von 1) Mäuse im Alter von acht bis zehn Wochen alt, 20-25 g, bei einem Tier Gehäuse Anlage 15 Tage vor jedem Experiment. Beherbergen sie in belüfteten Boxen, die in einem geschützten, Temperatur (22 ° C) und Luftfeuchtigkeit (50 %) gehalten werden Zimmer mit 12 Stunden ein-/Licht-Zyklus gesteuert.
- Den Tieren freien Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser. Minimieren Sie Schmerzen, ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Gereinigte Trypanosomen wurden in Arzneimitteltests verwendet. Parasiten sind in Kultur Brunnen mit Verdünnungsreihen von bestimmten Medikamenten, entweder allein oder gemischt19übertragen. Mikroskopische Beobachtungen auswerten Motilität ist ein Marker der Lebensfähigkeit, kann durchgeführt werden, wenn nur ein paar Enten getestet werden, während AlamarBlue Zelle Lebensfähigkeit Assay ist eine hervorragende Methode für große Beweglichkeit Assays während Drogen-scr.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Gereinigte Trypanosomen sind ein mächtiges Mittel, Immunologie, Biochemie, zelluläre und molekulare Biologie zu studieren. Große Flächen von Daten und Ergebnissen erhielten von Trypanosomen, die hat dann dazu beigetragen, andere eukaryotische Zellen30Informationen einzuholen. Trypanosomen sind auch Gegenstand der Forschung wichtig und interessant, weil sie zahlreiche Mechanismen, die ihnen ermöglichen entwickelt haben, zu überleben und wachsen in zwei sehr unterschiedlichen Umgebungen: die Tsetse-.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Danksagungen
Wir danken allen Mitgliedern der UMR 177 INTERTRYP IRD CIRAD Université de Bordeaux. Diese Forschung wurde unterstützt durch die interne Finanzierung von Universität von Bordeaux und Unterstützung durch die ANR, LABEX ParaFrap ANR-11-LABX-0024, und von der Association pour le Développement De La recherche de Parasitologie et Médecine Tropicale und der Service de Coopération et d ' Action Culturelle de l'Ambassade de France À Bangui (Centrafrique).
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 10 mL Pipetten | Falcon | 357,551 | |
| 2 mL Pipetten | Falcon | 352,507 | |
| Zentrifugationsröhrchen 50 mL | Falcon | 352,070 | |
| Zentrifuge | Sigma Aldrich | 4K15 | |
| DEAE Zellulose | Santa Cruz s | /c- 211213 | 100 G |
| Filterpapier | Whatman | 1,001,125 | |
| Flachkolben mit engem Hals | Duran | 21 711 76 | 6000 mL |
| Glukose | VWR | 101174Y | 500 G |
| Heparin | Sigma Aldrich | H3149-50KU | 5 000 U |
| KH2PO4 | VWR | 120 26936.260 | 500 G |
| Mikroskop | Olympus | CH-20 | |
| Mikroskopdeckgläser | Thermofisher wissenschaftliche | CB00100RA020MNT0 | |
| Objektträger | Thermofisher wissenschaftliche | AGAA000001 | |
| Na2HPO4 | VWR | 100 28026; 260 | 500 G |
| NaCl | VWR | 27800.291 | 1 KG |
| NaH2PO4 | VWR | 110 33616; 262 | 500 g |
| Nalgene Kunststoff Medien Flaschen Größe 125 mL | Thermofisher scientific | 342024-0125 | |
| Nalgene Kunststoff Medien Flaschen Größe 500 mL | Thermofisher scientific | 342024-0500 | |
| Pasteur Pipette | VWR | BRND125400 | |
| Penicillin 10.000 UI/Streptomycin 10.000 µ g | EUROBIO | CABPES01 OU | 100 mL |
| Phenolrot | Sigma Aldrich | P0290 | 100 mL |
| Spritze | Dutscher | SS+10S21381 | |
| Gewebekulturhaube | Thermoelectro Corporation | MSC-12 | |
| Trypanosoma brucei brucei | Institut für Tropenmedizin (Antwerpen, Belgien). | ANTAT 1.1 | |
| Trypanosoma brucei gambiense | Institut für Tropenmedizin (Antwerpen, Belgien). | ITMAP 1893 | |
| Trypanosoma musculi | London School of Hygiene and Tropical Medicine (UK) | Partinico II |
Referenzen
- Büscher, P., Cecchi, G., Jamonneau, V., Priotto, G. Human African trypanosomiasis. Lancet. 390 (10110), 2397-2409 (2017).
- Lejon, V., Bentivoglio, M., Franco, J. R. Human African trypanosomiasis. Handbook of Clinical Neurology. 114, 169-181 (2013).
- Giordani, F., Morrison, L. J., Rowan, T. G., De Koning, H. P....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
