Methodenartikel

Reverse Transkription-Loop-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) Assay für Zika-Virus und Housekeeping-Gene in Urin, Serum und Moskito-Proben

DOI:

10.3791/58436

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14. September 2018

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1Department of Urology, Beaumont Health System, 2Foundational Sciences, College of Medicine, Central Michigan University, 3Oakland University William Beaumont School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll bietet eine effiziente und kostengünstige Methode zum Zika Virus erkennen oder steuern Ziele im menschlichen Urin und Serum-Proben oder Mücken durch reverse Transkription Schleife-vermittelten Isothermen Amplifikation (RT-Lampe). Diese Methode erfordert keine RNA isoliert und kann innerhalb von 30 Minuten erfolgen.

Zusammenfassung

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Infektion mit Zika-Virus (ZIKV) kann bei Erwachsenen asymptomatisch sein, jedoch Infektion während der Schwangerschaft kann zu fehl- und schwere neurologische Geburtsschäden führen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, ZIKV in Menschen- und Moskito Proben schnell zu erkennen. Der derzeitige Goldstandard für ZIKV Erkennung ist quantitative reverse Transkription PCR (qRT-PCR); reversen Transkription Schleife-vermittelten Isothermen Verstärkung (RT-Lampe) kann für eine effiziente und kostengünstige Prüfung ohne die Notwendigkeit für teure Ausrüstung. In dieser Studie dient RT-Lampe ZIKV-Erkennung in verschiedenen biologischen Proben innerhalb von 30 min ohne erste Isolierung der RNS aus der Probe. Diese Technik wird gezeigt, mit ZIKV infizierten Patienten Urin und Serum und infizierten Mücke Proben. 18 s ribosomalen Ribonukleinsäure und Aktin werden als Steuerelemente in Menschen- und Moskito Proben verwendet.

Einleitung

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Im Jahr 2015 sammelte Zika-Virus (ZIKV) Prominente weltweite Aufmerksamkeit als eine Infektionskrankheit von Sorge denn Infektion während der Schwangerschaft mit fehl-, Totgeburt, schwere neurologische Geburtsschäden einschließlich Mikrozephalie sowie andere angeborene verbunden war Geburtsschäden1. In seltenen Fällen wurde ZIKV mit Guillain-Barré-Syndrom. ZIKV ist in erster Linie von Aedes -Mücken übertragen; Es kann jedoch auch durch sexuellen Kontakt1verteilt werden. Angesichts der Tatsache, dass die Infektion mit ZIKV bei den meisten Menschen asymptomatisch ist oder präsentiert mit milden grippeähnlichen Sym....

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Protokoll

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Alle hier beschriebene Methoden sind durch institutionelle Review Board (IRB) der Beaumont Gesundheit genehmigt worden. Alle Versuche wurden im Einklang mit geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt.

Achtung: Alle potentiell infektiöse Materialien sollten nach Biosafety Level 2 Standards einschließlich der Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden. Alle Prozeduren erzeugen Aerosol sollte in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden. Darüber hinaus sollten arbeiten mit live Mücken in der entsprechenden Gliederfüßer Containment Level 1-3-Anlage durchgeführt werden. Da der Verband der ZIKV Infektion mit angebore....

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Ergebnisse

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RT-Lampe Reaktionen können mit drei verschiedenen Methoden analysiert werden. Zunächst mit dem Zusatz eines fluoreszierenden Nukleinsäure-Farbstoffs werden positive Reaktionen gelb/grün in der Farbe negative Reaktionen erscheinen wo Orange in der Farbe mit dem bloßen Auge. Zweitens führt die Zugabe von fluoreszierenden Nukleinsäure-Farbstoff, RT-LAMP-Reaktion ein Fluoreszenzsignal wenn die Proben mit UV-Licht angeregt werden. Negative Reaktionen haben keinen nachweisbaren Fluoreszenzsigna.......

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Diskussion

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Die ZIKV RT-Lampe-Assay in diesem Papierarbeiten mit Menschen- und Moskito Proben6beschrieben. Der Nachweisgrenze wurde ca. 1 Genom entspricht6, was ausreichen sollte, da die typische Viruslast eines symptomatischen ZIKV infizierten Patienten 103 bis 106 PFU/mL7. Darüber hinaus kann diese Methode ZIKV in Proben ohne erste isolierende RNA und ohne Verstärkung der Virus in der Zellkultur erkennen. Dies verringert deutli.......

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Offenlegungen

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LEL und MBC haben geistiges Eigentum auf Zika Virus Diagnosemethoden. Die übrigen Autoren haben keinen Interessenkonflikt.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von Maureen und Ronald Hirsch Familie philanthropischen Beitrag und Neurowissenschaften Feldinstitut, St. Maria von Michigan unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. Wir danken auch Dr. Bernadette Zwaans und Elijah Ward für ihre kritische Durchsicht des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Bst 2.0 WarmStart DNA-PolymeraseNew England BiolabsM0537S Isothermer
AmplifikationspufferNew England BiolabsB0537S
WarmStart RTx Reverse TranskriptaseNew England BiolabsM0380S
Antarktische Thermolabile UDGNew England BiolabsM0372S
MgSO4New England BiolabsB1003S
100 mM dATP-LösungNew England BiolabsN0440SDesoxynukleotid-Set N0446S
100 mM dCTP-LösungNew England BiolabsN0441SDesoxynukleotid-Set N0446S
100 mM dTTP-LösungNew England BiolabsN0443SDesoxynukleotid-Set N0446S
100 mM dGTP-LösungNew England BiolabsN0442SDesoxynukleotid-Set N0446S
100 mM dUTP-LösungThermo Fisher ScientificR0133
SYBR Green I Nukleinsäure Gel-FleckInvitrogenS7563
Nancy-520Sigma Aldrich01494
DNA-MassenInvitrogen10-068-013
Zika Positive KontrolleRobert Koch-Institut, DeutschlandN/A
AgaroseThermo Fisher ScientificBP1600
BlueJuice Gel LadepufferInvitrogen
PrimerIntegrierte DNA-TechnologienCustom Oligo
Nuclease-FreeWater AmbionAM9938
UrinkonservierungsmittelNorgen Biotek18126
ZIKV PCR StandardRobert Koch InstituteN/AVero E6 Zellüberstände
DENV2 Neuguinea C ControlConnecticut Agricultural Experiment BahnhofN/A
Leiter für niedrige10816015

Referenzen

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  1. Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. New England Journal of Medicine. 374 (16), 1552-1563 (2016).
  2. Francois, P., et al. Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications. Federation of European Micr....

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Schlagwörter

Zika Virus NachweisUrin und SerumprobenAnalyse von M ckenprobenRNA Isolierung freifluoreszierender Nukleins urefarbstoffAgarose GelelektrophoreseInkubation im HeizblockRekonstitution der PrimerHerstellung des Master Mixes

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