Method Article

Studium der Protein Import in Chloroplasten mit Protoplasten

DOI:

10.3791/58441

⸱

December 10th, 2018

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Proteine in Protoplasten zum Ausdruck zu bringen, mit PEG-vermittelten Transformationsmethode. Die Methode bietet einfach Ausdruck der interessierenden Proteine und effiziente Untersuchung von Protein-Lokalisierung und der Importvorgang für verschiedenen experimentellen Bedingungen in-vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Chloroplasten ist eine wesentliche Organellen, die für verschiedene zelluläre Prozesse in Pflanzen wie Photosynthese und die Produktion von vielen sekundären Pflanzenstoffen und Lipiden ist. Chloroplasten erfordern eine große Zahl von Proteinen für diese verschiedenen physiologischen Prozesse. Über sind 95 % der Chloroplasten Proteine Zellkern codiert und in Chloroplasten aus dem Cytosol importiert nach der Übersetzung auf cytosolische Ribosomen. Somit ist die ordnungsgemäße Einfuhr oder Ausrichtung dieser Kern-codierte Chloroplasten Proteine zu Chloroplasten entscheidend für das reibungslose Funktionieren der Chloroplasten sowie der Pflanzenzelle. Kern-codierte Chloroplasten Proteine enthalten Signalsequenzen für spezifische Ausrichtung auf Chloroplasten. Molekulare Maschinen, die in den Chloroplasten oder Zytosol lokalisiert diese Signale zu erkennen und führen Sie den Importvorgang. Um die Mechanismen der Protein Import oder Ausrichtung auf Chloroplasten in Vivozu untersuchen, haben wir eine schnelle, effiziente Protoplasten basierende Methode zur Analyse von Protein Import in Chloroplasten von Arabidopsis entwickelt. Bei dieser Methode verwenden wir Protoplasten von Blatt Gewebe von Arabidopsisisoliert. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten, um den Mechanismus zu untersuchen, mit dem Proteine in Chloroplasten importiert werden.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Chloroplasten ist eines der wichtigsten Organellen in Pflanzen. Eine der Hauptfunktionen der Chloroplasten soll Photosynthese1durchführen. Chloroplasten führen auch viele andere biochemischen Reaktionen für die Produktion von Fettsäuren, Aminosäuren, Nukleotide und zahlreiche sekundäre Pflanzenstoffe1,2. Für all diese Reaktionen erfordern Chloroplasten eine große Anzahl von verschiedenen Arten von Proteinen. Das Chloroplast Genom enthält jedoch nur etwa 100 Gene3,4. Daher müssen Chloroplasten den Großteil ihrer Proteine aus ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wachstum von Arabidopsis-Pflanzen

  1. Bereiten Sie 1 L Gamborg B5 (B5) Medium durch Zugabe von 3,2 g B5 Medium einschließlich Vitamine, 20 g Saccharose, 0,5 g des 2-(N-morpholino) Ethan Sulfonsäure (MES), etwa 800 mL entionisiertem Wasser, und stellen Sie den pH-Wert auf 5,7 mit Kalilauge (KOH). Hinzufügen mehr deionisiertes Wasser bringen das Gesamtvolumen auf 1 L. hinzufügen 8 g Phytoagar und Autoklaven für 15 min bei 121 ° C.
  2. Lassen Sie das Medium bis zu 55 ° C abkühlen und gießen 20 – 25 mL des Mediums B5 in einer Petrischale (9 cm im Durchmesser, 1,5 cm hoch) auf einem sauberen Werkbank. Trocknen Sie Platten für 2 – 3 Tage, Verpacken sie mit sa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Import von Proteinen in Chloroplasten kann untersucht werden, mit zwei Ansätzen: Fluoreszenz-Mikroskopie und Immunoblot Analyse nach der SDS-PAGE-vermittelten Trennung. Hier verwendeten wir Erythrozyten-Nt:GFP, eine Fusion konstruieren Codierung die 79 N-terminale Aminosäurereste von Erythrozyten enthalten das Transit-Peptid mit GFP verschmolzen. Beim Importieren von Proteinen in Chloroplasten grün fluoreszieren Signale von das Zielprotein Erythrozyten-Nt:GFP sollten mit den roten flu.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir stellten ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten von Arabidopsis Protein Import in Chloroplasten zu studieren. Diese Methode ist für die Untersuchung von Protein-Importvorgang mächtig. Diese einfache und vielseitige Technik eignet sich für die Prüfung, die Angriffe auf die vorgesehene Ladung Proteine Chloroplasten. Mit dieser Methode werden Protoplasten von Blatt Gewebe von Arabidopsis11,12 zubereitet zu vielen versch.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeiten erfolgten mit den Stützen der Cooperative Research Program für Agrarwissenschaft und Technologie-Entwicklung (Projekt Nr. PJ010953012018), Rural Development Administration und der National Research Foundation (Korea) Zuschuss gefördert durch das Ministerium für Wissenschaft und IKT (Nr. 2016R1E1A1A02922014), Republik Korea.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GAMBORG B5 MEDIUM EINSCHLIESSLICH VITAMINEDuchefa BiochemieG0210.0050
SUCCHAROSEDuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATDuchefa BiochemieM1503.0250
Agar, PulverJUNSEI24440S1201
Mikroporen Chirurgisches Klebeband3M1530-0
Chirurgische Klinge rostfrei Nr.10FEATHERNicht verfügbar
Konisches Röhrchen, 50mlSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Nicht verfügbar
Cellulase ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.Nicht verfügbar
ALBUMIN, RIND (BSA)VWR0332-100G
D-MannitolSIGMAM1902-1KG
CALCIUMCHLORID, DIHYDRATMP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
Siebbecher für CD-1SIGMAS1145
Sieb für CD-1SIGMAS3895
PetrischaleSPL LIFE SCIENCES10090
PasteurpipetteHILGENBERG3150102
LABORZENTRIFUGE / TISCHGERÄTVISION SCIENTIFICVS-5500N
NatriumchloridJUNSEI19015S0350
KaliumchloridSIGMAP3911-1KG
D-GLUCOSE, WASSERFREIBIO BASICGB0219
KaliumhydroxidDUKSAN40
Calciumnitrat-TetrahydratSIGMAC2786-500G
Poly(ethylenglykol)SIGMAP2139-2KG
Magnesiumchlorid-HexahydratSIGMAM2393-500G
Tube 13ml, 100x16mm, PPSARSTEDT55.515
ObjektträgerMARIENFELD1000412
Mikroskop DeckgläserMARIENFELD101030
ZählkammerMARIENFELD650030
Axioplan 2 Bildgebendes MikroskopCarl ZeissNicht verfügbar
Mikroröhrchen 1,5mlSARSTEDT72.690.001
2- MercaptoethanolSIGMAM3148-250ML
Natriumdodecylsulfat (SDS), Proteomics-QualitätVWRM107-500G
TRIS, Ultrareine QualitätVWR0497-5KG
DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnologie-QualitätVWR0281-25G
Bromphenolblau-Natriumsalz ACSVWR0312-50G
GlycerinJUNSEI27210S0350
Living Colors A.v. Monoklonaler Antikörper (JL-8)TAKARA632381
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

Related Articles