Studium der Protein Import in Chloroplasten mit Protoplasten

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Proteine in Protoplasten zum Ausdruck zu bringen, mit PEG-vermittelten Transformationsmethode. Die Methode bietet einfach Ausdruck der interessierenden Proteine und effiziente Untersuchung von Protein-Lokalisierung und der Importvorgang für verschiedenen experimentellen Bedingungen in-vivo.

Zusammenfassung

Die Chloroplasten ist eine wesentliche Organellen, die für verschiedene zelluläre Prozesse in Pflanzen wie Photosynthese und die Produktion von vielen sekundären Pflanzenstoffen und Lipiden ist. Chloroplasten erfordern eine große Zahl von Proteinen für diese verschiedenen physiologischen Prozesse. Über sind 95 % der Chloroplasten Proteine Zellkern codiert und in Chloroplasten aus dem Cytosol importiert nach der Übersetzung auf cytosolische Ribosomen. Somit ist die ordnungsgemäße Einfuhr oder Ausrichtung dieser Kern-codierte Chloroplasten Proteine zu Chloroplasten entscheidend für das reibungslose Funktionieren der Chloroplasten sowie der Pflanzenzelle. Kern-codierte Chloroplasten Proteine enthalten Signalsequenzen für spezifische Ausrichtung auf Chloroplasten. Molekulare Maschinen, die in den Chloroplasten oder Zytosol lokalisiert diese Signale zu erkennen und führen Sie den Importvorgang. Um die Mechanismen der Protein Import oder Ausrichtung auf Chloroplasten in Vivozu untersuchen, haben wir eine schnelle, effiziente Protoplasten basierende Methode zur Analyse von Protein Import in Chloroplasten von Arabidopsis entwickelt. Bei dieser Methode verwenden wir Protoplasten von Blatt Gewebe von Arabidopsisisoliert. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten, um den Mechanismus zu untersuchen, mit dem Proteine in Chloroplasten importiert werden.

Einleitung

Die Chloroplasten ist eines der wichtigsten Organellen in Pflanzen. Eine der Hauptfunktionen der Chloroplasten soll Photosynthese¹durchführen. Chloroplasten führen auch viele andere biochemischen Reaktionen für die Produktion von Fettsäuren, Aminosäuren, Nukleotide und zahlreiche sekundäre Pflanzenstoffe^1,2. Für all diese Reaktionen erfordern Chloroplasten eine große Anzahl von verschiedenen Arten von Proteinen. Das Chloroplast Genom enthält jedoch nur etwa 100 Gene^3,4. Daher müssen Chloroplasten den Großteil ihrer Proteine aus dem Cytosol importiert. In der Tat zeigten die meisten Chloroplasten Proteine nach Übersetzung^4,5,6aus dem Cytosol importiert werden. Pflanzenzellen erfordern spezifische Mechanismen, Proteine aus dem Zytosol in Chloroplasten zu importieren. Doch obwohl diese Protein Import Mechanismen für die letzten Jahrzehnte untersucht wurden, verstehen wir noch nicht voll sie auf molekularer Ebene. Hier bieten wir eine detaillierte Methode für die Vorbereitung von Protoplasten und Gene im Protoplasten exogen zum Ausdruck zu bringen. Diese Methode kann für die Aufklärung der molekularen Mechanismen Protein Import in Chloroplasten im Detail sein.

Protein Import kann mit viele verschiedene Ansätze untersucht werden. Eine der folgenden Methoden beinhaltet die Verwendung von in-vitro- Protein Import System^7,8. Mit diesem Ansatz, in-Vitro-übersetzte Protein Vorstufen sind mit gereinigtem Chloroplasten in Vitroinkubiert und Protein Import von SDS-PAGE gefolgt von western-Blot Analyse analysiert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass jeder Schritt von Protein Import in Chloroplasten im Detail untersucht werden kann. Daher hat diese Methode, die Komponenten der Protein Import molekulare Maschinerie zu definieren und Sequenzinformation für Transit Peptide sezieren verbreitet. In jüngerer Zeit, ein weiterer Ansatz unter Verwendung von Protoplasten von Blatt Gewebe wurde entwickelt und es wurde weithin Protein Import in Chloroplasten^9,10Studium verwendet werden. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass Protoplasten eine zelluläre Umgebung bereitstellen, die näher an der intakten Zellen als die in-Vitro -System ist. Die Protoplasten System ermöglicht so viele zusätzliche Aspekte dieses Prozesses, wie die damit verbundenen cytosolischen Ereignisse und wie die Spezifität des Zielens Signale bestimmt wird. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten Protein Import in Chloroplasten zu studieren.

Protokoll

1. Wachstum von Arabidopsis-Pflanzen

1. Bereiten Sie 1 L Gamborg B5 (B5) Medium durch Zugabe von 3,2 g B5 Medium einschließlich Vitamine, 20 g Saccharose, 0,5 g des 2-(N-morpholino) Ethan Sulfonsäure (MES), etwa 800 mL entionisiertem Wasser, und stellen Sie den pH-Wert auf 5,7 mit Kalilauge (KOH). Hinzufügen mehr deionisiertes Wasser bringen das Gesamtvolumen auf 1 L. hinzufügen 8 g Phytoagar und Autoklaven für 15 min bei 121 ° C.
2. Lassen Sie das Medium bis zu 55 ° C abkühlen und gießen 20 – 25 mL des Mediums B5 in einer Petrischale (9 cm im Durchmesser, 1,5 cm hoch) auf einem sauberen Werkbank. Trocknen Sie Platten für 2 – 3 Tage, Verpacken sie mit sauber wickeln und bis zum Gebrauch im Kühlschrank aufbewahren.
3. Sterilisieren von Arabidopsis Thaliana Samen mit 1 mL 70 % (V/V) Ethanol in ein Zentrifugenröhrchen (e-Rohr) durch ständig Schütteln für 2 – 3 min. Überstand zu entfernen, fügen Sie 1 mL Natriumhypochlorit-Lösung 1 % (V/V) und schütteln Sie kontinuierlich für 2 – 3 min. 100 vorbereiten – 150 Samen pro Petrischale.
   1. Entfernen Sie die Überstände und waschen Sie die Samen mit 1 mL destilliertem Wasser. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 X. Legen Sie die sterilisierten Samen bei 4 ° C für 3 Tage, um die Keimung der Samen zu synchronisieren.
4. 100 – 150 säen auf B5 Teller mit einer Mikropipette und Dichtplatte mit chirurgischen Klebeband.
5. Wachsen Sie Pflanzen im Wachstum Raum mit einem 16 h/8 h-hell/dunkel-Zyklus bei 100 µmol·m^-2·s^-1 Lichtstärke, 70 % Relative Luftfeuchtigkeit und Temperatur von 20 ° C für 2 Wochen.

2. Vorbereitung des Plasmids

Hinweis: Hochreines Plasmide sollte für die Transformation verwendet werden; die Verwendung eines kommerziellen Plasmid-Reinigung-Kit wird empfohlen.

1. Reinigen Sie das Plasmid (Erythrozyten-Nt:GFP) mit einem DNA-Isolierung-Kit. Um DNA zu konzentrieren, Ethanol Niederschlag in einem 1,5 mL Röhrchen durchführen und das DNA-Pellet in 100 µL destilliertes Wasser auflösen. Bestimmen die Konzentration des Plasmids mit einem Spektralphotometer bei 260 nm. Verdünnen Sie das Plasmid, eine Endkonzentration von ~ 2 µg / µL. halten Sie das Plasmid bei-20 ° C bis zur Verwendung.

3. Isolation von Protoplasten

1. Bereiten Sie die folgenden Lösungen.
   1. Bereiten Sie die Enzymlösung enthält 0,25 % (w/V) Macerozyme, 1,0 % (w/V) Cellulase, 400 mM D-Mannit, 8 mM-Kalzium-Chlorid (CaCl₂), 0,1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA), und 5 mM MES. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,6 mit KOH.
      1. Filtern der Enzymlösung mit eine Cellulose-Acetat-Filter-Einheit mit einer Porengröße von 0,45 µm. Aliquoten 25 mL Enzymlösung in 50 mL konische Röhrchen und halten bei-20 ° C. Tauen Sie das Enzymlösung bei Raumtemperatur (RT) und mischen Sie gut kurz vor dem Einsatz.
   2. Bereiten Sie eine Zuckerlösung 21 % (w/V) durch Auflösen von 21 g Saccharose in 100 mL entionisiertem Wasser und Autoklaven die Lösung.
   3. Bereiten Sie W5 Lösung 154 mM Natriumchlorid (NaCl), 125 mM CaCl₂, 5 mM Kaliumchlorid (KCl), 5 mM Glukose und 1,5 mM MES enthalten. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,6 mit KOH und Autoklaven die Lösung.
   4. Bereiten Sie MaMg Mappe für 400 mM D-Mannit, 15 mM Magnesiumchlorid MgCl₂, und 5 mM MES. Stellen Sie den pH-Wert auf 5,6 mit KOH und Autoklaven die Lösung.
   5. Bereiten Sie 1 M D-Mannit und 1 M Calciumnitrat Stammlösungen der PEG-Lösung machen. Autoklaven dieser Lösungen.
2. Ernte intakt Blatt Gewebe aus 2 Wochen alten Pflanzen aus ~ 1 – 2 B5 Plättchen mit einem chirurgischen Messer und Ort der geernteten Blätter in ein 50 mL konische Rohr mit 25 mL der Enzymlösung. Legen Sie das konische Rohr, enthält das Enzym Lösung und Blatt Gewebe horizontal auf einem Dreh Shaker mit sanften Agitation im Dunkeln. Es dauert 8 – 12 h für eine vollständige Verdauung Blatt Gewebe.
3. Gießen Sie nach 8 – 12 h nach der Inkubation die Enzymlösung (mit Protoplasten Blatt Gewebe befreit) in eine frische Petrischale durch ein Gitter mit 140 µm Porengröße. Sorgfältig Schicht der Protoplasten-haltigen Enzymlösung auf 15 mL Zuckerlösung 21 % (w/V) und 98 X g für 10 min mit den niedrigsten Beschleunigungs- und Verzögerungswerte Einstellungen in ein Schwingen-Eimer-Rotor zentrifugieren.
4. Mit einer Pasteurpipette, sorgfältig die Protoplasten aus der obersten Schicht (Enzymlösung) und an der Schnittstelle zwischen der Enzymlösung und Saccharoselösung zum Übertragen einer 50 mL konische Röhrchen mit 30 mL W5-Lösung Zentrifugieren Sie dieses Rohr 51 X g für 6 min. In diesem Stadium werden die Kugel am unteren Ende der konischen Röhre Protoplasten.
5. Den Überstand vorsichtig mit einer Pipette ohne zu stören die Protoplasten Pellet zu verwerfen. 25 mL W5-Lösung hinzu, und sanft Aufschwemmen der Protoplasten. Inkubieren Sie die Protoplasten Lösung im Kühlschrank für mindestens 1 h zur Stabilisierung 4 ° C.

4. Protoplasten Transformation mit Polyethylenglykol

1. Bereiten Sie eine 40 % PEG Lösung durch Zugabe von 4 g von PEG 8000, 4 mL 1 M Mannit-Lösung, 1 mL 1 M Ca (NO₃)₂und 1,8 mL destilliertem Wasser in ein 50 mL konische Röhrchen und gut mischen. Auflösen von PEG durch Erhitzen in der Mikrowelle für 20-30 S. Platz 40 % PEG-Lösung bei RT für Abkühlung.
   Hinweis: Die 40 % PEG-Lösung sollte jedes Mal frisch bereit sein. Wenn Protoplasten während der Inkubation 4 ° C im Kühlschrank nicht vollständig oelletiert sind, Zentrifugieren Sie das Material bei 46 X g für 2 min.
2. Entfernen des Überstands sorgfältig aber vollständig und MaMg Lösung in Protoplasten Pellet um die Konzentration von 5 x 10⁶/mL zu erzielen.
   Hinweis: Die Anzahl der Protoplasten kann durch eine Hemocytometer unter dem Mikroskop betrachtet bestimmt werden.
3. Platz 10 µg von Plasmid DNA jedes leere 13 mL Rundboden Röhrchen und fügen Sie 300 µL der Protoplasten-Lösung mit einer Pipette.
   Hinweis: Zum Jahresende die Pipettenspitze sollte abgeschnitten werden. Wenn Protoplasten abgetastet werden, sollte die Protoplasten-haltige Lösung Nukleinsäuretablette werden vor dem Pipettieren, so dass die gleiche Anzahl von Protoplasten jedes Rohr hinzugefügt wird.
4. Mischen Sie das Plasmid DNA mit Protoplasten durch leichtes Drehen der Rohre und sofort 300 µL 40 % PEG-Lösung mit einer Pipette. Mischen Sie sanft, aber vollständig durch Drehen der Röhren und 30 min bei Raumtemperatur inkubieren; Kippen Sie die Röhre fast horizontal und drehen Sie ihn mehrmals.
5. 1 mL der Lösung W5 und mischen Sie sanft aber vollständig durch das Rohr von Hand in ähnlicher Weise drehen. Inkubieren Sie die Probe für 10 min bei Raumtemperatur.
6. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei Mal mehr mit 1,5 mL und 2 mL der W5-Lösung, beziehungsweise. 30 min nach der letzten Zugabe von W5 Lösung inkubieren.
7. Zentrifugieren bei 46 X g für 4 min. überstand verwerfen und 2 mL der W5-Lösung. Mischen Sie sanft, aber vollständig. Bei 22 ° C in einer dunklen Kammer inkubieren.

5. Analyse des Proteins Imports in Chloroplasten

Hinweis: Nach der PEG-vermittelten Transformation von Protoplasten reicht Inkubationszeit von 8 bis 24 h.

1. Fluoreszenz-Mikroskopie
   1. Platz 10 µL der Protoplasten-Lösung auf eine Folie Glas mit einer Pipette mit einer gestutzten Spitze und sorgfältig mit einem Deckgläschen zur Vermeidung von Schäden der Protoplasten abdecken.
   2. Ort der Folie auf der Bühne ein Fluoreszenzmikroskop ausgestattet mit Erregung/Emission Filter setzt grün fluoreszierendes Protein (GFP) und Auto-Chlorophyllfluoreszenz zu beobachten.
   3. Die Aufnahmen Sie mit einem gekühlten kostenlos – gekoppelt (CCD) Kamera und Prozess Gerätebilder mit einem Bildbearbeitungs-Software, um Pseudo-Farbbilder zu produzieren.
2. Gesamt-Protein Extraktion und Immunoblotting
   1. Bereiten Sie Denaturierung Puffer mit 2,5 % (w/V) Natrium Dodecylsulfate (SDS) und 2 % (V/V) 2-Mercaptoethanol vor.
      Hinweis: Protein Import in Chloroplasten kann durch Messung des Grades der Transit Peptid Verarbeitung über Immunoblot Analyse mit Anti-GFP Antikörper quantifiziert werden.
   2. Übertragen Sie Protoplasten in einem Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 46 X g für 4 min.
   3. Entfernen des Überstands und 80 µL Denaturierung Puffer. Kräftig vortexen 5 s und 5 x SDS-Probenpuffer (250 mM Tris-Cl (pH 6,8), 0,5 M DVB-t, 10 % (w/V) SDS, 0,05 % (w/V) Bromophenol blau und 50 % (V/V) Glycerin) hinzufügen. Gut mischen und 10 min. kochen.
   4. Vorbehaltlich dieser Protein-Probe standard SDS-PAGE und Immunoblotting mit Anti-GFP Antikörper.

Ergebnisse

Der Import von Proteinen in Chloroplasten kann untersucht werden, mit zwei Ansätzen: Fluoreszenz-Mikroskopie und Immunoblot Analyse nach der SDS-PAGE-vermittelten Trennung. Hier verwendeten wir Erythrozyten-Nt:GFP, eine Fusion konstruieren Codierung die 79 N-terminale Aminosäurereste von Erythrozyten enthalten das Transit-Peptid mit GFP verschmolzen. Beim Importieren von Proteinen in Chloroplasten grün fluoreszieren Signale von das Zielprotein Erythrozyten-Nt:GFP sollten mit den roten flu...

Diskussion

Wir stellten ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von Protoplasten von Arabidopsis Protein Import in Chloroplasten zu studieren. Diese Methode ist für die Untersuchung von Protein-Importvorgang mächtig. Diese einfache und vielseitige Technik eignet sich für die Prüfung, die Angriffe auf die vorgesehene Ladung Proteine Chloroplasten. Mit dieser Methode werden Protoplasten von Blatt Gewebe von Arabidopsis^11,12 zubereitet zu vielen versch...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
GAMBORG B5 MEDIUM EINSCHLIESSLICH VITAMINE	Duchefa Biochemie	G0210.0050
SUCCHAROSE	Duchefa Biochemie	S0809.5000
MES MONOHYDRAT	Duchefa Biochemie	M1503.0250
Agar, Pulver	JUNSEI	24440S1201
Mikroporen Chirurgisches Klebeband	3M	1530-0
Chirurgische Klinge rostfrei Nr.10	FEATHER	Nicht verfügbar
Konisches Röhrchen, 50ml	SPL LIFE SCIENCES	50050
Macerozyme R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	Nicht verfügbar
Cellulase ONOZUKA R-10	YAKULT PHARMACEUTICAL IND.	Nicht verfügbar
ALBUMIN, RIND (BSA)VWR		0332-100G
D-Mannitol	SIGMA	M1902-1KG
CALCIUMCHLORID, DIHYDRAT	MP BIOMEDICALS	0219463505-5KG
Twister	VISION SCIENTIFIC	VS-96TW
Siebbecher für CD-1	SIGMA	S1145
Sieb für CD-1	SIGMA	S3895
Petrischale	SPL LIFE SCIENCES	10090
Pasteurpipette	HILGENBERG	3150102
LABORZENTRIFUGE / TISCHGERÄT	VISION SCIENTIFIC	VS-5500N
Natriumchlorid	JUNSEI	19015S0350
Kaliumchlorid	SIGMA	P3911-1KG
D-GLUCOSE, WASSERFREI	BIO BASIC	GB0219
Kaliumhydroxid	DUKSAN	40
Calciumnitrat-Tetrahydrat	SIGMA	C2786-500G
Poly(ethylenglykol)	SIGMA	P2139-2KG
Magnesiumchlorid-Hexahydrat	SIGMA	M2393-500G
Tube 13ml, 100x16mm, PP	SARSTEDT	55.515
Objektträger	MARIENFELD	1000412
Mikroskop Deckgläser	MARIENFELD	101030
Zählkammer	MARIENFELD	650030
Axioplan 2 Bildgebendes Mikroskop	Carl Zeiss	Nicht verfügbar
Mikroröhrchen 1,5ml	SARSTEDT	72.690.001
2- Mercaptoethanol	SIGMA	M3148-250ML
Natriumdodecylsulfat (SDS), Proteomics-Qualität	VWR	M107-500G
TRIS, Ultrareine Qualität	VWR	0497-5KG
DTT (DL-Dithiothreitol), Biotechnologie-Qualität	VWR	0281-25G
Bromphenolblau-Natriumsalz ACS	VWR	0312-50G
Glycerin	JUNSEI	27210S0350
Living Colors A.v. Monoklonaler Antikörper (JL-8)	TAKARA	632381